Name: Medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de Recuperação Após Fotodegradação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-26T16:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a medir coeficientes de difusão usando microscopia de fluorescência multiphoton com recuperação após fotodegradação. Este método permite analisar a dinâmica molecular em amostras biológicas com precisão.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por um Departamento de Defesa Era do Prêmio Acadêmico Hope (No. W81XWH-05-0396) e bolsista da Pew no Prêmio Ciências Biomédicas de Edward B. Brown III.

1. Alinhe as ópticas. O equipamento fundamental para um experimento MP-FRAP incluem: um mode-locked fonte de laser, Cell Pockels (por feixe de modulação), gerador de pulso, dicróicas, lente objetiva, emissão de fluorescência de filtro, tubo fotomultiplicador fechado, e um sistema de gravação de dados (fóton counter e multicanal scaler). 2. Determine poderes monitorar segura. <ol><li> Atenuar o laser a um ponto baixo, mas razoável de energia, para a geração de fluorescência da amostra. </li><li> Foco dentro da amostra. </li><li> Definir um contador de fótons para integrar mais de uma escala de tempo muito mais do que a recuperação de fluorescência esperado. Com o volume focal realizada parado dentro da amostra (em nosso software microscópio isso é conseguido por um scan ponto), gravar um número razoável de dados de contagem de fótons. </li><li> Aumentar o poder e tomar outra série de dados de contagem de fótons. Repita até que o aumento na contagem de fóton parece diminuir significativamente em relação ao aumento de potência. </li><li> Log plot (contagem de fóton) como uma função de log (potência). Um desvio de uma pista de dois indica branqueamento durante o monitor. Escolher como seu poder monitorar um poder que está abaixo desse corte, mas que permite um sinal-ruído razoável. </li></ol> 3. Determinar parâmetros de entrada para o gerador de pulso e multicanal scaler. <ol><li> Determine back-of-the-envelope estimativas do coeficiente de difusão eo tempo de recuperação com base na literatura e / ou a equação de Stokes-Einstein ea equação de difusão. </li><li> Definir os valores dos parâmetros necessários no gerador de pulsos eo scaler. <ol class="lalpha"><li> No gerador de pulso, definir os tempos de pré-alvejante e água sanitária. Um bom conjunto de regras de ouro é que o pré-lixívia deve ser 1-2 vezes maior do que o tempo esperado de recuperação meia, eo tempo de lixívia deve ser um décimo do tempo de recuperação esperado meia. </li><li> Sobre o scaler, definir a largura bin para aproximadamente metade da água sanitária, duração e definir o número de caixas por registro de tal forma que o produto de sua largura bin selecionados e caixas por registro for maior ou igual a cerca de sua recuperação que se espera cheio mais pre -lixívia e os tempos de lixívia. </li><li> Retornar para o gerador de pulso e definir a freqüência da seqüência pre-bleach/bleach/monitor igual a um valor apenas menor do que o inverso do produto dos tempos bin largura do número de caixas por registro. * </li><li> Por fim, defina o número de registros / scan no scaler com base na intensidade do sinal em sua alimentação do monitor escolhido. * É muito importante que o tempo para uma seqüência pre-bleach/bleach/monitor completa (1/frequency) definido no gerador de pulso é maior do que o tempo de coleta de dados (bin largura x caixas / registro) set no scaler. Se este critério não for cumprido, triggers lixívia múltiplos podem aparecer dentro de um único registro no scaler. </li></ol></li><li> Definir a energia do monitor para um nível aceitável, determinado anteriormente. Definir o poder de lixívia para 200 mW ou mais acima do limite de branqueamento determinada durante o teste de monitor de branqueamento. Esses poderes são definidos como voltagens diferentes em todo o cristal PC. </li><li> Seal ao microscópio, desligue as luzes, ligar a PMT, começam uma varredura ponto no software microscópio, em seguida, iniciar o gerador de pulso e scaler. </li><li> Analisar a curva de recuperação resultante traçando a curva e marcando três pontos importantes: 1) o pré-fluorescência lixívia, 2) a fluorescência imediatamente pós-lixívia, e 3) de fluorescência no final do conjunto de dados. Use os valores de fluorescência pré e imediatamente pós-lixívia para melhor estimar o tempo de meia-recuperação. </li><li> Com essa estimativa do tempo de recuperação de meia, use as regras de ouro descritos anteriormente para determinar novos valores para o pré-bleach bleach, e durações largura bin. Além disso, use a fluorescência pré-sanitária e de fluorescência no final do conjunto de dados para melhor estimar o tempo necessário para conseguir a recuperação completa. Como regra geral, os dados devem ser recolhidos para um período de tempo que permite a recuperação total serão comunicados para a segunda metade dos dados. </li><li> Ajustar os parâmetros do gerador de pulso e scaler, dê uma nova curva, e continuar ajustando os parâmetros até a curva apresenta um alvejante forte e suave recuperação. Tenha em mente que a duração lixívia pode, e deve, ser reduzida abaixo da regra de ouro, se possível. O poder lixívia também pode ser ajustado se muito superficial ou muito profunda, um alvejante é alcançado. </li></ol> 4. Teste para a saturação de excitação. <ol><li> Usando monitor apropriado e poderes lixívia, determinado previamente, tomar uma série de MP-FRAP curvas. Analisar cada recuperação, normalizada para a fluorescência pré-lixívia, utilizando o formulário apropriado matemática e uma mínimos quadrados não-linear algoritmo de montagem (ver "Análise de Dados" abaixo). Registrar o valor do parâmetro equipado profundidade lixívia.</li><li> Continue a tomar e analisar série sucessiva de MP-FRAP curvas de aumentar os valores de poder alvejante. </li><li> Log plot (parâmetro de profundidade lixívia) como uma função de log (potência). Qualquer desvio de uma pista de dois indica a saturação de excitação. Escolha um poder alvejante que gera um lixívia forte, mas não causa saturação. </li></ol> 5. Continue a tomar MP-FRAP curvas. <ol><li> Continuar a tomar as curvas, como acima, vai todos os parâmetros devidamente definidos. </li></ol> 6. Análise de Dados. <ol><li> Remove os dados pré-alvejante e água sanitária a partir dos dados de fluorescência definir e ajustar os dados de tempo tal que t = 0 corresponde ao valor de fluorescência imediatamente pós-lixívia. </li><li> Normalizar a recuperação de fluorescência resultante no que diz respeito à fluorescência pré-bleach média. </li><li> O traçado da curva normalizada usando o modelo matemático apropriado e de um algoritmo não-linear, pelo menos, praças de montagem, como a função lsqcurvefit em MATLAB. O modelo apresentado aqui é responsável por recuperações de fluorescência influenciado por ambos difusão e fluxo de convecção: <img src="/files/ftp_upload/1636/1636eq.jpg" alt="Equação" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação"> onde F é a fluorescência o pré-bleach média, β é o parâmetro de profundidade de água sanitária, τ D é o tempo de recuperação característica difusivo, R é a razão entre o quadrado da axial (w z) e radial (w r) larguras das dois fótons de volume focal, τ vx = w r / v x, τ vy = w r / v y, τ vz = w z / v z e v 2 = v x 2 + v y 2 + v z 2 é o velocidade do fluxo convectivo. Para o fluxo confinado ao plano de imagem, τ vz → ∞ e 1 / τ vx + 1 / τ vy pode ser substituído com 1 / τ vr. Na ausência de fluxo de convecção, dois exponenciais no numerador vai para 1 ea expressão é muito reduzida, a apenas dois parâmetros de ajuste, β e τ D. O coeficiente de difusão é facilmente calculada como D = w r 2 / 8τ D. </li></ol> 7. Resultados representante. <img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Lixívia Representante ea curva de recuperação para FITC-BSA. A curva de boa recuperação exibe uma lixívia forte e suave recuperação, com a fluorescência em plena recuperação que está sendo relatado para a segunda metade dos dados. <img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Curva de recuperação Normalizado para FITC-BSA (vermelho) eo ajuste dos mínimos quadrados associados (preto). Este ajuste produz um coeficiente de difusão de 52,9 UM2 / s, de acordo com a literatura.

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 60, 73-76 (1990).</li>
<li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).</li>
<li>Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+model+of+fluorescence+recovery+expands+the+application+of+multiphoton+fluorescence+recover+after+photobleaching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo.</a> Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).</li>
</ol>

O poder da multi-fotão de recuperação de fluorescência após a fotodegradação reside na sua capacidade de sondar as amostras de espessura, com resolução em 3D. Desde seu desenvolvimento na década de 1990, MP-FRAP foi usado para determinar o coeficiente de difusão (ou parâmetros de transporte análoga) nos corpos celulares, ex vivo fatias grossas de tecido, e no tecido vivo e interstício. Neste artigo, apresentamos os equipamentos necessários para executar uma experiência MP-FRAP, bem como o proc...

<table><tbody><tr><td>laser de Ti:safira</td><td>Newport Corp.</td><td>Mai Tai</td><td></td></tr><tr><td>Célula de Pockels</td><td>Conoptics</td><td>350-80</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio a varredura a laser</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicromático de passagem curta</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>670 DCSX-2P</td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomultiplicador</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>Contador de fótons</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 400</td><td></td></tr><tr><td>Escalonador/média multicanal</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 430</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de pulsos</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DG 535</td><td></td></tr><tr><td>FITC-BSA</td><td>Invitrogen</td><td>--</td><td></td></tr></tbody></table>

medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de recuperação após fotodegradação

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescência de recuperação após fotodegradação é uma técnica de microscopia utilizadas para medir o coeficiente de difusão (ou parâmetros de transporte análogos) de macromoléculas, e pode ser aplicado tanto<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt; Sistemas biológicos. Multi-fluorescência de recuperação após fotodegradação é realizada por fotobranqueamento uma região de interesse dentro de uma amostra fluorescente usando um flash de laser intenso, então atenuar o feixe e monitoramento da fluorescência como ainda fluorescente moléculas de fora da região de interesse difuso para substituir as moléculas Foto-descoloração . Vamos começar a nossa demonstração, alinhando o feixe de laser através da célula Pockels (laser modulador) e ao longo do caminho óptico através da caixa de varredura a laser e objetiva para a amostra. Para simplificar, vamos utilizar uma amostra de corante fluorescente aquosa. Vamos, então, determinar quais os parâmetros corretos para nossa amostra experimental, incluindo, monitor e os poderes de branqueamento, duração lixívia, larguras bin (para contagem de fótons), eo tempo de recuperação de fluorescência. Em seguida, iremos descrever o procedimento para a tomada de curvas de recuperação, um processo que pode ser amplamente automatizadas via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) para aumento da produção. Finalmente, o coeficiente de difusão é determinada pelo ajuste dos dados de recuperação para o modelo matemático apropriado usando um algoritmo de ajuste dos mínimos quadrados, prontamente programáveis ​​usando softwares como o MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

Neste artigo iremos descrever o procedimento para medir coeficientes de difusão usando multi-fotão de recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Vamos começar pelo alinhamento do laser ao longo do caminho óptico para a amostra e determinar os parâmetros adequados experimental, em seguida, continuar gerando e, finalmente, ajuste de curvas de recuperação de fluorescência.

Medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de Recuperação Após Fotodegradação

A recuperação de fluorescência múltipla após fotobranqueamento é uma técnica de microscopia utilizada para medir o coeficiente de difusão (ou parâmetros de transporte análogos)...

A fluorescência multifotônica. A recuperação após o clareamento fotônico é facilmente demonstrada com uma amostra livremente difusível de moléculas de corante fluorescente. Primeiro, um feixe a laser de baixa intensidade é direcionado à amostra para gerar um nível de referência de fluorescência a partir das moléculas D dentro do volume focal do laser.Em seguida, um breve pulso de laser de alta intensidade é aplicado para fotobranquear uma porção das moléculas do corante dentro do volume focal. Por fim, o feixe de laser é atenuado ao nível de baixa intensidade anterior e a fluorescência é monitorada à medida que as moléculas fotobranqueadas difundem-se para fora e são substituídas por moléculas ainda fluorescentes provenientes de fora do volume focal. A curva resultante da fluorescência em função do tempo é analisada para determinar o coeficiente de difusão.Olá, sou Kelly Sullivan do Laboratório de Edward Brown, do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Rochester. Hoje vamos mostrar como realizar a recuperação de fluorescência por múltiplos fótons após fotobranqueamento. Utilizamos esta técnica em nosso laboratório para estudar a difusão em sistemas biológicos in vi

measuring-diffusion-coefficients-via-two-photon-fluorescence-recovery

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra o uso da espectroscopia de flutuação de fluorescência para detectar a interação entre as proteínas da superfície celular nos contatos célula-célula. Ao expressar o receptor de adesão transmembrana de interesse marcado com uma proteína fluorescente e misturar duas populações de células diferentes que abrigam dois marcadores fluorescentes separados espectralmente, a transinteração entre os receptores de duas células vizinhas com fluorescência de cores diferentes é avaliada...

Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Interação de Proteínas em Contatos Celulares

Este documento fornece um guia passo a passo para a técnica de análise de flutuação k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) para medir coeficientes de difusão de fluorescente etiquetado proteínas da membrana plasmática em células de mamíferos vivos.

Fácil medição de Difusão Coeficiente de EGFP-tag Plasma Proteínas de Membrana Usando k-Space espectroscopia de correlação de Imagem

A distribuição espacial e a dinâmica temporal das proteínas e lipídios da membrana plasmática são um tema quente na biologia. Aqui, esse problema é abordado por uma análise de flutuação de imagem espaço-temporal que fornece conceitualmente as mesmas quantidades físicas de rastreamento de partícula única, mas usa pequenos rótulos moleculares e configurações de microscopia padrão.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

Estudos de biomoléculas in vivo são cruciais para a compreensão da função molecular em um contexto biológico. Aqui descrevemos um novo método que permite a internalização de biomoléculas fluorescentes, como DNA ou proteínas, em microrganismos vivos. A análise de dados in vivo registrados por microscopia de fluorescência também é apresentada e discutida.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

Apresentamos uma nova técnica para medir a difusão lateral de uma espécie tensoativa na interface fluido-fluido, mesclando uma monocamada de gotículas em uma monocamada plana.

Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer

Um método para medir a difusão de proteínas em membranas de células imunes primárias usando espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é descrito. Neste artigo, o uso de anticorpos para marcação fluorescente é ilustrado.

Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Microirradiation do laser é uma ferramenta útil para estudos de reparo de ADN em células vivas. Uma abordagem metodológica para o uso de lasers UVA para induzir várias lesões do ADN é mostrada. Otimizamos a um método para microirradiation local que mantém o ciclo celular normal; assim, as células irradiadas prosseguir através de mitose.

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

Aqui, apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de ressonância Förster, sensores de tensão baseados na transferência de energia para medir proteína carga e fluorescência recuperação após fotobranqueamento para medir a dinâmica da proteína, permitindo a medição de força-sensível dinâmica da proteína dentro de células vivas.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Apresentamos um protocolo experimental e um fluxo de trabalho de análise de dados para realizar espectroscopia de correlação transversal de fluorescência de células vivas (FCCS) combinada com a transferência de energia de ressonância förster (FRET) para estudar a dinâmica do receptor de membrana em células vivas usando técnicas modernas de rotulagem de fluorescência.

Espectroscopia de fluorescência de dupla cor para estudar interação proteína-proteína e dinâmica de proteína em células vivas

Este artigo apresenta um método para análise espiostemporal de sondas móveis, de uma molécula, baseadas em Förster, utilizando microscopia de fluorescência widefield. O kit de ferramentas de software recém-desenvolvido permite a determinação de traços de tempo smFRET de sondas móveis, incluindo a eficiência correta do FRET e as posições moleculares, em função do tempo.

Análise espacial bidimensional automatizada de sondas FRET de molécula única móvel

Aprenda a medir coeficientes de difusão usando microscopia de fluorescência multiphoton com recuperação após fotodegradação. Este método permite analisar a dinâmica molecular em amostras biológicas com precisão.

Medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de Recuperação Após Fotodegradação

Explorar mais vídeos