Medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de Recuperação Após Fotodegradação

A fluorescência multifóton. A recuperação após o procedimento de fotobranqueamento é facilmente demonstrada com uma amostra de difusão livre de moléculas de corante fluorescente. Primeiro, um feixe de laser de baixa intensidade é enviado para a amostra para gerar um nível de referência de fluorescência das moléculas D dentro do volume focal do laser.

Em seguida, um breve flash de laser de alta intensidade é enviado no fotobranqueamento de uma parte das moléculas de corante dentro do volume focal. Finalmente, o feixe de laser é atenuado para o nível de baixa intensidade anterior e a fluorescência é monitorada à medida que as moléculas fotobranqueadas se difundem para fora e são substituídas por moléculas ainda fluorescentes de fora do volume focal. A fluorescência resultante em função da curva de tempo é analisada para produzir o coeficiente de difusão.

Olá, sou Kelly Sullivan, do Laboratório de Edward Brown no Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Rochester. Hoje mostraremos como realizar a recuperação de fluorescência multifóton após o fotobranqueamento. Usamos essa técnica em nosso laboratório para estudar a difusão em sistemas biológicos in vitro e in vivo.

Então vamos começar. Para começar, defina o comprimento de onda do laser desejado e insira o filtro apropriado na frente do tubo fotomultiplicador ou PMT. Em seguida, para evitar danos à célula pcal, ajuste a potência do laser para 200 miliwatts ou menos.

Existem dois espelhos orientados em uma figura quatro a montante da célula pcal. Esses espelhos são necessários e suficientes para alinhar o feixe de laser através da célula pcal. Defina o voltage deslocamento no controlador de polarização da célula pcal para zero, ajuste o caminho do laser através da célula pcal de forma que o laser fique centralizado nas janelas frontal e traseira.

Use o espelho a montante na figura quatro para centralizar o feixe na janela frontal e o espelho a jusante na figura quatro para centralizar o feixe na janela traseira. Agora defina a tensão no cristal da célula pcal para o valor máximo. O valor apropriado depende dos comprimentos de onda e pode ser encontrado no manual de instruções da célula pcal.

Ajuste os espelhos na figura quatro a montante da célula pcal até que a potência de saída da célula pcal seja maximizada. Agora mude a tensão através do cristal para zero e ajuste o deslocamento de tensão no controlador de polarização para minimizar a potência de saída da célula pcal. Retorne a potência do laser incidente na célula pcal para o valor necessário para o experimento.

Agora, passando para o microscópio, obtenha um bom foco visual em uma amostra fluorescente padronizada. Aqui estamos usando grãos de pólen fluorescentes fixos. Uma vez focado, sele o microscópio, ajuste a potência do laser para um nível apropriado para a imagem da amostra, alterando a voltagem através do cristal da célula pcal.

Finalmente, apague as luzes e ligue o PMT. Inicie uma varredura de imagem repetida da amostra padronizada e ajuste os espelhos a jusante da célula pcal até que uma imagem nítida da amostra seja obtida. Agora vamos ver como determinar se o monitor seguro alimenta o foco popular na amostra.

Para o propósito deste vídeo, usaremos uma amostra de corante aquoso mantido dentro de uma depressão em uma lâmina de vidro e tampado com uma lamínula. Atenue o laser para uma potência baixa, mas razoável, para gerar fluorescência dentro da amostra. Sele o microscópio, desvie a saída do PMT para o contador de fótons.

Apague as luzes, acenda o PMT e inicie uma varredura pontual no software do microscópio. Defina o contador de fótons para se integrar em uma escala de tempo muito maior do que o tempo de recuperação de fluorescência esperado e registre um número razoável de pontos de dados. Aumente a potência e pegue outra série de dados de contagem de fótons.

Continue aumentando a potência até que o aumento na contagem de fótons pareça diminuir significativamente. Com relação ao gráfico de aumento de potência, o log do fóton conta como uma função do log de potência. Qualquer desvio de uma inclinação de dois indica branqueamento.

Durante o monitor, selecione uma potência de monitor razoável que esteja abaixo desse corte. Agora vamos determinar os parâmetros de entrada para o scaler multicanal e o gerador de pulso. No gerador de pulsos.

Defina o tempo de pré-ensino para ser uma a duas vezes maior do que o tempo de meia recuperação esperado e o tempo de branqueamento para ser um décimo do tempo de recuperação esperado no scaler. Defina a largura do compartimento para aproximadamente metade da duração do branqueamento e defina o número de compartimentos por registro, de modo que o produto da largura do compartimento selecionado e os compartimentos por registro sejam maiores do que o tempo de recuperação total esperado. Além disso, os tempos de preble e bleach retornam ao gerador de pulsos e definem a frequência da sequência de preble e bleach igual a um valor um pouco menor que o inverso do produto da largura do compartimento vezes o número de caixas por registro.

Por fim, defina o número de registros por varredura no scaler com base na intensidade do sinal na potência do monitor escolhida. Agora defina a potência do monitor para um nível seguro e defina a potência de branqueamento para cerca de 200 miliwatts acima do corte de branqueamento determinado durante o teste de branqueamento do monitor. Essas potências são definidas como diferentes voltagens no selo de cristal da célula al, o microscópio desliga as luzes.

Ligue o PMT. Inicie uma varredura de ponto no software de imagem. Em seguida, inicie o gerador de pulsos e o scaler.

Para analisar a curva de recuperação resultante, marque três pontos importantes. A fluorescência preble, a fluorescência imediatamente após o alvejante e a fluorescência no final do conjunto de dados. Use os valores de fluorescência antes e imediatamente após o alvejante para estimar melhor o tempo de recuperação da metade.

Agora, use as regras descritas nas etapas anteriores para atualizar os valores do alvejante preble e iniciar as durações de largura. Pegue uma nova curva e continue ajustando os parâmetros até que a curva resultante exiba um alvejante forte e uma recuperação suave. Verifique a saturação de excitação plotando o log do parâmetro de profundidade de branqueamento em função do log de potência.

Qualquer desvio de uma inclinação de dois indica saturação de excitação. Escolha um poder de alvejante que produza um alvejante forte, mas não cause saturação. Finalmente, com os parâmetros apropriados determinados, continue fazendo a recuperação de fluorescência multifóton após o fotobranqueamento ou curvas MP FP de sua amostra de interesse.

Agora mostraremos resultados representativos de ambos os dados brutos de MP frap em uma curva de envoltório MP F normalizada que foi ajustada, o coeficiente de difusão, os dados brutos de MP F frap exibem, um alvejante forte e uma recuperação suave. Com a recuperação completa sendo relatada para a segunda metade dos dados para se ajustar aos dados. Primeiro, normalizamos a recuperação para a fluorescência média do preble e, em seguida, realizamos um ajuste de quadrados alugados não lineares.

Com relação ao modelo apropriado. Ambos os conjuntos de dados foram obtidos em fluoresceína aquosa e coeficientes de difusão de rendimento. Consistente com a literatura Acabamos de mostrar como realizar uma recuperação de fluorescência multifóton após o experimento de fotobranqueamento.

Ao realizar este procedimento, é importante ter cuidado e definir seus parâmetros experimentais, em particular, a duração do alvejante e os poderes de branqueamento e monitoramento para os limites seguros a serem definidos no protocolo. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.