Name: Imagem On-chip sem lente de Células fornece uma nova ferramenta de alta capacidade: Biologia Celular e Diagnóstico Médico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a usar a plataforma Lucas para imagem sem lente de células em larga escala. Este método compacto e de baixo custo elimina componentes ópticos volumosos, permitindo diagnósticos médicos e biologia celular de alta capacidade em ambientes com recursos limitados.

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Aqui vamos discutir os procedimentos experimentais que estão envolvidos no LUCAS [1-3]. Para ilustrar a prova de conceito de LUCAS vamos descrever o processo de imagem para uma amostra de sangue total. A. Imagem Set-up O LUCAS plataforma de imagem exibe vantagens significativas para fornecer uma alternativa econômica e compacta para existentes citometria de ponto de atendimento médico e ferramentas de diagnóstico, especialmente para ambientes com recursos limitados. Em vez de detectar a imagem das células, em vez LUCAS captura hologramas digitais das células que são criadas pela interferência da luz espalhada a partir de cada célula com a luz de fundo. Controle cuidadoso da coerência parcial espacial dos iluminação é fundamental para permitir a gravação holográfica. 1. Array de Sensor Digital A plataforma LUCAS utiliza um conjunto de sensores optoeletrônicos para gravar digitalmente hologramas célula individual. Para este fim, cobrado dispositivos casal (CCD; Modelos Amostra: KAI-11002, KAF-39000, da Kodak) ou complementary metal-oxide semiconductor-chips (CMOS, Modelo Amostra: MT9P031, Micron) pode ser usado. Tamanhos de pixel para a Kodak cobrado dispositivos casal, KAI-11002, KAF-39000, e os sensores de imagem CMOS Micron são 9 mM, 6,8 mM e 2,2 mM, com um FOV ativa de 10 cm2, 18 cm2, mm2 e 24,4, respectivamente. [1-2]. 2. Fonte de Luz Ao contrário da maioria das outras modalidades de imagem microscópica, LUCAS não requer um laser e, portanto, até mesmo um simples diodo emissor de luz (LED) pode ser usado para a iluminação. A fim de permitir a iluminação de comprimento de onda sintonizáveis, também podemos utilizar um monocromador com uma lâmpada Xenon (Cornerstone T260, Newport Corp), juntamente com um padrão de fibra de sílica fundida grade que consiste de um feixe de fibras (77564, Newport) e pinhole de ~ 100 mM de diâmetro localizado na ~ 5-10 cm acima da superfície do sensor. Esta configuração de iluminação ajustável de comprimento de onda fornece uma plataforma flexível onde as assinaturas holográfica das células pode ser ajustada, e híbridos assinaturas digitais podem ser sintetizados para melhorar a relação sinal-ruído para melhor caracterização precisão e especificidade. [3] B. Preparação da Amostra e Imagem A prova de conceito de LUCAS baseada no chip de imagem será demonstrado através de uma solução heterogênea, conforme descrito abaixo. Um protocolo semelhante poderia ser aplicada para vários outros tipos de células [1-3]. 1. Diluição de sangue total e preparação da solução heterogênea <ol><li> Para iniciar o processo, obter uma amostra de sangue total e microesferas de poliestireno de vários diâmetros (5, 10 e 20 mM. Duke Científica), e trazer todos eles para a temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2 mL de RPMI 1640 classic meios líquidos (Fisher Scientific) como diluente em um tubo de polipropileno estéril 5 mL. </li><li> Após incubar a amostra de sangue total por 30 minutos, pipetar até 10 L de amostra de eritrócitos sedimentados e transferi-lo para a solução de RPMI. </li><li> Adicionar um volume total de 20 microesferas de poliestireno mL em RPMI diluição dos eritrócitos, e agitar a solução da célula com cuidado pipetando ou usando agitador magnético com uma barra de agitação. </li><li> Coloque um volume total de 5-15 mL de solução heterogênea em uma tampa de deslizamento e colocar um segundo, lamínula idênticos sobre a solução usando uma pinça. A amostra deve ser imprensada entre as duas lamínulas uniformemente. </li><li> Em seguida, usando uma caneta de vácuo (NT57-636, Edmund Optics) de carga da amostra para a região ativa do conjunto de sensores de imagem. </li></ol> 2. Manchas de sangue total <ol><li> Começando com a preparação de uma mistura de 0,1% tamponado Eosina Y e Solução de metileno diluído New usando o poder tipo puro Eosina Y (MW = 691,85 Organics, Acros), zinco-free pura New corante azul de metileno (MW = 347,90 Organics, Acros), Monohydrate e oxalato de potássio (ACS Reagente 99,0%, Acros Organics), cada solução é purificado com um tamanho de 0,45 mM poros do filtro Syringless (Whatman) para a coloração de células brancas do sangue aquoso. </li><li> Então, mexa delicadamente um reagente coloração dissolvido aquosa com a amostra de sangue total em uma relação de volume de 1:1 em um copo de polipropileno, utilizando um agitador magnético por 2 minutos e incubar por 10 minutos. </li><li> Transferência de uma solução manchadas de sangue de 50 mL em um tubo de polipropileno 5 mL e diluir com solução de RPMI 1640 classic líquido (Fisher Scientific) de 1,95 mL para adquirir uma relação de volume de 1:200. Em seguida, vortex, a diluição por 30 segundos. A taxa de diluição diferentes também podem ser introduzidos nesta fase. </li><li> Pipetar uma solução célula corada de 10-100 mL entre lamínulas ou dentro de um reservatório microfluídicos. Em seguida, usando uma caneta de vácuo (NT57-636, Edmund Optics), coloque o espécime para a região ativa da matriz de sensor. </li></ol> RESULTADOS REPRESENTANTE ve_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: LUCAS permite a contagem exata ea diferenciação digital de várias células e micro-objetos com base em suas assinaturas 2D holográfico sem o uso de lentes, lasers ou outros componentes ópticos volumosos. Assinaturas características LUCAS de vários micro-objetos são ilustrados nesta figura e são comparados com uma imagem de microscópio convencional obtida com uma lente objetiva de 40X. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1650/1650Fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: (Esquerda) imagem Raw de uma mistura heterogênea contendo células vermelhas do sangue, 10um, 5um e 3 partículas um. (Direito) totalmente automatizado resultados da caracterização LUCAS para o mesmo campo de visão são ilustradas. Note que o algoritmo de decisão é robusto para caracterizar regiões de alta densidade, bem como partículas com baixo sinal-ruído, tais como as contas 3um. <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: O LUCAS interface personalizada é ilustrado. Baseados em Java software LUCAS permite entradas para várias condições experimentais, tais como o tamanho do pixel do sensor ou o comprimento de onda da luz. Seleção de um campo específico de vista sobre a imagem também pode ser feita e os padrões de célula-alvo pode ser definido pelo usuário para construir uma biblioteca sombra estatística celular. A imagem adquirida LUCAS pode então ser caracterizado com base em dados de treinamento (ou seja, a biblioteca sombra de células) e da imagem marcada (contados) é exibida para o usuário. Estatísticas dos resultados contam também são armazenados como um arquivo XML para análise posterior.

<ol><li>Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Lensfree+Holographic+Imaging+for+On-Chip+Cytometry+and+Diagnostics%22%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">"Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics".</a> Lab Chip. , (2009).</li>
<li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22High-throughput+Imaging+and+Characterization+of+a+Heterogeneous+Cell+Solution+on+a+Chip%22+%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">"High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" .</a> Biotechnology and Bioengineering. , (2008).</li>
<li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Multi-color+LUCAS%3A+Lensfree+on-chip+cytometry+using+tunable+monochromatic+illumination+and+digital+noise+reduction%22%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">"Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction".</a> Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).</li>
</ol>

Temos ilustrado que a plataforma LUCAS pode contar com precisão e identificar micro-objects/cells vários em um chip com base em suas assinaturas holográfico, e fornece uma ferramenta promissora para o ponto de atendimento diagnósticos médicos e de alto rendimento biologia celular. Com precisão, a fim de processar os padrões registrados holográfico, implementamos um software customizado decisão LUCAS. Este algoritmo, que utiliza um banco de dados de difração de imagem estatística criado por formação de imagens LUCAS, ide...

<table><tbody><tr><td>Dispositivo acoplado por carga (CCD)</td><td>KODAK</td><td>KAI-11002</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo acoplado por carga (CCD)</td><td>KODAK</td><td>KAF-39000</td><td></td></tr><tr><td>Semicondutor complementar de óxido metálico (CMOS)</td><td>Micron</td><td>MT9P031</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de xenônio</td><td>Newport Corp.</td><td>Cornerstone T260</td><td></td></tr><tr><td>Caneta de vácuo</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT57-636</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de 5, 10 e 20 &amp;mu;m</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4000 Series</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>1640</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y pura</td><td>Acros Organics</td><td>MW=691.85</td><td></td></tr><tr><td>Corante Azul de Metileno Novo (NMB)</td><td>Acros Organics</td><td>MW=347.90</td><td></td></tr><tr><td>Oxalato de potássio mono-hidratado</td><td>Acros Organics</td><td>99,0% Reagente ACS</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem on-chip sem lente de células fornece uma nova ferramenta de alta capacidade: biologia celular e diagnóstico médico

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Óptico convencional microscópios células de imagem pelo uso de lentes objetivas que trabalham em conjunto com outras lentes e componentes ópticos. Embora bastante eficaz, esta abordagem clássica tem algumas limitações para a miniaturização da plataforma de imagem para torná-lo compatível com o estado avançado da arte em microfluídica. Neste relatório, nós apresentamos detalhes experimental de um conceito de imagem sem lente no chip denominado LUCAS (<strong<em&gt; L</em</strong&gt; Ensless<strong<em&gt; U</em</strong&gt; Ltra-wide campo de visão<strong<em&gt; C</em</strong&gt; Monitoramento ell<strong<em&gt; A</em</strong&gt; Rray plataforma baseada em<strong<em&gt; S</em</strong&gt; Hadow imagem) que não requer quaisquer objectivos microscópio ou outros componentes ópticos volumosos para a imagem de uma solução heterogênea de células sobre um campo ultra-wide de vista que pode abranger tão grande quanto ~ 18 centímetros<sup&gt; 2</sup&gt;. Além disso, ao contrário dos microscópios convencionais, LUCAS pode imagem uma solução celular heterogêneo de juros sobre uma profundidade de campo de ~ 5 mm sem a necessidade de recentrar o que corresponde a até ~ volume de amostra 9 mL. Esta plataforma de imagem registra a sombra (ou seja, sem lente hologramas digitais) de cada célula de interesse dentro do seu campo de visão e processamento digital automatizado destas sombras célula pode determinar o tipo, a contagem e as posições relativas de células dentro da solução. Porque não exige quaisquer componentes volumosos óptico ou mecânico estágios a verificação, ele oferece uma plataforma significativamente miniaturizados que, ao mesmo tempo reduz o custo, que é muito importante para ponto de atendimento, especialmente as ferramentas de diagnóstico. Além disso, a taxa de transferência de imagem desta plataforma é ordens de magnitude melhor do que microscópios ópticos convencionais, o que poderia ser extremamente valioso para high-throughput biologia celular-experimentos.

Lensfree imagens on-chip e caracterização de células é ilustrada. Esta abordagem on-chip imagens de células fornece uma ferramenta compacta e cost-effective para diagnósticos médicos e de alto rendimento aplicações de biologia celular, tornando-o especialmente adequado para locais de poucos recursos.

Imagem On-chip sem lente de Células fornece uma nova ferramenta de alta capacidade: Biologia Celular e Diagnóstico Médico

Os microscópios ópticos convencionais imageiam células por meio do uso de lentes objetivas que trabalham em conjunto com outras lentes e componentes ópticos. Embora sejam bastante...

Neste vídeo, é apresentada a prova de conceito de uma plataforma de imagem em chip com lista de lentes denominada Lucas. Lucas é a sigla para plataforma de matriz de monitoramento de células com lista de lentes e campo de visão ultra amplo baseada em imagem de sombra. Diferentemente das configurações convencionais de imagem, a plataforma Lucas não requer objetivas de microscópio nem outros componentes ópticos volumosos.Para Lucas, o espécime de interesse é posicionado sobre uma lâmina de microscópio e é suavemente sanduichado por um cubre-objeto idêntico. Utilizando uma caneta de vácuo, a amostra é carregada na região ativa do arranjo de sensores optoeletrônicos. A plataforma de imagem então registra as sombras ou os hologramas digitais tipo lente de cada célula de interesse dentro do seu campo de visão.O processamento digital automatizado dessas sombras celulares pode determinar o tipo, a contagem e as posições relativas das células dentro da solução. O campo de visão pode abranger até 18 centímetros quadrados, com uma profundidade de campo de cerca de cinco milímetros. As imagens de difração adquiridas são então processadas digitalmente por um algoritmo de decisão desenvolvido sob medida, permitindo tanto a caracterização quanto a identificação de células ou partículas-alvo.Lucas oferece uma plataforma miniaturizada que reduz os custos e aumenta significativamente a produtividade para experimentos baseados em imagem, tornando-a compatível com tecnologias avançadas e de ponta em microfluídica e pesquisa biológica. Olá, sou do Laboratório de Bio e Nano da Universidade da Califórnia, Los Angeles, do Departamento de Engenharia Elétrica, e eu sou Anthony Erlinger, também do laboratório de Nanofotônica e Biotecnologia. Hoje vamos mostrar um procedimento para imageamento em alta produtividade e sem lentes de uma solução heterogênea de SA, como uma amostra de sangue total.Este procedimento em nosso laboratório utiliza uma técnica de imagemagem inovadora, que chamamos de plataforma de monitoramento de matriz celular de campo ultra amplo baseada em lista de lentes por imagem de sombra, que abreviamos como Lucas. Vamos então começar. Para iniciar o processo, obtenha três mililitros de sangue total e microesferas de poliestireno com diversos diâmetros, como cinco, 10 e 20 micrômetros, e leve-as à temperatura ambiente por 30 minutos.Usando uma pipeta serológica, adicione dois mililitros de meio líquido RPMI 1640 clássico como diluente em um tubo estéril de polipropileno de cinco mililitros. Após um período de sedimentação de 30 minutos, retire 10 microlitros de espécime de eritrócitos do fundo do tubo de coleta de sangue total e transfira para a solução de RPMI. Adicione um volume total de 20 microlitros de microesferas de poliestireno à diluição de eritrócitos em RPMI e agite a solução celular pipetando suavemente. Transfira de cinco a 15 microlitros da solução heterogênea para uma lamínula utilizando pinça.Coloque um segundo lamínula idêntico sobre a solução. A amostra deve ficar uniformemente sanduichada entre os dois lamínulas. Em seguida, utilizando uma pipeta a vácuo, carregue a amostra na região ativa do arranjo de sensores para imageamento.Em seguida, prepare o reagente de coloração aquoso combinando 0,1% tamponado como SNY e solução diluída de azul de metileno novo ou NMB numa proporção volumétrica de dois para um; consulte o protocolo escrito anexo para obter detalhes sobre o preparo das soluções de SNY e azul de metileno pum. Em seguida, em um béquer de polipropileno, combine o reagente de coloração ACOA com a amostra de sangue total numa proporção volumétrica de um para um, utilizando um agitador magnético durante dois minutos. Incube então por mais 10 minutos à temperatura ambiente após a solução ter sido incubada com 1,99 mililitros de solução líquida clássica RPMI 1640 em um tubo de polipropileno de cinco mililitros.Em seguida, transfira 10 microlitros da solução sanguínea corada para o RPMI para obter uma proporção volumétrica de um para 200. Em seguida, vortexe a solução por 30 segundos e pipete de 10 a 100 microlitros da solução celular corada entre lamínulas ou dentro de um reservatório microfluídico. Depois, utilizando uma pipeta a vácuo, posicione o espécime na região ativa do arranjo de sensores.A plataforma Lucas utiliza uma matriz de sensores optoeletrônicos para gravar digitalmente hologramas de células sem lente. Para essa finalidade, dispositivos acoplados por carga, ou CCDs, são utilizados a fim de permitir iluminação com comprimento de onda ajustável, um monocromador com lâmpada de xenônio juntamente com uma fibra de sílica fundida de grau padrão, que consiste em um feixe de fibras e um orifício com diâmetro de aproximadamente 100 micrômetros localizado a cerca de cinco a 10 centímetros acima da superfície do sensor, podendo ser usado para comprimento de onda ajustável. A iluminação fornece uma plataforma flexível na qual as assinaturas holográficas das células podem ser ajustadas com precisão e assinaturas digitais híbridas podem ser sintetizadas pela combinação de mais de um comprimento de onda, a fim de melhorar a relação sinal-ruído e o contraste da imagem Lucas.Para uma melhor caracterização, amostras de precisão posicionadas entre duas lamínulas são colocadas na região ativa do arranjo de sensores, iluminadas uniformemente pela fonte de luz. Os hologramas de difração de cada célula ou microobjeto presentes em uma solução heterogênea incidem sobre o arranjo de sensores, formando uma imagem Lucas. As imagens de difração Lucas adquiridas são processadas por um algoritmo de decisão desenvolvido especialmente, que utiliza uma biblioteca estatística de imagens de difração para a caracterização e identificação automatizadas de células-alvo ou microobjetos.Esta figura mostra uma imagem convencional com objetivo de 40x de uma solução heterogênea contendo microesferas de poliestireno e hemácias com diâmetros de cinco, 10 e 20 micrômetros. A morfologia tridimensional, o índice de refração e a complexidade intercomp. dessas partículas são todos diferentes entre si.Algumas dessas características podem ser distinguidas em um microscópio convencional, mas em um campo de visão muito limitado, inferior a 0,5 milímetro quadrado na plataforma Lucas. Todas essas micropartículas exibem padrões holográficos exclusivamente diferentes, como uma impressão digital. Portanto, podem ser caracterizadas sem qualquer ambiguidade com base em suas texturas 2D.Lucas pode monitorar um campo de visão ultra amplo que pode ser ampliado até 10 a 20 centímetros quadrados. Várias ordens de grandeza maiores do que os microscópios padrão baseados em lentes. Esta é uma imagem com objetivo de 40 x de uma amostra de sangue total corada utilizando a plataforma Lucas.As características internas dos glóbulos brancos corados variam eficientemente mediante a modificação do índice de refração e das propriedades de espalhamento dos núcleos celulares. Padrões distintos de difração de cada célula individual são registrados pelo arranjo de sensores. Isso demonstra outra vantagem da plataforma Lucas como uma ferramenta poderosa para citometria e diagnóstico na assistência médica imediata.Como uma plataforma totalmente automatizada para a caracterização rápida de células de interesse, as imagens de difração de Lucas são processadas digitalmente usando um software de decisão desenvolvido sob medida. Nesta figura, uma mistura heterogênea de hemácias e microesferas é processada pela interface. O algoritmo é robusto na detecção de regiões de alta densidade, bem como de partículas com baixa relação sinal-ruído, como as microesferas de três micrômetros.Uma imagem processada na interface personalizada Lucas é mostrada aqui. O software permite a entrada de várias especificações, como o tamanho do pixel do sensor ou o comprimento de onda da iluminação. Além disso, podem ser feitas seleções na imagem e padrões celulares podem ser definidos.A contagem da amostra é realizada com base nesses dados e a imagem marcada é exibida ao usuário. Acabamos de mostrar como obter imagens e caracterizar células utilizando a plataforma de alto rendimento de Lucas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que os experimentos demonstrados podem ser aplicados a uma grande variedade de células e micropartículas.Ele também permite a caracterização de células em campo ultra amplo e alto rendimento de uma solução heterogênea. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biology

Biologia

Um sem lente no chip plataforma de microscopia fluorescente é demonstrado que pode objetos de imagem fluorescente através de uma ultra-wide campo de visão de, por exemplo,&gt; 0,6-8 cm2 com &lt;4μm resolução usando uma amostra de compressão baseada algoritmo de decodificação. Como um compacto e de campo amplo modalidade de imagem fluorescente on-chip poderia ser valioso para high-throughput citometria, raro de célula de pesquisa e análise de microarray.

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