Dissecação ao vivo de Drosophila Embriões: Métodos ágeis para Screening Coleções Mutant pela coloração de anticorpos

Aqui observamos o procedimento para coletar embriões. Transfira as moscas de frascos para os tubos de uma câmara de coleta com cinco cilindros. Em seguida, coloque uma placa de ágar de uva sobre a câmara e permita que as moscas depositem ovos por algumas horas.

Quando os embriões estiverem no estágio adequado, transfira-os do suporte de uva para fita adesiva dupla face com um pincel. Agora, retire os embriões de suas cascas e alinhe-os sobre um bloco de ágar com seus lados ventrais voltados para cima. No centro, vemos uma lâmina com um retângulo de cera e um pedaço de fita adesiva dupla face em uma das extremidades. Inverta a fita adesiva dupla face sobre o bloco com os embriões alinhados e encoste-a nos embriões para transferi-los para a lâmina.

Eles estarão agora com a face dorsal voltada para cima imediatamente. Adicione PBS à área da lâmina delimitada pelo retângulo de cera, de modo a cobrir os embriões. A imagem superior mostra uma vista lateral da lâmina e a inferior mostra uma vista superior.

Corte uma fenda ao longo da membrana velame com uma agulha de dissecação de vidro. Fure os embriões na região cerebral, levante-os e organize-os em fileiras sobre o vidro. Em seguida, dissecione cada embrião para obter um filete.

No final do procedimento, você terá uma lâmina com fileiras de embriões de filet. Agora está pronta para fixação. Olá, sou Peter Lee, pesquisador no laboratório Kaizens da divisão de biologia do Caltech.

Olá, sou Ashley Wright, aluna de pós-graduação do Caltech no laboratório de Kaizen. Sou Kaizen, professor no Caltech, e meu grupo de pesquisa trabalha com o desenvolvimento do sistema nervoso em moscas-das-frutas. Hoje vamos mostrar um procedimento para dissecar embriões de opala vivos.

Utilizamos esses métodos para buscar ligantes de receptores órfãos. Fazemos isso realizando triagens em coleções de linhagens que superexpressam proteínas de superfície celular por meio de marcação de embriões vivos com proteínas de fusão de receptores. Também utilizamos este procedimento no laboratório para estudar fenótipos embrionários e conduzir triagens genéticas.

Realizei uma análise de deficiência para atos motores em fenótipos de orientação. Vamos começar. Peter vai mostrar como se faz.

Para começar, use uma espátula para colocar um ponto de pasta de levedura em uma placa de coleta de ovos com base em ágar de uva correspondente a cada um dos frascos de uma câmara de coleta de embriões. Em seguida, injete gás dióxido de carbono nos frascos de moscas para colocá-las para dormir. Transfira algumas centenas de moscas diretamente para a câmara de coleta.

Em seguida, cubra a câmara com a placa de coleta de ovos e pressione firmemente. Usando uma tira de fita adesiva de identificação com 20 polegadas de comprimento, amarre a câmara e a placa juntas, começando pelo centro da placa de ágar. A fita irá sobrepor na placa de coleta de ovos. Após as moscas acordarem, incube em temperatura ambiente, na escuridão, por duas ou três horas em posição horizontal. Após a incubação, bata levemente para derrubar as moscas e substitua a placa de coleta.

Se houver menos de 100 embriões em cada setor da placa removida, continue realizando coletas de duas horas até que quantidade suficiente de embriões tenha sido coletada. Os embriões coletados podem ser agrupados de acordo com as especificações no protocolo escrito que acompanha.

Para envelhecer os embriões, coloque um pedaço úmido de papel-filtro circular de 90 milímetros na tampa de uma placa de Petri e posicione a placa de coleta com os embriões virada para baixo sobre ele. Incube a placa durante o tempo desejado e à temperatura desejada, prepare uma lâmina para estadiamento e classificação de embriões colocando fita adesiva dupla face sobre uma lâmina. Em seguida, coloque um bloco retangular de ágar de uva sobre a lâmina S.

O egger deve ser grande o suficiente para acomodar de cinco a dez fileiras de 10 a 15 embriões. Assim que os embriões atingirem o estágio desejado, remova-os do incubador. Transfira os embriões envelhecidos da placa de coleta para a fita adesiva dupla face.

Usando um pincel úmido, espalhe os embriões uniformemente sobre a fita. Sob um microscópio estereoscópico com fluorescência GFP, examine os embriões para verificar a expressão adequada de GFP, o que indica o genótipo. Neste experimento, a tipagem genética é realizada pela seleção de embriões que não apresentam expressão do marcador fluorescente GFP do cromossomo marcador "curly arm".

Como a genotipagem de embriões variará conforme o equilibrador utilizado, consulte o protocolo escrito acompanhante para obter mais informações sobre como realizar esta etapa. Em seguida, usando uma agulha de dissecação rombuda, cubra os embriões rolando-os suavemente sobre a fita adesiva dupla face. No estágio 16, o intestino se dividiu em três faixas.

Depois disso, o intestino começa a desenvolver faixas diagonais próximas à cauda e, em seguida, enrola-se, tornando o embrião mais nítido. Em seguida, use a agulha de dissecação para girar cada embrião sobre o córion ou sobre outros embriões. Evitando o contato com a fita, levante o embrião e transfira-o para o bloco de ágar de uva.

Alinhe os embriões revestidos sobre esta lâmina com suas faces dorsais contra a lâmina de ágar e as extremidades posteriores voltadas para baixo. Em seguida, coloque a lâmina em uma placa de Petri com papel de filtro úmido e incube os embriões à temperatura ambiente até atingirem a idade desejada. Para a dissecação, prepare uma lâmina para dissecação em vivo cortando um pequeno retângulo de fita adesiva dupla face. Coloque a fita próxima a uma das extremidades de uma lâmina super frost plus utilizando uma caneta de cera.

Desenhe um retângulo com a largura da lâmina e de 30 a 40 milímetros de comprimento ao redor da fita. Deve haver aproximadamente três milímetros de espaço entre a cera e a fita. Em seguida, transfira os embriões da placa de Petri para a fita invertendo a lâmina e abaixando-a suavemente sobre os embriões alinhados, de modo que a fita entre em contato com eles.

Os embriões devem ser orientados com as extremidades posteriores para baixo. Após a transferência, posicione os embriões com o lado dorsal voltado para cima no lâmina e adicione imediatamente um XPBS sobre os embriões para preencher o retângulo de cera usando uma agulha de dissecação de vidro, confeccionada em um puxador de agulhas, semelhante a uma agulha de injeção. Corte ao longo da linha média dorsal, iniciando pela extremidade posterior do embrião.

Agora, fure a extremidade anterior do embrião e levante-o. Começando pela base, transfira o embrião para o lado direito da fita adesiva, mantendo-o no tampão. Continue dissecando e transferindo embriões, formando uma fileira ordenada de embriões na lâmina que corresponda a cada fileira no bloco de agarose.

Usando a agulha de dissecação, empurre suavemente as abas da parede corporal para baixo, sobre a lâmina. Evite esticar ou remover material de sua superfície. A agulha deve tocar apenas os cantos anterior e posterior nas bordas dorsais da parede corporal.

Como os axônios motores não se estendem até aqui. Dorsalmente, evite tocar as agulhas do lâmina, pois ela quebrará após todos os embriões serem transferidos e fixados no lâmina. Remova o intestino de cada embrião cortando os quatro intestinos da região cerebral e puxando todo o intestino para longe do embrião.

Desloque o intestino posterior para fora sobre a lâmina. Após a conclusão de todas as dissecações, use dois bastões de vidro para adicionar simultaneamente formaldeído a 5% em temperatura ambiente em um dos cantos do retângulo de cera e remover a solução do canto oposto. Troque a solução fixadora três vezes, utilizando um volume total de cerca de seis mililitros.

Incube os embriões na solução fixadora por 45 minutos. É muito importante não permitir que o menisco entre em contato com os embriões, pois isso os destruirá. Use uma pipeta Pasteur para remover a maior parte da solução fixadora.

Lave com PBS 3 vezes utilizando o método da pipeta Pasteur dupla. Em seguida, lave com PBT três vezes para permeabilizar os embriões. Este passo também torna os embriões menos sensíveis ao menisco.

Após a lavagem final, remova cuidadosamente o PBT inclinando a lâmina e tocando brevemente com um lenço de papel Kim na borda da área delimitada pela cera para remover a solução em excesso. Usando um pipetador pré-carregado, adicione imediatamente 200 microlitros de solução bloqueadora e incube por 10 a 30 minutos. À temperatura ambiente, remova a solução bloqueadora utilizando um lenço de papel Kim.

Em seguida, adicione imediatamente 200 microlitros do anticorpo primário desejado diluído na solução bloqueadora. Coloque a lâmina em uma placa umidificada e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Neste experimento, o anticorpo monoclonal 1D four é utilizado para marcar axônios motores.

No dia seguinte, retire as placas de quatro graus Celsius e lave os embriões três vezes em plataforma agitadora com PBT, por pelo menos 15 minutos a cada lavagem. Em todos os passos de lavagem, certifique-se de que há quantidade suficiente de PBT para imergir completamente a lâmina durante a agitação. Após a lavagem dos embriões, bloqueie a lâmina como anteriormente.

Após o bloqueio, adicione imediatamente 200 microlitros de anticorpo secundário e solução de bloqueio e incube por duas horas à temperatura ambiente; aqui, um secundário Alexa 488 conjugado com anti-US é usado em conjunto com Rodine Phin para marcar as fibras musculares. Novamente, lave três vezes com PBT na plataforma agitadora, com pelo menos 15 minutos por lavagem.

Transfira as lâminas para uma bandeja diferente para remover o detergente residual. Em seguida, lave duas vezes com PBS durante cinco minutos. Retire a lâmina do PBS e a maior parte do PBS remanescente do poço com uma toalha química, e adicione imediatamente 500 microlitros de glicerol 70%.

Como o glicerol possui o mesmo índice de refração do embrião, realizar este passo tornará a coloração mais visível. Deixe os embriões transparentes por duas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o glicerol com um lenço de papel absorvente. A remoção de quase todo o glicerol achatará os embriões, enquanto a remoção de menor quantidade resultará em uma estrutura mais tridimensional.

Uma vez removido o glicerol, coloque uma lamínula número um. Os embriões estão prontos para a obtenção de imagens; embriões dissecados e corados podem ser visualizados por microscopia de imunofluorescência. Aqui, um embrião dissecado foi corado com o anticorpo de marcação de axônios motores 1D quatro.

Esta imagem é semelhante em aparência às imagens mais comumente observadas nas quais a imunohistoquímica com HRP foi utilizada para visualização por imunofluorescência. É possível obter imagens de maior qualidade nas quais os detalhes dos ramos dos axônios motores são visualizados com mais clareza. A coloração dupla com rho dominada por fenil marcada, que se liga à actina, permite a visualização simultânea dos músculos.

Isso fornece uma imagem mais clara da camada e organização muscular do que a obtida com a coloração por HRP. Aqui, os axônios motores 1D four são mostrados em verde e o músculo Fein é mostrado em vermelho. Acabamos de demonstrar como dissecar embriões vivos de drosófila a partir de coleções de linhagens mutantes. Ao realizar esses procedimentos, é importante começar com linhagens fáceis, como lio, armadillo, GFP, linhagens balanceadas, e fazer apenas algumas linhagens por vez.

À medida que você ganha mais experiência e agilidade nas dissecações, pode realizar até 10 linhagens por dia, o que permitirá triar uma coleção de cerca de 200 linhagens mutantes em um período de aproximadamente 20 dias. Assim, este é realmente um procedimento muito eficiente quando você se torna experiente na execução de todas as etapas. É isso, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.