Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

Este vídeo explica como realizar microscopia eletrônica de transmissão, também conhecida como MET, no cartilagem embrionária de drosophila. O coração surgiu como um sistema modelo valioso para o estudo da migração celular, adesão célula-célula e mudanças na forma celular. Esta técnica permite a visualização da forma do lúmen cardíaco, bem como componentes ultraestruturais como membranas celulares, junções célula-célula e membrana basal.

Para iniciar este procedimento, prepara-se uma solução de fixação apropriada para microscopia eletrônica de transmissão de embriões de drosófila. Em seguida, uma coleta de embriões revestidos com idade entre zero e 20 horas é colocada na solução de fixação. Após a conclusão, os embriões são removidos da solução de fixação e manipulados enquanto presos a fita adesiva dupla face.

Em uma placa de Petri contendo tampão, embriões desionizados flutuam no tampão e são recuperados com uma pipeta. Em seguida, os embriões são pós-fixados e passam por um gradiente de desidratação. Uma vez infiltrados com resina, são transferidos para um molde de inclusão onde são alinhados.

O bloco resultante é cortado com uma lâmina de diamante. As seções são coletadas em grades de cobre, coradas e examinadas. Olá, sou Nadine Lop do laboratório de Sunita Kramer do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade de Medicina e Odontologia de Nova Jersey na Escola de Medicina Robert Wood Johnson.

Sou Raj Patel. Sou o microscopista eletrônico, também do PON patologia. Hoje vamos mostrar um procedimento para preparar e imaginar embriões de oph para microscopia eletrônica de transmissão.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a morfogênese cardíaca de Drosophila. Então, vamos começar. Começar.

Antes de manipular os embriões de drosófila, prepare imediatamente a solução fixadora para o método de fixação de embriões com permeabilização por heptano. Em uma capela, pipete dois mililitros de uma solução recém-preparada contendo 12,5% de glutaraldeído em tampão Cate para um frasco de vidro para cintilação. Adicione oito mililitros de heptano ADA e agite vigorosamente.

Em seguida, aguarde um minuto. Deixe as duas fases separarem-se; a fase superior contém a ADA heptano, saturada com glutaraldeído, que é a solução fixadora. Pipete a fase superior para um frasco limpo e reserve. Para coletar embriões de zero a 20 horas, utilize uma câmara de coleta de embriões, que é um pequeno cesto com um inserto removível em malha.

Inicie removendo a placa de suco de uva contendo os embriões e retire todas as moscas mortas. Em seguida, utilizando água e um pincel, solte os embriões da placa de suco de uva e transfira os embriões para a câmara de coleta de embriões usando uma garrafa quadrada contendo água.

Lave os embriões para remover qualquer excesso de levedura do meio de suco de uva. Remova a membrana coriônica externa mergulhando os embriões em uma solução de hipoclorito a 50% por dois a três minutos ou até que os embriões flutuem à superfície. Enxágue abundantemente com água destilada e coloque os embriões sobre uma toalha de papel.

Usando pinças, pegue o inserto de malha, que agora deverá estar coberto com embriões revestidos. Coloque o inserto no fixador, permitindo que os embriões caiam da malha. Deixe os embriões em fixação por uma hora e meia a quatro graus Celsius, sob agitação em um agitador orbital.

Após a conclusão da incubação, coloque os embriões em uma placa de Petri forrada com fita adesiva dupla face, levando o mínimo possível do fixador. Agite a placa para distribuir os embriões em uma única camada e, em seguida, coloque-a na câmara de segurança química para permitir que o heptano evapore. Uma vez que os embriões estejam secos, cubra-os com tampão contendo 0,1% de tween hand de vize.

Embrulhos em estágio tardio 16 sob um microscópio estereoscópico com uma agulha de tungstênio romba. Embrulhos que foram fixados flutuam e podem ser recuperados com uma pipeta de Pasteur; transfira os embrulhos para um tubo microcêntrifugo de 1,5 mililitro. Lave os embrulhos em tampão de cacodilato 0,1 molar e, em seguida, pós-fixe em tetróxido de ósmio a 1% por uma hora à temperatura ambiente.

Após a incubação, lave os embriões com tampão Cate. Novamente, desidrate os embriões em uma série crescente de etanol e acetona. Inicie com etanol 50% por 10 minutos, seguido por etanol 70% por 10 minutos, depois desidrate em acetona 90% por 10 minutos e, finalmente, em etapas de acetona 100% de 10 minutos cada.

Remova a acetona. Inicie o processo de infiltração adicionando uma mistura um para um de resina ein spray e acetona. Certifique-se de que a amostra esteja sob pressão de vácuo e aqueça no micro-ondas por três minutos.

Mantenha a pressão de vácuo por mais cinco minutos. Substitua a mistura de resina e acetona por resina a 100% e aqueça novamente em forno de micro-ondas sob pressão de vácuo. Substitua a resina e aqueça em micro-ondas sob pressão.

Um tempo final, perfazendo um total de três etapas de infiltração. Transfira os embriões do tubo microcêntrifugo para um molde de inclusão de silicone. Alinhe os embriões em uma fileira de modo que a extremidade posterior do embrião fique alinhada com a borda afilada do molde.

O bacon é colocado em forno a 70 graus Celsius durante a noite. Em seguida, remova o bloco resultante para o corte em seções. Use um micrótomo para cortar seções de um micrômetro nos embriões.

Uma vez que o bloco tenha sido seccionado e o embrião tenha sido alcançado, use um laço para transferir uma única seção para uma lâmina de vidro para determinar se a profundidade adequada para visualização do coração foi alcançada antes da observação. Aqueça brevemente a seção em uma placa aquecedora e cora a seção com azul de metileno, adicionando primeiro uma gota à lâmina e, em seguida, aquecendo brevemente.

Novamente, lave com água desionizada e examine a seção ao microscópio na profundidade desejada de corte. A luz do coração deve ser reconhecível ao microscópio óptico para atender às limitações de espaço. Remodele o bloco para incluir no máximo cinco embriões em corte transversal que mostrem o coração embrionário.

Corte seções de 90 nanômetros usando o micrótomo. Recolha múltiplas seções em uma grade de cobre. Incube a grade com acetato de uranila a 3% durante 10 minutos, depois enxágue três vezes com água destilada.

Agora, contra-estaine a grade com citrato de chumbo por dois minutos e meio em uma câmara contendo pelotas de hidróxido de sódio para criar um ambiente livre de dióxido de carbono. Após a incubação, lave três vezes com água destilada. Examine as seções com um microscópio eletrônico a 80 quilovolts e fotografe com uma câmera CCD.

Para determinar se a profundidade do corte e o estadiamento foram adequadamente realizados, deve ser evidente a formação de uma luz cardíaca madura entre os dois cardioblastos da linha média dorsal; para verificar se as membranas celulares estão íntegras, examine a luz cardíaca quanto à presença de matriz extracelular e procure identificar corpúsculos de Christie e mitocôndrias. Assim, acabamos de mostrar como determinar a ultraestrutura do coração embrionário de drosófila. Ao realizar este procedimento.

É importante lembrar de posicionar corretamente os embriões de drosófila e medir com precisão os componentes da resina, misturando-os bem. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.