Imagem On-chip sem lente de Células fornece uma nova ferramenta de alta capacidade: Biologia Celular e Diagnóstico Médico

Neste vídeo, é apresentada a prova de conceito de uma plataforma de imagem em chip com lista de lentes denominada Lucas. Lucas é a sigla para plataforma de matriz de monitoramento de células com lista de lentes e campo de visão ultra amplo baseada em imagem de sombra. Diferentemente das configurações convencionais de imagem, a plataforma Lucas não requer objetivas de microscópio nem outros componentes ópticos volumosos.

Para Lucas, o espécime de interesse é posicionado sobre uma lâmina de microscópio e é suavemente sanduichado por um cubre-objeto idêntico. Utilizando uma caneta de vácuo, a amostra é carregada na região ativa do arranjo de sensores optoeletrônicos. A plataforma de imagem então registra as sombras ou os hologramas digitais tipo lente de cada célula de interesse dentro do seu campo de visão.

O processamento digital automatizado dessas sombras celulares pode determinar o tipo, a contagem e as posições relativas das células dentro da solução. O campo de visão pode abranger até 18 centímetros quadrados, com uma profundidade de campo de cerca de cinco milímetros. As imagens de difração adquiridas são então processadas digitalmente por um algoritmo de decisão desenvolvido sob medida, permitindo tanto a caracterização quanto a identificação de células ou partículas-alvo.

Lucas oferece uma plataforma miniaturizada que reduz os custos e aumenta significativamente a produtividade para experimentos baseados em imagem, tornando-a compatível com tecnologias avançadas e de ponta em microfluídica e pesquisa biológica. Olá, sou do Laboratório de Bio e Nano da Universidade da Califórnia, Los Angeles, do Departamento de Engenharia Elétrica, e eu sou Anthony Erlinger, também do laboratório de Nanofotônica e Biotecnologia. Hoje vamos mostrar um procedimento para imageamento em alta produtividade e sem lentes de uma solução heterogênea de SA, como uma amostra de sangue total.

Este procedimento em nosso laboratório utiliza uma técnica de imagemagem inovadora, que chamamos de plataforma de monitoramento de matriz celular de campo ultra amplo baseada em lista de lentes por imagem de sombra, que abreviamos como Lucas. Vamos então começar. Para iniciar o processo, obtenha três mililitros de sangue total e microesferas de poliestireno com diversos diâmetros, como cinco, 10 e 20 micrômetros, e leve-as à temperatura ambiente por 30 minutos.

Usando uma pipeta serológica, adicione dois mililitros de meio líquido RPMI 1640 clássico como diluente em um tubo estéril de polipropileno de cinco mililitros. Após um período de sedimentação de 30 minutos, retire 10 microlitros de espécime de eritrócitos do fundo do tubo de coleta de sangue total e transfira para a solução de RPMI. Adicione um volume total de 20 microlitros de microesferas de poliestireno à diluição de eritrócitos em RPMI e agite a solução celular pipetando suavemente. Transfira de cinco a 15 microlitros da solução heterogênea para uma lamínula utilizando pinça.

Coloque um segundo lamínula idêntico sobre a solução. A amostra deve ficar uniformemente sanduichada entre os dois lamínulas. Em seguida, utilizando uma pipeta a vácuo, carregue a amostra na região ativa do arranjo de sensores para imageamento.

Em seguida, prepare o reagente de coloração aquoso combinando 0,1% tamponado como SNY e solução diluída de azul de metileno novo ou NMB numa proporção volumétrica de dois para um; consulte o protocolo escrito anexo para obter detalhes sobre o preparo das soluções de SNY e azul de metileno pum. Em seguida, em um béquer de polipropileno, combine o reagente de coloração ACOA com a amostra de sangue total numa proporção volumétrica de um para um, utilizando um agitador magnético durante dois minutos. Incube então por mais 10 minutos à temperatura ambiente após a solução ter sido incubada com 1,99 mililitros de solução líquida clássica RPMI 1640 em um tubo de polipropileno de cinco mililitros.

Em seguida, transfira 10 microlitros da solução sanguínea corada para o RPMI para obter uma proporção volumétrica de um para 200. Em seguida, vortexe a solução por 30 segundos e pipete de 10 a 100 microlitros da solução celular corada entre lamínulas ou dentro de um reservatório microfluídico. Depois, utilizando uma pipeta a vácuo, posicione o espécime na região ativa do arranjo de sensores.

A plataforma Lucas utiliza uma matriz de sensores optoeletrônicos para gravar digitalmente hologramas de células sem lente. Para essa finalidade, dispositivos acoplados por carga, ou CCDs, são utilizados a fim de permitir iluminação com comprimento de onda ajustável, um monocromador com lâmpada de xenônio juntamente com uma fibra de sílica fundida de grau padrão, que consiste em um feixe de fibras e um orifício com diâmetro de aproximadamente 100 micrômetros localizado a cerca de cinco a 10 centímetros acima da superfície do sensor, podendo ser usado para comprimento de onda ajustável. A iluminação fornece uma plataforma flexível na qual as assinaturas holográficas das células podem ser ajustadas com precisão e assinaturas digitais híbridas podem ser sintetizadas pela combinação de mais de um comprimento de onda, a fim de melhorar a relação sinal-ruído e o contraste da imagem Lucas.

Para uma melhor caracterização, amostras de precisão posicionadas entre duas lamínulas são colocadas na região ativa do arranjo de sensores, iluminadas uniformemente pela fonte de luz. Os hologramas de difração de cada célula ou microobjeto presentes em uma solução heterogênea incidem sobre o arranjo de sensores, formando uma imagem Lucas. As imagens de difração Lucas adquiridas são processadas por um algoritmo de decisão desenvolvido especialmente, que utiliza uma biblioteca estatística de imagens de difração para a caracterização e identificação automatizadas de células-alvo ou microobjetos.

Esta figura mostra uma imagem convencional com objetivo de 40x de uma solução heterogênea contendo microesferas de poliestireno e hemácias com diâmetros de cinco, 10 e 20 micrômetros. A morfologia tridimensional, o índice de refração e a complexidade intercomp. dessas partículas são todos diferentes entre si.

Algumas dessas características podem ser distinguidas em um microscópio convencional, mas em um campo de visão muito limitado, inferior a 0,5 milímetro quadrado na plataforma Lucas. Todas essas micropartículas exibem padrões holográficos exclusivamente diferentes, como uma impressão digital. Portanto, podem ser caracterizadas sem qualquer ambiguidade com base em suas texturas 2D.

Lucas pode monitorar um campo de visão ultra amplo que pode ser ampliado até 10 a 20 centímetros quadrados. Várias ordens de grandeza maiores do que os microscópios padrão baseados em lentes. Esta é uma imagem com objetivo de 40 x de uma amostra de sangue total corada utilizando a plataforma Lucas.

As características internas dos glóbulos brancos corados variam eficientemente mediante a modificação do índice de refração e das propriedades de espalhamento dos núcleos celulares. Padrões distintos de difração de cada célula individual são registrados pelo arranjo de sensores. Isso demonstra outra vantagem da plataforma Lucas como uma ferramenta poderosa para citometria e diagnóstico na assistência médica imediata.

Como uma plataforma totalmente automatizada para a caracterização rápida de células de interesse, as imagens de difração de Lucas são processadas digitalmente usando um software de decisão desenvolvido sob medida. Nesta figura, uma mistura heterogênea de hemácias e microesferas é processada pela interface. O algoritmo é robusto na detecção de regiões de alta densidade, bem como de partículas com baixa relação sinal-ruído, como as microesferas de três micrômetros.

Uma imagem processada na interface personalizada Lucas é mostrada aqui. O software permite a entrada de várias especificações, como o tamanho do pixel do sensor ou o comprimento de onda da iluminação. Além disso, podem ser feitas seleções na imagem e padrões celulares podem ser definidos.

A contagem da amostra é realizada com base nesses dados e a imagem marcada é exibida ao usuário. Acabamos de mostrar como obter imagens e caracterizar células utilizando a plataforma de alto rendimento de Lucas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que os experimentos demonstrados podem ser aplicados a uma grande variedade de células e micropartículas.

Ele também permite a caracterização de células em campo ultra amplo e alto rendimento de uma solução heterogênea. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.