Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

Este vídeo explica como realizar a microscopia eletrônica de transmissão, também conhecida como TEM, no carrinho embrionário da drosófila. O coração emergiu como um sistema modelo valioso para estudar a migração celular, a adesão celular e as mudanças na forma celular. Essa técnica permite a visualização da forma do lúmen do coração, bem como componentes ultraestruturais, como membranas celulares, junções celulares e membrana basal.

Para iniciar este procedimento, é preparada uma solução de fixação apropriada para microscopia eletrônica de transmissão de embriões de drosófila. Em seguida, uma coleta de zero a 20 horas de embriões revestidos é colocada na solução de fixação. Quando terminados, os embriões são removidos da solução de fixação e convenientemente colocados em fita dupla-face.

Em uma placa de Petri contendo tampão, os embriões deionizados flutuam no tampão e são recuperados com uma pipeta. Em seguida, os embriões são pós-fixados e sofrem um gradiente de desidratação. Uma vez infiltrados com resina, eles são transferidos para um molde de incorporação onde são alinhados.

O bloco resultante é cortado com uma faca de diamante. As seções são coletadas em grades de cobre, coradas e examinadas. Olá, sou Nadine Lop, do laboratório de Sunita Kramer no Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade de Medicina e Odontologia de Nova Jersey na Robert Wood Johnson Medical School.

Eu sou Raj Patel. Eu sou o microscopista eletrônico também da patologia PON. Hoje mostraremos um procedimento para preparar e obter imagens de embriões oph para microscopia eletrônica de transmissão.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a morfogênese cardíaca de Drosophila. Então, vamos começar. Começar.

Antes de manusear os embriões de drosófila, prepare a solução fixadora para o método de permeação de heptano de fixação de embriões. Em uma capela de exaustão, pipetar dois mililitros de uma solução recém-feita contendo 12,5% de glutaraldeído em tampão Cate em um frasco de cintilação de vidro. Adicione oito mililitros de heptano ADA e agite vigorosamente.

Então espere um minuto. Permitindo que as duas fases separem, a fase superior contém o heptano ADA, saturado com glutaraldeído, que é a solução fixadora. Pipete a fase superior em um frasco limpo e reserve-o Para coletar embriões de zero a 20 horas, use uma câmara de coleta de embriões, que é uma pequena cesta com uma inserção de malha removível.

Comece removendo o prato de suco de uva contendo os embriões e remova todas as moscas mortas. Em seguida, usando água e um pincel. Solte os embriões da placa de suco de uva, transfira-os para a câmara de coleta de embriões usando uma garrafa quadrada contendo água.

Lave os embriões de qualquer excesso de fermento do prato de suco de uva. Remova a membrana externa do córion mergulhando os embriões em uma solução de alvejante a 50% por dois a três minutos ou até que os embriões flutuem na superfície. Enxágüe abundantemente com água destilada e coloque os embriões em uma toalha de papel.

Usando uma pinça, pegue a inserção de malha, que agora deve ser coberta com embriões revestidos. Coloque a inserção no fixador, permitindo que os embriões caiam da malha. Deixe os embriões se fixarem por uma hora e meia a quatro graus Celsius enquanto mistura em um balancim orbital.

Terminada a incubação, coloque os embriões em uma placa de Petri forrada com fita dupla-face, retirando o mínimo possível do fixador. Agite o prato para espalhar os embriões em uma única camada e, em seguida, coloque-o na capa química para permitir que o heptano evapore. Depois que os embriões secarem, cubra os embriões com tampão contendo 0,1% entre a mão de vize.

Embriões em estágio avançado 16 sob um microscópio de dissecação com uma agulha de tungstênio romba. Os embriões que foram dimensionados, flutuam e podem ser recuperados com uma pipeta de pastagem transferem os embriões para um tubo de micro fuge de 1,5 mililitro. Enxágue os embriões em tampão molar 0,1 e, em seguida, fixe em tetróxido de ósmio a 1% por uma hora em temperatura ambiente.

Após a incubação, enxágue os embriões com tampão Cate. Mais uma vez, desidrate os embriões em uma série de graus de etanol e acetona. Comece com 50% de etanol por 10 minutos, seguido de 70% de etanol por 10 minutos, depois desidrate em 90% de acetona por 10 minutos e, finalmente, em etapas de 100% de acetona de 10 minutos cada.

Remova a acetona. Comece o processo de infiltração adicionando uma mistura individual de resina em spray ein e acetona. Certifique-se de que a amostra esteja sob pressão de vácuo e leve ao microondas por três minutos.

Mantenha a pressão de vácuo por mais cinco minutos. Troque a mistura de acetona de resina por 100% de resina e leve ao microondas novamente sob pressão de vácuo. Troque a resina e leve ao micro-ondas sob pressão.

Um tempo final para um total de três etapas de infiltração. Transfira os embriões do tubo de micro fuge para um molde de incorporação de silicone. Alinhe os embriões em uma fileira de forma que a extremidade posterior do embrião se alinhe com a borda cônica do molde.

O bacon fica a 70 graus Celsius no forno durante a noite. Em seguida, remova o bloco resultante para seccionamento. Use um micrótomo para cortar seções de um micrômetro nos embriões.

Uma vez que o bloco tenha sido seccionado e o embrião tenha sido alcançado, use um laço para mover uma única seção em uma lâmina de vidro para determinar se a profundidade adequada para visualizar o coração foi alcançada antes da visualização. Aqueça brevemente a seção em uma placa quente e pinte a seção com azul de metileno, adicionando primeiro uma gota à lâmina. E então aquecendo brevemente.

Novamente, enxágue com água deionizada e examine a seção ao microscópio na profundidade desejada de secção. O lúmen do coração deve ser reconhecível com um microscópio de luz para satisfazer as restrições de espaço. Retire novamente o bloco para incluir no máximo cinco embriões em seção transversal que mostrem o coração embrionário.

Corte seções de 90 nanômetros usando o micrótomo. Pegue várias seções em uma grade de cobre. Manchar a grelha com acetato de 3% de álcool durante 10 minutos e depois enxaguar três vezes com água destilada.

Agora pinte a grade com citrato de chumbo por dois minutos e meio em uma câmara contendo pellets de hidróxido de sódio para criar um ambiente livre de dióxido de carbono. Após a incubação, enxágue três vezes com água destilada. Examine as seções com um microscópio eletrônico a 80 quilovolts e fotografe com uma câmera CCD.

Para determinar se a profundidade de secção e o estadiamento foram realizados corretamente, deve ser aparente que um lúmen cardíaco maduro se formou entre os dois cardioblastos da linha média dorsal para determinar se as membranas celulares estão intactas, examinar o lúmen do coração quanto à presença de matriz extracelular e procurar a presença de Christie e mitocôndrias. Então, acabamos de mostrar como determinar a ultraestrutura do coração embrionário da drosófila. Ao fazer este procedimento.

É importante lembrar de preparar adequadamente os embriões de drosófila e medir com precisão os componentes da resina e misturá-los bem. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.