Name: Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-21T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a preparar embriões de Drosophila para microscopia eletrônica de transmissão, visualizando o lúmen cardíaco e membrana basal. Este protocolo detalhado permite estudar a morfogênese cardíaca com alta resolução.

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Nosso trabalho na formação do tubo coração foi assistido por um National Science Foundation Grant (ID Award 0744165) para SGK

<ol><li> Recém preparar 2ml de uma solução fixadora contendo glutaraldeído 12,5% em tampão cacodilato de 50 mM (pH7.4) em um frasco de cintilação 20 ml de vidro. Adicionar 8ml de n-heptano e agitar vigorosamente. Permitir que as duas fases distintas. Remover fase superior contendo n-heptano saturado com glutaraldeído, coloque em um frasco de cintilação limpo e reserve. Esta será a solução fixadora. </li><li> Coletar embriões 00-20 horas utilizando uma câmara de colheita de embriões, que é uma pequena cesta com uma inserção de malha removível. Remover a membrana cório exterior por imersão embriões em uma solução de água sanitária 50% por 2-3 minutos, ou até embriões flutuar à superfície da água sanitária. Lavar cuidadosamente com ddH20 blot e embriões em uma toalha de papel. </li><li> Utilizando uma pinça, pegar inserção de rede que é coberta com embriões dechorionated e coloque na solução de fixador, permitindo que os embriões a cair a partir da malha. Permitir que embriões para correção para 1,5 horas a 4 ° C, enquanto a mistura em um Nutator. </li><li> Prepare uma placa de Petri forrada com fita dupla face. Remover embriões a partir do fixador com uma pipeta Pasteur e colocá-los sobre a superfície gravada de Petri dish.Transfer os embriões em uma quantidade mínima de solução fixadora para evitar que o heptano no fixador de dissolver a cola da fita. Agite a placa de Petri para fazer uma única camada de embriões. Coloque placa de Petri na capa até que evapora heptano. Adicione o suficiente PBS Tween20 + 0,1% para cobrir os embriões. Mão-devitellinize fase tardia 16 embriões em um microscópio de dissecação com uma agulha de tungstênio sem corte. Recuperar embriões com uma pipeta Pasteur para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Passos 5-7 são realizadas neste tubo de microcentrífuga. </li><li> Enxágüe embriões em 0,1 M cacodilato, pH 7,4 e, em seguida, pós-fix em uma solução contendo tetróxido de ósmio 1% em 0,1 M cacodilato tampão, pH 7,4 por 1 hora à temperatura ambiente. Enxágüe embriões com 0,1 M cacodilato, pH 7,4. </li><li> Desidratar embriões em uma série gradual de etanol e acetona. Desidratar embriões com etanol 50% por 10 minutos, seguido de etanol 70% por 10 minutos. Em seguida, desidratar em acetona 90% por 10 minutos, e dois passos de 100% de acetona de 10 minutos cada. </li><li> Remover acetona e então começar o processo de infiltração, adicionando uma resina Epon 01:01-Spurr: mistura acetona para os embriões. Microondas por três minutos usando um Pelco Biowave microondas Pro, mantendo a amostra sob a pressão de vácuo. Aplique a pressão de vácuo para a amostra por mais cinco minutos após o microondas terminou. Resina trocadora de 1:1, uma mistura de acetona com 100% de resina Epon-Spurr e microondas novamente sob pressão de vácuo. Trocar o 100% de resina Epon-Spurr uma última vez, e microondas sob pressão de vácuo. </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur, os embriões são transferidos do tubo de microcentrífuga para um molde de silicone incorporação. Alinhar embriões em uma linha tal que a extremidade posterior do embrião se alinha com a borda afilada do molde. Asse em forno a 70 ° C durante a noite. </li><li> Remova a amostra e se preparar para corte. </li><li> Começar a cortar seções 1 Hm usando um diamante Histo Faca e Richert Ultracut E micrótomo. Tome nota de quando a seção primeiro embrião seja atingido. A partir deste ponto, corte 100μm na amostra. Remover uma seção usando um loop, e coloque em uma lâmina de vidro. Brevemente o calor a seção sobre uma chapa quente. Manchar a seção usando uma gota de azul de metileno. Em microscópio de luz identificar o lúmen do coração. </li><li> Cortar secções de 90nm usando uma Ultra Diamante 45 ° Faca e Richert Ultracut E micrótomo. Pick up várias seções em uma grade de cobre. </li><li> Grades são corados com acetato de uranila a 3% saturada em etanol 50% para 10 minutos e depois lavadas três vezes em água bidestilada. Então, as grades são corados com citrato de chumbo (0.04gms dissolvido em 10ml de água bidestilada e 100ml NaOH 10M) por 2,5 minutos em uma câmara contendo pellets de NaOH para criar um CO 2 ambiente livre. As grades são lavados três vezes em água bidestilada. </li><li> Seções são examinadas com um microscópio eletrônico JEOL 1200EX em 80Kv, e fotografado com uma câmera digital AMT. </li></ol>

<ol><li>Tepass, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+Cellular+Junctions+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , (2000).</li>
<li>Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+by+Slit+and+Roundabout+prevents+Shotgun%2FE-cadherin-mediated+cell+adhesion+during+Drosophila+heart+tube+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation.</a> J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).</li>
</ol>

A morfogênese do tubo cardíaco embrionário Drosophila surgiu como um sistema modelo valioso para estudar a adesão celular e alterações na forma de células durante o desenvolvimento embrionário. Um dos desafios enfrentados em estudar essa estrutura é que o lúmen do tubo coração é difícil visualizar em embriões de montar todo. A técnica demonstrada neste vídeo, que foi adaptado a partir de procedimentos previamente descritos 1-2, provou ser bem sucedido na maneira eficiente e confiável analisar um grande número de genótipos para o tubo de coração e formação de lúmen 3.

preparação de embriões de microscopia eletrônica do drosophila tubo cardíaco embrionário

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

A morfogênese do<em&gt; Drosophila</em&gt; Tubo cardíaco embrionário surgiu como um sistema modelo valioso para estudar a migração celular, a adesão célula-célula e as mudanças a forma da célula durante o desenvolvimento embrionário. Um dos desafios enfrentados em estudar essa estrutura é que o lúmen do tubo cardíaco, bem como as características da membrana que são cruciais para a formação do tubo cardíaco, são difíceis de visualizar em embriões de montar todo, devido ao pequeno tamanho do tubo cardíaco e no espaço intra-lumenal em relação ao embrião. O uso de microscopia eletrônica de transmissão permite maior ampliação dessas estruturas e dá a vantagem de examinar os embriões na seção transversal, o que facilmente revela o tamanho ea forma da luz. Neste vídeo, detalhamos o processo de fixação confiável, incorporação, e secção da fase final<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões, a fim de visualizar o lúmen do tubo coração, assim como importantes estruturas celulares, incluindo junções célula-célula e da membrana basal.

Nós descrevemos um processo para a incorporação de fixação, corte e imagem da fase final<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões para Microscopia Eletrônica Trasmission do tubo cardíaco embrionário. Esta técnica permite a visualização do lúmen do tubo coração, assim como a membrana basal, que reveste a luz do coração.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

A morfogênese do tubo cardíaco embrionário da Drosophila emergiu como um sistema modelo valioso para o estudo da migração celular, adesão célula-célula e celular...

Este vídeo explica como realizar microscopia eletrônica de transmissão, também conhecida como MET, no cartilagem embrionária de drosophila. O coração surgiu como um sistema modelo valioso para o estudo da migração celular, adesão célula-célula e mudanças na forma celular. Esta técnica permite a visualização da forma do lúmen cardíaco, bem como componentes ultraestruturais como membranas celulares, junções célula-célula e membrana basal.Para iniciar este procedimento, prepara-se uma solução de fixação apropriada para microscopia eletrônica de transmissão de embriões de drosófila. Em seguida, uma coleta de embriões revestidos com idade entre zero e 20 horas é colocada na solução de fixação. Após a conclusão, os embriões são removidos da solução de fixação e manipulados enquanto presos a fita adesiva dupla face.Em uma placa de Petri contendo tamp&atilde;o, embri&otilde;es desionizados flutuam no tamp&atilde;o e s&atilde;o recuperados com uma pipeta. Em seguida, os embri&otilde;es s&atilde;o p&oacute;s-fixados e passam por um gradiente de desidrata&ccedil;&atilde;o. Uma vez infiltrados com resina, s&atilde;o transferidos para um molde de inclus&atilde;o onde s&atilde;o alinhados.O bloco resultante é cortado com uma lâmina de diamante. As seções são coletadas em grades de cobre, coradas e examinadas. Olá, sou Nadine Lop do laboratório de Sunita Kramer do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade de Medicina e Odontologia de Nova Jersey na Escola de Medicina Robert Wood Johnson.Sou Raj Patel. Sou o microscopista eletrônico, também do PON patologia. Hoje vamos mostrar um procedimento para preparar e imaginar embriões de oph para microscopia eletrônica de transmissão.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a morfogênese cardíaca de Drosophila. Então, vamos começar. Começar.Antes de manipular os embriões de drosófila, prepare imediatamente a solução fixadora para o método de fixação de embriões com permeabilização por heptano. Em uma capela, pipete dois mililitros de uma solução recém-preparada contendo 12,5% de glutaraldeído em tampão Cate para um frasco de vidro para cintilação. Adicione oito mililitros de heptano ADA e agite vigorosamente.Em seguida, aguarde um minuto. Deixe as duas fases separarem-se; a fase superior contém a ADA heptano, saturada com glutaraldeído, que é a solução fixadora. Pipete a fase superior para um frasco limpo e reserve. Para coletar embriões de zero a 20 horas, utilize uma câmara de coleta de embriões, que é um pequeno cesto com um inserto removível em malha.Inicie removendo a placa de suco de uva contendo os embriões e retire todas as moscas mortas. Em seguida, utilizando água e um pincel, solte os embriões da placa de suco de uva e transfira os embriões para a câmara de coleta de embriões usando uma garrafa quadrada contendo água.Lave os embriões para remover qualquer excesso de levedura do meio de suco de uva. Remova a membrana coriônica externa mergulhando os embriões em uma solução de hipoclorito a 50% por dois a três minutos ou até que os embriões flutuem à superfície. Enxágue abundantemente com água destilada e coloque os embriões sobre uma toalha de papel.Usando pin&ccedil;as, pegue o inserto de malha, que agora dever&aacute; estar coberto com embri&otilde;es revestidos. Coloque o inserto no fixador, permitindo que os embri&otilde;es caiam da malha. Deixe os embri&otilde;es em fixa&ccedil;&atilde;o por uma hora e meia a quatro graus Celsius, sob agita&ccedil;&atilde;o em um agitador orbital.Após a conclusão da incubação, coloque os embriões em uma placa de Petri forrada com fita adesiva dupla face, levando o mínimo possível do fixador. Agite a placa para distribuir os embriões em uma única camada e, em seguida, coloque-a na câmara de segurança química para permitir que o heptano evapore. Uma vez que os embriões estejam secos, cubra-os com tampão contendo 0,1% de tween hand de vize.Embrulhos em estágio tardio 16 sob um microscópio estereoscópico com uma agulha de tungstênio romba. Embrulhos que foram fixados flutuam e podem ser recuperados com uma pipeta de Pasteur; transfira os embrulhos para um tubo microcêntrifugo de 1,5 mililitro. Lave os embrulhos em tampão de cacodilato 0,1 molar e, em seguida, pós-fixe em tetróxido de ósmio a 1% por uma hora à temperatura ambiente.Após a incubação, lave os embriões com tampão Cate. Novamente, desidrate os embriões em uma série crescente de etanol e acetona. Inicie com etanol 50% por 10 minutos, seguido por etanol 70% por 10 minutos, depois desidrate em acetona 90% por 10 minutos e, finalmente, em etapas de acetona 100% de 10 minutos cada.Remova a acetona. Inicie o processo de infiltração adicionando uma mistura um para um de resina ein spray e acetona. Certifique-se de que a amostra esteja sob pressão de vácuo e aqueça no micro-ondas por três minutos.Mantenha a pressão de vácuo por mais cinco minutos. Substitua a mistura de resina e acetona por resina a 100% e aqueça novamente em forno de micro-ondas sob pressão de vácuo. Substitua a resina e aqueça em micro-ondas sob pressão.Um tempo final, perfazendo um total de três etapas de infiltração. Transfira os embriões do tubo microcêntrifugo para um molde de inclusão de silicone. Alinhe os embriões em uma fileira de modo que a extremidade posterior do embrião fique alinhada com a borda afilada do molde.O bacon é colocado em forno a 70 graus Celsius durante a noite. Em seguida, remova o bloco resultante para o corte em seções. Use um micrótomo para cortar seções de um micrômetro nos embriões.Uma vez que o bloco tenha sido seccionado e o embrião tenha sido alcançado, use um laço para transferir uma única seção para uma lâmina de vidro para determinar se a profundidade adequada para visualização do coração foi alcançada antes da observação. Aqueça brevemente a seção em uma placa aquecedora e cora a seção com azul de metileno, adicionando primeiro uma gota à lâmina e, em seguida, aquecendo brevemente.Novamente, lave com água desionizada e examine a seção ao microscópio na profundidade desejada de corte. A luz do coração deve ser reconhecível ao microscópio óptico para atender às limitações de espaço. Remodele o bloco para incluir no máximo cinco embriões em corte transversal que mostrem o coração embrionário.Corte seções de 90 nanômetros usando o micrótomo. Recolha múltiplas seções em uma grade de cobre. Incube a grade com acetato de uranila a 3% durante 10 minutos, depois enxágue três vezes com água destilada.Agora, contra-estaine a grade com citrato de chumbo por dois minutos e meio em uma câmara contendo pelotas de hidróxido de sódio para criar um ambiente livre de dióxido de carbono. Após a incubação, lave três vezes com água destilada. Examine as seções com um microscópio eletrônico a 80 quilovolts e fotografe com uma câmera CCD.Para determinar se a profundidade do corte e o estadiamento foram adequadamente realizados, deve ser evidente a formação de uma luz cardíaca madura entre os dois cardioblastos da linha média dorsal; para verificar se as membranas celulares estão íntegras, examine a luz cardíaca quanto à presença de matriz extracelular e procure identificar corpúsculos de Christie e mitocôndrias. Assim, acabamos de mostrar como determinar a ultraestrutura do coração embrionário de drosófila. Ao realizar este procedimento.É importante lembrar de posicionar corretamente os embriões de drosófila e medir com precisão os componentes da resina, misturando-os bem. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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