Pintinho Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM Ensaio: como ele realmente funciona

Olá, sou Susan Paa. Eu sou do Instituto de Química Fisiológica, departamento de Endocrinologia Bioquímica da Universidade de Burg Esen, na Alemanha. Olá, sou Daniel Ze Basian Dole.

Eu sou da mesma instituição que Susan. Olá, sou Mann, do Instituto de Anatomia, Departamento de Neuro da Universidade de Burg. Vamos mostrar como a cultura CH X e o ensaio de membrana co realmente funcionam.

Então, vamos para o laboratório. Na maioria dos estudos experimentais recentes, o came que é a membrana de Chico, foi exposto cortando uma janela através da casca do ovo, e experimentos foram realizados in ovo, resultando em limitações significativas na acessibilidade do CAM e nas possibilidades de observação e documentação fotográfica dos efeitos. As culturas X ovo de embriões de galinha facilitam significativamente a acessibilidade do cam e do embrião de galinha.

Por favor, veja o coração batendo permitindo fácil documentação in vivo dos efeitos e manipulação experimental do embrião. Em nosso artigo em vídeo, forneceremos uma demonstração passo a passo da aplicação bem-sucedida da cultura X ovo para um grande número de questões científicas. Os ovos são incubados em uma incubadora com uma bandeja móvel.

Aqui você pode ver o elemento de aquecimento e o movimentador da bandeja girando os ovos 12 vezes ao dia continuamente. A umidade é mantida em 60% adicionando água a recipientes plásticos no fundo da incubadora, e a temperatura de incubação é ajustada em 37,5 graus centígrados antes de iniciar a incubação. Sujeira, penas e excrementos são cuidadosamente removidos das cascas dos ovos, limpando mecanicamente os ovos com etanol ou desinfetante, no entanto, reduzem significativamente as taxas de sobrevivência dos embriões.

Os ovos são posicionados horizontalmente na bandeja móvel da incubadora. Certifique-se de manter distância suficiente entre os ovos individuais para permitir a rotação livre. Após a incubação Por 72 horas, os ovos são removidos da incubadora e a parte superior dos ovos onde o embrião reside é marcada a lápis.

Uma vez que o embrião resiste à rotação até certo ponto e permanece localizado aqui Para uma melhor sensação, Nenhuma luva deve ser usada para quebrar os ovos, mas as mãos devem ser desinfetadas com etanol 70%. O ovo é mantido horizontalmente com uma marca de lápis na parte superior e rachado na borda de uma barra de agitação magnética triangular Para controle máximo de força durante os procedimentos de rachadura, os cotovelos não devem descansar na bancada. É importante que a casca do ovo, bem como a membrana do ovo, sejam abertas durante rachaduras, o vazamento da clara do ovo é um sinal seguro de que a membrana do ovo foi perfurada.

O ovo é mantido próximo ao fundo do prato patriota. Para evitar mais vazamento de clara de ovo durante este procedimento inicial de abertura, é importante que a clara de ovo no fundo do prato patriota ainda esteja conectada ao resto dentro do ovo. Como isso resulta em um vácuo dentro do ovo mantendo a gema no lugar, aplicando suavemente pressão no meridiano que atravessa a rachadura e o equador do ovo com os dedos polegar e médio, é possível regular o vácuo e a extrusão do conteúdo do ovo.

O conteúdo do ovo pode então ser transferido para a placa de Petri com a gema intacta. Se o ovo for levantado suavemente e ambas as metades da casca forem cuidadosamente separadas, As culturas ex ovo São então colocadas em uma bandeja, devolvidas a uma incubadora e mantidas a 37,5 a 38,2 graus centígrados e 70% de umidade. Não é necessário um suprimento de dióxido de carbono ou oxigênio.

Se forem usados pratos patriotas especiais com espaçadores entre a tampa e o prato e incubadoras com grade de ventilação, a grade de ventilação deve ser mantida meio aberta. Os papéis de filtro de autoclave são usados como material de suporte para substâncias líquidas aplicadas ao came, pois parecem causar a menor irritação do came. O local de aplicação deve estar a meio caminho entre o embrião e a borda do came, caso contrário, o embrião dificulta a observação microscópica dos efeitos na luz transmitida.

O líquido aqui atropin deve ser aplicado imediatamente após o filtro ter sido colocado no came para evitar a secagem. Doses adicionais ou tampão devem ser reaplicadas todos os dias. Quando o came está totalmente desenvolvido, até seis amostras diferentes podem ser aplicadas e os efeitos podem ser comparados em um único came, anéis cortados A partir de uma ponta de pipeta de um mililitro, deve ser cortada o mais fina possível para minimizar o peso e evitar o recuo do came.

O anel é então aplicado ao came e as células são pipetadas no anel. Uma seringa Hamilton Microlitro é enxaguada várias vezes com etanol a 70% e, finalmente, com solução salina tamponada com fosfato estéril ou PBS, a micro seringa é preenchida com uma suspensão celular preparada com cuidado, mas penetre rapidamente no came e nas camadas oculares com a agulha da seringa e injete continuamente a suspensão celular. A agulha deve permanecer alguns segundos no olho para evitar a perda da suspensão celular injetada Por verificação de vazamento X Ovo.

Culturas de ovos incubadas por três dias são usadas como doadores de gemas de membros. O embrião é dissecado dos vasos vitelinos. Ao cortar um círculo, O embrião é transferido para uma placa de Petri cheia de PBS estéril frio por meio de uma pequena colher de drenagem e lavado por agitação.

O embrião é então transferido para uma placa de Petri fresca cheia de PBS estéril e liberado das membranas circundantes, rasgando-as cuidadosamente com uma pinça fina. Os botões dos membros são destacados por uma pinça o mais próximo possível do corpo, agarrados e transferidos para a câmera de uma galinha hospedeira de oito a 10 dias de idade. No local de aplicação desejado, o came é seletivamente traumatizado por raspagem suave com um pedaço da pinça.

Em seguida, o enxerto é agarrado e colocado em camadas no came com o outro pedaço da pinça. O rato fêmea de sacrifício é fixado em um tabuleiro. A parede abdominal é umedecida com etanol 70% cortado ao longo da linha média e os retalhos cutâneos são fixados lateralmente por pinos.

O útero é removido do abdômen, destacado e transferido para um copo. Com PBS frio. As membranas embrionárias são removidas cuidadosamente com o uso de pinças para fins de demonstração.

Um embrião de camundongo de 16 dias é mostrado aqui para melhor visibilidade dos botões dos membros. Os melhores resultados de enxerto são obtidos apenas. No entanto, se forem usados brotos de membros de embriões de 10 a 13 dias, os brotos dos membros são cortados ou o uso de pinças finas o mais próximo possível do corpo.

No local de aplicação desejado, o CAM é seletivamente traumatizado por raspagem suave com fórceps. Em seguida, os botões dos membros são agarrados e transferidos para o CAM de uma galinha hospedeira de oito a 10 dias. O enxerto é colocado uma ou duas vezes em um lado do came onde nenhum enxerto final se destina a remover o excesso de PBS.

Os enxertos são idealmente colocados no came perto de uma bifurcação em Y de um tumor de vaso sanguíneo. As biópsias são cortadas em pedaços de um a dois milímetros cúbicos por bisturis estéreis. A retirada de material da superfície da biópsia aumenta o risco de contaminação com músculo ou tecido conjuntivo.

No local de aplicação desejado, o CAM é seletivamente traumatizado por raspagem suave. Um pedaço do núcleo da amostra de biópsia é enxertado no CAM de uma galinha hospedeira de oito a 10 dias de idade. Os enxertos são idealmente colocados no came perto de uma bifurcação em Y de um vaso sanguíneo.

O enxerto é então transferido para o CAM com o mínimo de PBS anexado. Uma leve pressão pode ser aplicada para manobrar o enxerto em um recuo resultante do came. O embrião de pintinho hospedeiro é morto por decapitação.

O CAM com o enxerto anexado é removido por um corte circular e transferido para uma placa de Petri preenchida com PBS. O CAM excessivo é cortado do enxerto, exceto no local de fixação anterior. Novamente no local de aplicação desejado.

O came de um novo embrião de pintinho hospedeiro é seletivamente traumatizado por raspagem suave e o enxerto é transferido para o came do segundo hospedeiro com o mínimo de PBS anexado. Acabamos de demonstrar como o CH X ou a cultura realmente funcionam. Mostrei as vantagens em comparação com os experimentos Orval e dei alguns exemplos para sua aplicação.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.