Protocolo de Lise automatizado microfluídicos de sangue para Enriquecimento de células nucleadas circulantes
31 de dezembro de 2009
Um dispositivo automático microfluídicos foi desenvolvido para a circulação de enriquecimento de células nucleadas do sangue periférico, através de lise de eritrócitos que garante o isolamento de amostras de alta qualidade sem perda de células.
Para enriquecer células nucleadas circulantes a partir do sangue. O dispositivo microfluídico é primeiramente condicionado com um XPBS para eliminar bolhas, água desionizada e 2% de paraldeído em dois XPBS, que são então passados pelo dispositivo por meio de bombas de seringa antes do carregamento da amostra sanguínea. O sangue é então processado através do dispositivo microfluídico e, após o processamento da amostra, inclui-se a centrifugação e a remoção do sobrenadante.
Por fim, a amostra é analisada por citometria de fluxo para gerar gráficos de fax. Olá, sou William White do laboratório de Biotecnologia em Microescala do Departamento de Bioengenharia da Universidade de Wool. Hoje mostraremos a você um procedimento para o enriquecimento de células nucleadas circulantes por lise de sangue total por meio de microfluídica.
Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a inflamação em diversos processos patológicos, garantindo o enriquecimento de leucócitos e outras células nucleadas circulantes sem perda ou ativação. Vamos começar. Para iniciar este procedimento, encaixe o tubo de acesso com diâmetro ligeiramente maior que os orifícios de acesso do canal nas entradas e saídas.
Em seguida, para fornecer a interface entre macro e micro, acople uma agulha de seringa de calibre 30 à tubulação em cada uma das entradas. Depois, encha uma seringa de um mililitro com um XPBS, certificando-se de eliminar as bolhas. Conecte a seringa à entrada um e empurre suavemente a seringa manualmente até que o XPBS saia pela entrada dois.
Em seguida, prenda imediatamente a entrada dois com um clipe de papel comum. Continue empurrando a seringa até que uma solução XPBS alcance o orifício de saída do dispositivo microfluídico. Assim que a solução começar a fluir para fora da saída, prenda o tubo de saída com outro clipe de papel.
Continue empurrando a seringa de um mililitro até que um XPBS saia pela entrada três e prenda a porta da entrada três com um terceiro clipe de papel. O dispositivo microfluídico está agora completamente escorvado. Inicie a calibração das bombas de seringa com a bomba de seringa Harvard grande, configurando o diâmetro para 22,5 milímetros e a taxa de fluxo para 600 microlitros por minuto.
Para a pequena bomba de seringa Harvard, defina a configuração de diâmetro como 4,61 milímetros e a taxa de fluxo como 20 microlitros por minuto. Em seguida, encha uma seringa de 30 mililitros com água desionizada, aspirando a solução diretamente do tubo cônico de 50 mililitros.
Lembre-se de rotular a seringa, encha outra seringa de 30 mililitros com duas soluções de PBS-X 2% de paraformaldeído. Novamente, aspire diretamente de um tubo cônico e rotule a seringa. Agora, conecte a seringa contendo água à entrada dois e a seringa com paraformaldeído 2% em PBS-X à entrada três, certificando-se de que não haja bolhas presas na tubulação ou no dispositivo microfluídico.
Em seguida, remova as presilhas do segundo inlets, do terceiro inlets e do tubo de saída com todas as três seringas conectadas. Prossiga colocando as duas seringas grandes juntas na bomba de seringa Harvard grande e posicione a seringa de um mililitro na bomba de seringa Harvard pequena. Coloque o tubo de saída em um tubo cônico de coleta de resíduos de 50 mililitros.
Agora ligue a bomba de seringa Harvard grande que segura as seringas de 30 mililitros e deixe-a funcionar por um minuto. Verifique se não há bolhas nem vazamentos no dispositivo ou na tubulação. Em seguida, ligue a bomba de seringa Harvard pequena e deixe-a funcionar por mais um minuto também.
Verificação de bolhas e vazamentos. Pare as bombas após dois minutos. Como o dispositivo microfluídico já está pronto para ser usado com amostras de sangue, as amostras de sangue a serem analisadas foram coletadas conforme descrito no protocolo escrito acompanhante e são utilizadas dentro de uma hora após a coleta.
O primeiro tubo de sangue coletado é descartado para eliminar resultados falso-positivos. Remova a seringa de um mililitro da bomba de seringa pequena da Harvard, depois injete um XPBS da seringa de um mililitro, preenchendo a agulha da seringa. Para evitar a introdução de bolhas, encha uma seringa de um mililitro com 50 microlitros de um XPBS sem aprisionar quaisquer bolhas.
Em seguida, encha a seringa com 0,5 mililitros de sangue. Mantenha a seringa na posição vertical durante o enchimento para evitar a mistura do PBS com o sangue. A seguir, conecte a seringa contendo o sangue novamente à entrada um.
Remova qualquer fluido em excesso e monte a seringa verticalmente na pequena bomba de seringa Harvard. Tenha cuidado para não empurrar o sangue através da tubulação até o dispositivo. Remova a tubulação de saída do tubo de descarte e coloque-a em um tubo cônico de 50 mililitros limpo, acomodado em um recipiente com gelo.
Agora, ligue primeiro o interruptor de execução na bomba de seringa Harvard grande e deixe-a funcionar por um minuto. Em seguida, ligue a bomba de seringa Harvard pequena. A amostra começará a ser coletada a partir da tubulação de saída no tubo cônico de 50 mililitros.
Deixe a amostra de sangue na seringa de um mililitro percorrer completamente o dispositivo, o que leva aproximadamente 20 minutos. Em seguida, pare ambas as bombas. Agora que a corrida está concluída, centrifugue a amostra coletada por cinco minutos a 350 vezes G, à temperatura ambiente, com a frenagem desativada.
Remova o sobrenatante colocando a ponteira da pipeta no lado oposto ao pellet branco. Remova o máximo possível do sobrenatante, especialmente os detritos de células vermelhas, sem perturbar o pellet branco. Re-suspenda a amostra em um mililitro de tampão de fluxo contendo 1% de BSA e 2% de paraformaldeído em um XPBS, por meio de pipetagem.
Para cima e para baixo, transfira a amostra para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro, centrifugue a amostra coletada por cinco minutos a quatro vezes g. À temperatura ambiente, remova o sobrenadante com o máximo cuidado, como no passo anterior de centrifugação. Por fim, adicione um mililitro de tampão de fluxo e vortexe para ressuspender a amostra e prossiga para analisar a amostra por citometria de fluxo.
Agora mostraremos alguns resultados representativos na forma de gráficos de fax de uma amostra de sangue enriquecida pelo dispositivo microfluídico, com análise utilizando citometria de fluxo. A importância do enriquecimento por lise pode ser observada em um gráfico de fax onde as hemácias formam uma nuvem. O gráfico de dispersão produzido pelo protocolo de enriquecimento microfluídico é um gráfico limpo, com populações bem definidas de células nucleadas encontradas na circulação.
A região vermelha representa linfócitos, a verde representa monócitos, a azul representa granulócitos, e a região roxa ainda não foi caracterizada. A falha na remoção de detritos de hemácias no protocolo produz um agrupamento de eventos no gráfico de fax visto na região ciano. Populações de células podem ser visualizadas em gráficos de fax separados.
Linfócitos sustentados com CD três e CD quatro. Monócitos sustentados com CD 14 e granulócitos sustentados com CD 66 P. Acabamos de mostrar como configurar e executar uma amostra de sangue com o dispositivo microfluídico de lise sanguínea. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de executar a amostra de sangue imediatamente, sem permitir que o PBS se misture com o sangue antes de entrar no dispositivo, e evitar a introdução de bolhas nos canais do dispositivo.
É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Um dispositivo microfluídico automatizado foi desenvolvido para enriquecer células nucleadas circulantes a partir de sangue periférico por meio da lise de eritrócitos. Este método garante o isolamento de amostras de alta qualidade sem perda celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microfluídica
- Enriquecimento Celular
- Processamento de Amostras de Sangue
Contexto
- As células nucleadas circulantes são importantes para diversas aplicações biomédicas.
- Métodos tradicionais de enriquecimento celular podem levar à perda e degradação da amostra.
- As tecnologias microfluídicas oferecem controle preciso sobre a dinâmica dos fluidos.
- Este estudo apresenta um dispositivo inovador para o isolamento eficiente de células.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um dispositivo microfluídico para o enriquecimento de células nucleadas circulantes.
- Minimizar a perda celular durante o processamento da amostra.
- Melhorar a qualidade das amostras isoladas para aplicações posteriores.
Métodos Utilizados
- O dispositivo microfluídico é preparado com XPBS para eliminar bolhas.
- Água desionizada e paraformaldeído a 2% são introduzidos no dispositivo.
- As amostras de sangue são processadas através do dispositivo utilizando bombas de seringa.
- O pós-processamento inclui centrifugação e remoção do sobrenadante.
Resultados Principais
- O dispositivo enriqueceu com sucesso células nucleadas circulantes de amostras de sangue.
- Amostras de alta qualidade foram obtidas com perda mínima de células.
- A análise por citometria de fluxo forneceu caracterização detalhada das células isoladas.
- O método demonstrou reprodutibilidade e eficiência no enriquecimento celular.
Conclusões
- O dispositivo microfluídico automatizado é eficaz para o isolamento de células nucleadas circulantes.
- Essa abordagem pode ser aplicada em diversos contextos de pesquisa e clínicos.
- Trabalhos futuros podem focar na otimização do dispositivo para diferentes tipos de amostras.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A lise sanguínea automatizada em microfluídica permite o enriquecimento reprodutível de células nucleadas circulantes (CNCs) a partir de sangue total, reduzindo a variabilidade mediada pelo usuário e a perda de amostras. Isso favorece estudos confiáveis de monitoramento imunológico e de patogênese de doenças, fornecendo amostras prontas para citometria de fluxo com alta pureza. O protocolo aumenta a confiança preditiva em fluxos de trabalho de validação de alvos ao padronizar o isolamento de CNCs para análises funcionais subsequentes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação dos fenótipos de leucócitos e células endoteliais para esclarecer mecanismos imunológicos em modelos de doenças.
- Valor Operacional: Oferece enriquecimento padronizado de CNC sem perda seletiva, melhorando a reprodutibilidade entre réplicas experimentais.
- Valor Preditivo: Apoia a descoberta de biomarcadores ao preservar os estados celulares nativos para citometria de fluxo e ensaios funcionais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera populações consistentes de CNCs para o desenvolvimento de ensaios, minimizando variáveis confundidoras provenientes de detritos eritrocitários.
- Valor Operacional: Automatiza etapas de lise e lavagem, reduzindo o tempo de manipulação e a variabilidade técnica no preparo de amostras.
- Prontidão para Ensaios: Fornece CNCs fixados e ressuspendidos, compatíveis com citometria de fluxo e painéis de marcação multiplex.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a dinâmica das células imunes periféricas aos mecanismos da doença por meio da análise quantitativa de CNC.
- Valor Operacional: Permite amostragem longitudinal com mínimos artefatos de processamento, apoiando a continuidade pré-clínica para clínica.
- Mitigação de Riscos: Reduz sinais falsos provenientes de hemácias residuais, melhorando a integridade dos dados em estudos farmacodinâmicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere nos fluxos de trabalho de descoberta inicial a pré-clínicos, fornecendo uma entrada padronizada para perfilagem imune e validação funcional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante o isolamento de CNCs viáveis para análise de vias e estudos de engajamento de alvos.
- Triagem: Fornece entradas celulares reprodutíveis para triagem de ensaios, aumentando a confiança na transição de acertos para lideranças.
- Análises: Permite resolução quantitativa em gráficos de dispersão para citometria de fluxo multiparamétrica, facilitando o direcionamento de populações e a quantificação de subconjuntos.
- Pesquisa Translacional: Conecta o monitoramento imunológico baseado em sangue a modelos pré-clínicos de doenças por meio da recuperação consistente de CNCs.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para monitoramento imunológico em diversas áreas terapêuticas e indicações de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista decorrente de artefatos no preparo da amostra.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e escalabilidade do processamento de sangue entre laboratórios e locais distintos.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de prosseguimento ou interrupção do projeto ao fornecer dados confiáveis de biomarcadores imunológicos no início da fase de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em leituras funcionais reprodutíveis derivadas de CNC.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de dispositivos microfluídicos, calibração de bombas de seringa e configuração de citometria de fluxo.
- Depende do acesso a bombas de seringa, chips microfluídicos, centrífugas e citômetros de fluxo.
- Necessita treinamento padronizado para evitar a introdução de bolhas e garantir o escorvamento e o carregamento de amostras consistentes.
- A adaptação a anticoagulantes alternativos ou volumes de amostra diferentes pode exigir ajustes na taxa de fluxo e nas dimensões dos canais.
- As limitações práticas incluem o risco de entupimento do dispositivo com amostras de alto hematócrito e a necessidade de processamento imediato das amostras para prevenir alterações ex vivo.
