Dissecação ao vivo de Drosophila Embriões: Métodos ágeis para Screening Coleções Mutant pela coloração de anticorpos

Aqui vemos o procedimento de coleta de embriões. Transfira as moscas dos frascos para os tubos de uma câmara de coleta de cinco barris. Em seguida, coloque um prato de agri de uva em cima da câmara e deixe as moscas botarem ovos por algumas horas.

Quando os embriões estiverem no estágio certo, transfira-os do aate de uva para fita adesiva dupla com um pincel. Agora role os embriões para fora de seus kons e alinhe-os em um bloco de ágar com seus lados ventrais. No meio, vemos um slide com um retângulo de cera e um pedaço de fita adesiva dupla Em uma extremidade, inverta a fita dupla face sobre o bloco com os embriões alinhados e toque-a nos embriões para transferi-los para a lâmina.

Eles agora estarão com o lado dorsal para cima imediatamente. Adicione PBS à área da lâmina delimitada pelo retângulo de cera de modo a cobrir os embriões. A parte superior mostra uma vista lateral do slide e a parte inferior mostra uma vista superior.

Faça um corte ao longo da membrana do viel com uma agulha de dissecação de vidro. Cutuque os embriões na região do cérebro, levante-os e mova-os para fileiras no vidro. Em seguida, disseque cada embrião para fazer um filé.

Ao final do procedimento, você terá um slide com fileiras de embriões de filé. Agora está pronto para consertar. Olá, sou Peter Lee, um pôster no laboratório Kaizens na divisão de biologia da Caltech.

Olá, sou Ashley Wright, uma estudante de pós-graduação da Caltech no Kaizens Lab. Eu sou Kaizen, professor da Caltech, e meu grupo de pesquisa trabalha com o desenvolvimento do sistema nervoso em moscas-das-frutas. Hoje mostraremos um procedimento para dissecar embriões de opala vivos.

Usamos esses métodos para procurar ligantes de receptores órfãos. Fazemos isso rastreando coleções de linhagens que expressam proteínas de superfície celular por coloração viva de embriões com proteínas de fusão de receptores. Também usamos esse procedimento no laboratório para estudar fenótipos embrionários e realizar exames genéticos.

Eu conduzi uma triagem de deficiência para atos motores em fenótipos de orientação. Então vamos começar. Peter vai te mostrar como isso é feito.

Para começar, use uma espátula para colocar um pouco de pasta de fermento em uma placa de coleta de ovos agri de uva correspondente a cada um dos barris de uma câmara de coleta de embriões. Em seguida, injete gás dióxido de carbono nos frascos de mosca para colocar as moscas para dormir. Transfira algumas centenas de moscas diretamente para a câmara de coleta.

Em seguida, cubra a câmara com a placa coletora de ovos e pressione para baixo: Usando uma tira de fita adesiva de 20 polegadas de comprimento, amarre a câmara e a placa começando do meio da placa de ágar. A fita se sobreporá na placa de coleta de ovos. Depois que as moscas acordarem, incube em temperatura ambiente no escuro por duas ou três horas na posição horizontal após a incubação, bata nas moscas e recoloque a placa de coleta.

Se menos de 100 embriões estiverem presentes em cada setor da placa removida. Continue realizando coletas de duas horas até que embriões suficientes tenham sido coletados. Os embriões coletados podem ser agrupados de acordo com as especificações do protocolo escrito que o acompanha.

Para envelhecer os embriões, coloque um pedaço úmido de papel de filtro circular de 90 milímetros na tampa de uma placa de Petri e coloque a placa de coleta com os embriões de cabeça para baixo. Incube a placa pela duração desejada e na temperatura desejada, prepare uma lâmina para o estadiamento e classificação do embrião, colocando fita adesiva dupla face em uma lâmina. Em seguida, coloque uma placa retangular de ágar uva na lâmina S.

O egger deve ser grande o suficiente para conter de cinco a 10 fileiras de 10 a 15 embriões. Assim que os embriões atingirem o estágio desejado, retire-os da incubadora. Transfira os embriões envelhecidos da placa coletora para a fita adesiva dupla face.

Usando um pincel úmido, espalhe os embriões uniformemente pela fita. Sob um microscópio de dissecação de GFP, SOAR embriões para expressão apropriada de GFP, o que indica genótipo. Neste experimento, a genotipagem é realizada selecionando embriões que não possuem expressão do braço encaracolado balanceador, GFP.

Como a genotipagem de embriões varia de acordo com o balanceador usado, consulte o protocolo escrito que acompanha para obter mais informações sobre como realizá-lo. Passo. Em seguida, usando uma agulha de dissecação embotada, cubra os embriões rolando-os suavemente sobre a fita adesiva de dupla face. No estágio 16, o intestino se dividiu em três bandas.

Depois disso, o intestino começa a desenvolver faixas diagonais perto da cauda e depois se enrola e o embrião fica mais claro. Em seguida, use a agulha de dissecação para rolar cada embrião em cima do córion ou de outros embriões. Evitando o contato com a fita, levante o embrião e transfira-o para a placa de ágar uva.

Alinhe os embriões revestidos nesta placa com seus lados dorsais contra a placa de ágar e as extremidades posteriores voltadas para baixo. Em seguida, coloque a lâmina em uma placa de Petri com papel de filtro úmido e incube os embriões em temperatura ambiente até atingirem a idade desejada Para dissecação, prepare uma lâmina para dissecção viva cortando um pequeno pedaço retangular de fita adesiva dupla face. Coloque a fita perto de uma extremidade de uma lâmina super frost plus usando uma caneta de cera.

Desenhe um retângulo com a largura do slide e 30 a 40 milímetros de comprimento ao redor da fita. Deve haver aproximadamente três milímetros de espaço entre a cera e a fita. Em seguida, transfira os embriões da grande placa para a fita, invertendo a lâmina e abaixando-a suavemente sobre os embriões alinhados para que a fita entre em contato com eles.

Os embriões devem ser orientados com as extremidades posteriores para baixo. Após a transferência, os embriões serão posicionados com o lado dorsal para cima na lâmina, adicione imediatamente um XPBS sobre os embriões para preencher o retângulo de cera usando uma agulha de dissecção de vidro, que é feita em um extrator de agulha como uma agulha de injeção. Corte ao longo da linha média dorsal a partir da extremidade posterior do embrião.

Agora cutuque a extremidade anterior do embrião e levante-o. Começando pela parte inferior, transfira o embrião para a direita da tira de fita, mantendo-o no tampão. Continue dissecando e transferindo embriões, fazendo uma fileira ordenada de embriões na lâmina que corresponda a cada fileira da laje agrícola.

Usando a agulha de dissecação, empurre suavemente as abas da parede do corpo para baixo na lâmina. Evitar esticar ou remover material de sua superfície. A agulha deve entrar em contato apenas com os cantos anterior e posterior nas bordas dorsais da parede corporal.

Uma vez que os axônios motores não se estendem tão longe. Dorsalmente, evite tocar nas agulhas da lâmina, pois ela quebrará depois que todos os embriões forem transferidos e afixados na lâmina. Remova o intestino de cada embrião cortando os quatro intestinos da área do cérebro e puxando todo o intestino para longe do embrião.

Desloque o intestino traseiro para o slide. Depois que todas as dissecações forem concluídas, use duas pipetas anteriores para fornecer simultaneamente temperatura ambiente, 5% de formaldeído em um canto da cera, retângulo e remova a solução do canto oposto. Trocar a solução fixadora três vezes com um volume total de cerca de seis mililitros.

Incubar os embriões na solução fixadora durante 45 minutos. É muito importante não permitir que o menisco entre em contato com os embriões, pois isso os destruirá. Use uma pipeta passada para remover a maior parte da solução fixadora.

Lave com PB S3 vezes usando o método de pipeta de duas pastagens. Em seguida, lave com PBT três vezes para permanenteizar os embriões. Esta etapa também torna os embriões menos sensíveis ao menisco.

Após a lavagem final, remova cuidadosamente o PBT inclinando a lâmina e toque brevemente um lenço Kim no canto da área delimitada pela cera para remover o excesso de solução. Usando uma pipeta pré-carregada, adicione imediatamente 200 microlitros de bloco de solução de bloqueio por 10 a 30 minutos. À temperatura ambiente, remova a solução de bloqueio usando um lenço umedecido.

Em seguida, adicione imediatamente 200 microlitros do anticorpo primário desejado diluído em solução de bloqueio. Coloque a lâmina em uma placa umidificada e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Neste experimento, o anticorpo monoclonal 1D quatro é usado para marcar axônios motores.

No dia seguinte, retire a louça de quatro graus Celsius e lave os embriões três vezes em uma plataforma de balanço com PBT por pelo menos 15 minutos por lavagem. Para todas as etapas de lavagem, certifique-se de que haja PBT suficiente para mergulhar completamente o slide durante o balanço. Depois que os embriões forem lavados, bloqueie a lâmina como antes.

Após o bloqueio imediato, adicione 200 microlitros de anticorpo secundário e solução de bloqueio e incube duas horas em temperatura ambiente aqui um Alexa 4 88 ir anti-US. Secundário é usado em conjunto com Rodine Phin para rotular fibras musculares. Novamente, lave três vezes com PBT na plataforma de balanço por pelo menos 15 minutos por lavagem.

Transfira as lâminas para uma bandeja diferente para remover o detergente residual. Em seguida, lave duas vezes com PBS por cinco minutos. Remova a lâmina do PBS plote a maior parte do PBS restante do poço com um lenço químico e adicione imediatamente 500 microlitros de glicerol a 70%.

Como o glicerol tem o mesmo índice de refração do embrião, a realização desta etapa tornará a coloração mais visível, limpe os embriões por duas horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o glicerol com um lenço umedecido. A remoção de quase todo o glicerol achatará os embriões, enquanto a remoção de menos glicerol resultará em uma estrutura mais tridimensional.

Depois que o glicerol for removido, coloque uma lamínula número um. Os embriões estão prontos para imagem, dissecados e corados, os embriões podem ser visualizados por microscopia de imunofluorescência. Aqui, um embrião dissecado foi corado com o anticorpo de marcação do axônio motor 1D quatro.

Esta imagem é semelhante em aparência às imagens mais comumente vistas nas quais a imuno-histoquímica HRP foi usada para visualização usando imunofluorescência. É possível obter imagens de maior qualidade nas quais os detalhes dos ramos do axônio motor são vistos com mais clareza. A coloração Cos com phin marcado com rho domine, que se liga à actina, permite a visualização simultânea dos músculos.

Isso dá uma imagem mais clara das camadas e organização muscular, então pode ser obtido com a coloração HRP Aqui, 1D quatro ou axônios motores são mostrados em verde Fein ou músculo é mostrado em vermelho. Acabamos de demonstrar como dissecar embriões vivos de drosófilas de coleções de linhagens mutantes. Quando você está fazendo esses procedimentos, é importante começar com linhas fáceis como lio, tatu, GFP, estoques equilibrados e apenas fazer algumas linhas de cada vez.

À medida que você se torna mais experiente e rápido com as dissecações, você pode fazer até 10 linhas por dia e isso permitirá que você rastreie uma coleção de cerca de 200 linhas mutantes em um período de 20 dias ou mais. Portanto, este é realmente um procedimento muito eficiente, uma vez que você se torna especialista na execução de todas as etapas. Então é isso, e obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.