A Novel Reporter RFP para ajudar na visualização do Disco Imaginal Eye em Drosophila

A nova linhagem transgênica de Drosophila com repórter IRFP expressa a proteína fluorescente vermelha ou RFP em células específicas do disco imaginal I. Essa linhagem transgênica pode auxiliar na identificação, dissecação e marcação de tipos celulares específicos no olho em desenvolvimento. Para dissecar o disco imaginal do olho, larvas de terceiro estágio em fase de erradiação são removidas do lado de um frasco usando uma espátula.

As larvas são então colocadas em uma gota de PBS em uma placa de guarda. As partes bucais com os discos oculares anexos são removidas do restante da larva usando pinças; os discos oculares são então transferidos para uma lâmina, onde são dissecados separando-os das partes bucais e do cérebro. Olá, sou Amna Cole do laboratório de Joseph Bateman no Centro Wolfson para Doenças Relacionadas à Idade, King's College London.

Hoje vamos mostrar um procedimento para dissecar discos imaginais dos olhos de Drosophila. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os genes envolvidos na neurogênese. Então, vamos começar.

Para começar a dissecar discos imaginais dos olhos, coloque uma gota de PBS em uma placa de Petri revestida com Sylgard. Sob um microscópio estereoscópico, o revestimento de Sylgard ajudará a proteger as pinças contra danos durante a dissecação. Em seguida, usando uma espátula, pegue uma larva de terceiro estágio em fase de errantismo e coloque-a na gota de PBS. Com uma pinça em cada mão, segure a larva a dois terços do caminho em direção à extremidade posterior com um par de pinças. Agora, use o outro par de pinças para segurar as peças bucais de cor escura na extremidade anterior da larva.

Puxe suavemente a larva separando as pinças uma da outra. As partes bucais devem se soltar do restante do corpo com o complexo olho-cérebro aderido. Em seguida, coloque uma gota de PBS sobre uma lâmina e transfira os discos para a gota de PBS segurando as partes bucais.

Agora mude para o modo de fluorescência no microscópio estereoscópico, pois apenas os discos imaginais do olho expressam RFP; eles podem ser facilmente identificados como tecido fluorescente vermelho sobrepondo os lóbulos ópticos esféricos, aumentando o contraste dos discos. Direcione a fonte de luz fria de fibra óptica em um ângulo oblíquo em relação à lâmina. Os discos imaginais do olho estão ligados aos lóbulos ópticos pelo pedúnculo óptico na região posterior e às peças bucais por um pedúnculo proveniente do disco da antena na região anterior.

Para dissecar os discos imaginais dos olhos, segure as partes usando um par de pinças e utilize o outro par para separar os discos imaginais dos olhos do cérebro larval. Em seguida, separe os discos imaginais dos olhos das peças bucais. Uma vez que as peças bucais tenham sido separadas dos discos imaginais dos olhos, remova-as da lâmina.

Os discos imaginais dos olhos devem agora estar planos sobre a lâmina e livres de qualquer tecido estranho, incluindo tecido cerebral. Continue a dissecar os demais discos imaginais. Após todos os discos imaginais dos olhos terem sido dissecados, incline suavemente a lâmina e use um pequeno pedaço de papel-toalha para remover o excesso de PBS.

Agora, adicione uma gota de meio de montagem vector shield e coloque suavemente uma lamínula por cima. Os discos estão prontos para serem analisados por microscopia de fluorescência em epifluorescência ou microscopia confocal. Se a análise for realizada posteriormente, armazene a lâmina a quatro graus Celsius.

O RFP permanecerá visível por pelo menos um ano durante a aquisição de imagens da série Z, que devem ser obtidas em um microscópio confocal ou Zeiss aome com espaçamento de um micrômetro, utilizando uma objetiva de 20 x ou 40 x; em seguida, podem ser geradas imagens projetadas com o software do microscópio. Discos imaginais de moscas que expressam IRFP foram dissecados e corados com Phin. Em seguida, a microscopia foi realizada em um microscópio zes aome com espaçamento de um micrômetro, utilizando uma objetiva de 20 x. As células do disco ocular, que expressam RFP, são mostradas em vermelho.

A sulco morfogenético é visualizado por foid e coloração e é mostrado em verde. Os polos dorsal e ventral do disco ocular são curvos e tendem a dobrar. Essas seções podem ser omitidas da imagem final de projeção.

Embora o disco seja um epitélio em monocamada, as posições variáveis dos núcleos exigem uma projeção em série Z para se obter uma visão geral do disco. Como o repórter IRFP está localizado no núcleo, o padrão observado aqui representa a expressão nuclear de RFP. Acabamos de mostrar como realizar o procedimento para dissecar discos oculares vaginais de drosófila.

Ao utilizar este procedimento, é melhor que você use uma pinça fina e provavelmente é aconselhável evitar o café também. Obrigado por assistir e boa sorte em todos os seus experimentos.