Name: Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: Aprenda a gravar respostas de flash de cones de camundongo usando eletrodo de sucção. Este método demonstra dissecação de retina e aquisição de registros de célula única para estudo da fisiologia de fotorreceptores.

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Suportado pelo Prémio Carreira de Desenvolvimento de Pesquisa para prevenir a cegueira, NIH conceder EY 019.312, e concessão irrestrita de Pesquisa para prevenir a cegueira e EY 02.687 (Departamento de Oftalmologia &amp; Visual Sciences da Universidade de Washington).

Fazendo eletrodos <ol><li> Fazer a gravação usando eletrodos de um puxador de micropipeta e polonês os eletrodos com filamento de aquecimento sob o microscópio. Para mouse gravação de sucção cone de uma única célula, o diâmetro interno da ponta do eletrodo é de cerca de M 6-7. </li><li> Prepare eletrodos de referência. Pesar agar 1% em água destilada. Derreta a solução ágar-ágar em banho de água quente. Preencha as pipetas de vidro (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) com 1% agar usando seringa. Solidificar o ágar em temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Cortar as pipetas em metades usando uma faca de diamante. </li><li> Mergulhe os eletrodos de referência na solução de referência para pelo menos 24 horas a 4 ° C. </li></ol> Configurando o experimento <ol start="5"><li> Escuro adaptar um rato em uma gaiola preta durante a noite. </li><li> Preparar 100 mL de solução de referência e uma solução de perfusão L (veja abaixo) e filtrar a solução. </li><li> Dissolver 0,1% BSA e 10 mM de glicose em 20 mL de solução de referência. </li><li> Calibrar a intensidade de luz do estimulador óptico utilizando fotômetro. </li><li> Monte a câmara de gravação no palco do microscópio invertido. </li><li> Solução da bolha da perfusão com 95% O 2 / 5% CO 2, incubar em banho-maria 40 ° C para aumentar a solubilidade de CO 2. A solução flui da garrafa para a câmara de gravação passando por um resistor de cerâmica aquecendo-a 36-38 ° C. O aquecedor deve estar localizado o mais próximo da câmara de gravação possível, de preferência na fase do microscópio. </li><li> Ajuste o regulador de fluxo de um fluxo de cerca de 1-1,5 mL / min. </li><li> Preencher o eletrodo de registro com a solução de referência. Insira o eletrodo em um porta-eletrodo. Certifique-se que não há bolhas no eletrodo. Montar o suporte no headstage do amplificador. Conecte o seu titular a um dispositivo de sucção, que é construído ligando tubo parcialmente cheio com óleo mineral ao lado da porta do porta-eletrodo. A outra extremidade do tubo é conectado a um pequeno reservatório de óleo mineral, para que a pressão pode ser aplicada por via oral. </li><li> Conecte o eletrodo de referência para o outro pólo da headstage. Vincular o casal térmica (TC) para o eletrodo de referência. Certifique-se que as pontas de eletrodos e TC estão juntos para que a leitura da temperatura é tida como próxima da célula como possível. </li><li> Ligue a iluminação por infravermelhos para visualizar o eletrodo. O eletrodo é visto pela câmera de infravermelho conectado a um monitor. Centro da imagem o eletrodo no campo visual e do monitor usando um micro-manipulador. </li><li> Ajustar a posição do próximo da ponta do eletrodo de referência (2-4 mm) para a ponta do eletrodo de gravação. </li><li> Ajustar a tensão DC para o aquecedor de modo que a temperatura da solução é de cerca de 36-38 ° C. </li><li> Executar um teste de vedação para verificar a resistência do eletrodo de registro, normalmente cerca de 900 kW. </li></ol> Isolar a retina do rato <ol start="18"><li> Sob luz vermelha ofuscante, euthanize o mouse de adaptação ao escuro com CO 2 e deslocamento cervical. Marcar o globo ocular com a ponta de uma tocha de metal líquido, cauterização o ponto mais dorsal da esclera ligeiramente. Enuclear do globo ocular usando uma tesoura. Todos os procedimentos subseqüentes são realizadas sob a luz infravermelha. </li><li> Hemisect os globos oculares em microscópio com iluminação infravermelha e conversores de imagem. </li><li> Remova a córnea ea lente. Remover o máximo do vítreo possível. </li><li> Para gravar M cone-respostas, remova a parte ventral da ocular 4 com uma lâmina de barbear a julgar pela marca cautério. </li><li> Descasque a retina da camada de epitélio pigmentar. </li><li> Achatar a retina e colocá-lo na parte inferior da placa de Petri cheia de 1-2 mL solução de referência. </li><li> Fatia da retina em pequenos pedaços finos usando uma lâmina de barbear e incube a preparação em uma caixa à prova de luz saturada com oxigênio puro. </li></ol> Gravações <ol start="25"><li> Desligue o aquecedor temporariamente. Mudar o fluxo de perfusão a uma tubulação de desvio para evitar que a câmara de secagem. </li><li> Escorra a maioria da solução na câmara usando um pedaço de tecido Kimwipe. Transferir a suspensão retina para a câmara de gravação usando uma pipeta de vidro. </li><li> Aguarde cerca de 2 minutos até as fatias de retina sossegar. Mudar a perfusão de volta. Ligar o aquecedor. </li><li> Ligue iluminação por infravermelhos para visualizar a preparação. Busca de um pedaço de retina deitado na câmara com segmentos fotorreceptoras exterior saindo (ver figura exemplo). Desenhar segmentos interior suavemente o eléctrodo por sucção. Nesta configuração, vários núcleos e segmentos internos devem ser atraídos para o eletrodo. Registre a photoresponse a um flash brilhante para testar se um segmento de cone interior é no eletrodo e se a célula é curartua, a julgar pela cinética de resposta e amplitude. </li><li> Inferior do reservatório mineral de aplicar uma ligeira pressão negativa para a ponta do eletrodo para ajudar a segurar o segmento interno no eletrodo. </li><li> Registro de teste flash-respostas de dim com a intensidade luminosa, uma vez por celular bom é encontrado. Flashes de teste são fornecidos a partir de um estimulador calibrado óptica 5. Flash intensidade e comprimento de onda são controladas por um conjunto de filtros de densidade neutra e filtros de interferência de banda estreita, respectivamente. Teste de flash duração (20 ms) é controlado por computador-driven persianas. </li></ol> Soluções <ol><li> Solução de perfusão do mouse: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinato, 0,5 mM Na glutamato, 0,02 mM EDTA, e 10 mM de glicose. </li><li> Rato solução eletrodo de registro: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

De uma única célula de gravação de sucção de células fotorreceptoras foi desenvolvido três décadas atrás. Ele nos permite gravar trans-membrana mudança corrente induzida pela estimulação luminosa sem penetrar a membrana celular. Por causa da adesão celular de alta, é difícil isolar vara única saudável e cone da retina do rato como retina de anfíbios e é difícil encontrar cones individuais devido ao baixo percentual (3%) e tamanho pequeno. O segmento interno--in (IS-in) método de gravação supera esta dificuldade actual d...

gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Haste e cone fotorreceptores na retina são responsáveis ​​pela detecção de luz. Na escuridão, nucleotídeo cíclico-gated (CNG) no segmento de canais externos são abertos e permitem o fluxo constante cátions para o interior através da membrana, despolarizando a célula. Exposição à luz provoca o fechamento dos canais de CNG, bloqueia o fluxo para dentro cação atual, e, portanto, resulta em hiperpolarização celular. Com base na polaridade de fotorreceptores, um método de gravação de sucção foi desenvolvido em 1970 que, ao contrário da técnica patch-clamp clássico, não requer penetrar a membrana plasmática<sup&gt; 1</sup&gt;. Desenhar o segmento externo em uma pipeta de vidro bem presas preenchido com solução extracelular permite a gravação das mudanças atuais em células individuais por testes de flash-exposição. No entanto, este bem estabelecido &quot;outer-segmento-in (OS-in)&quot; de gravação de sucção não é adequado para gravações cone mouse, por causa da baixa porcentagem de cones na retina do rato (3%) e as dificuldades na identificação do cone segmentos externos. Recentemente, um segmento interno--in de configuração (IS-in) de gravação foi desenvolvido para desenhar o segmento de interior / região nuclear do fotoreceptor para a pipeta de gravação<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Neste vídeo, vamos mostrar como gravar a partir photoresponses mouse individual cone usando uma única célula do eletrodo de sucção.

Vamos mostrar como gravar respostas flash de cones do mouse usando um eletrodo de sucção.

Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Os fotorreceptores bastonetes e cones na retina são responsáveis pela detecção da luz. No escuro, os canais dependentes de nucleotídeos cíclicos (CNG) no segmento externo...

Este vídeo demonstra a dissecação da retina de camundongo e a subsequente obtenção de gravações de sucção em células isoladas para cones. Os olhos de um camundongo eutanasiado e adaptado à escuridão são cauterizados na parte dorsal e nucleados sob luz vermelha fraca. Em seguida, os olhos são seccionados ao meio.Ao longo do equador, a córnea e as partes ventrais dos globos oculares são então removidas. A retina dorsal é isolada da camada de epitélio pigmentado e cortada em pequenos pedaços finos usando uma lâmina de barbear. Os fragmentos de retina são então colocados na câmara de registro que se adapta à platina de um microscópio.Vários corpos celulares de fotorreceptores são aspirados para dentro do eletrodo de registro. Quando um fotorreceptor do tipo cone é aspirado para o eletrodo, um breve estímulo luminoso intenso induzirá uma resposta fototransduzida com amplitude acima de quatro picoampères. Olá. Olá. Sou Jin do Laboratório do Dr. Mir Kopf, do Departamento de Oftalmologia e do censo visual da Universidade de Washington em St. Louis.Hoje vamos mostrar um procedimento para registrar respostas fotônicas de fotorreceptores individuais de Moscon. Utilizamos este procedimento em

single-cell-suction-recordings-from-mouse-cone-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Nós descrevemos um método relativamente simples de transretinal eletrorretinograma (ERG) para a obtenção de gravações photoresponses haste e cone da retina do rato intacto. Esta abordagem tira vantagem do bloco de transmissão sináptica de fotorreceptores para isolar as suas respostas de luz e gravar os usando eléctrodos de campo colocados através da retina plana montado isolado.

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

Identificação de subtipos de células ganglionares da retina de camundongos por meio de rastreamento fluorescente

Fonte: Kulkarni, M. et al. Dinâmica de Ca2+ em terminais axônicos fotorreceptores de cone da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o uso de microscopia de dois fótons para monitorar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores de cone de uma retina de camundongo transgênico. Ele descreve as etapas para preparar fatias de retina, imagens de biossensores de cálcio baseados em FRET e analisar alterações de fluorescência para quantificar os níveis de cálcio sob iluminação de...

Microscopia de dois fótons para monitorar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores de cone de retina de camundongos

Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre...

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

Retina neural de um rato com idade entre 8 dias é em cima de um bloco de gelatina 4%. Após o isolamento da camada de fotorreceptores (200 mm) por vibratome, as células fotorreceptoras são cultivadas após dissociação enzimática e mecânica para a cultura. A camada de fotorreceptores pode ser utilizado para análises moleculares, bioquímicas ou transplante.

Vibratome Seccionamento Rato Retina de Preparar culturas Fotorreceptoras

Demonstraremos como preparar fatias de retina do olho do camundongo e registrar as respostas à luz nos neurônios da retina. Todo o procedimento é realizado em condições adaptadas ao escuro.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

Nós descrevemos um protocolo para acompanhar a dinâmica de Ca2 + nos terminais do axônio de cones fotorreceptores, utilizando uma preparação fatia ex-vivo da retina mouse. Este protocolo permite que os estudos exaustivos sobre cone Ca 2+ sinalização em um importante sistema de modelo de mamífero, o rato.

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Nós desenvolvemos uma preparação fatia horizontal da retina de mamífero adulto com o plano de corte paralelo à superfície da retina. campos dendríticos de neurônios da retina orientados nonradially não foram truncados, permitindo o estudo do processamento de sinal com técnicas de patch-clamp e de imagem.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Aqui, apresentamos uma abordagem combinatória para classificar tipos de células neuronais antes do isolamento e para a caracterização subsequente de transcriptomas de célula única. Este protocolo otimiza a preparação de amostras para o bem sucedido RNA Sequencing (RNA-Seq) e descreve uma metodologia projetada especificamente para a compreensão melhorada da diversidade celular.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

Descrevemos um método para obter culturas primárias de fotorreceptores de cone a partir da retina de embriões de frango e seu uso para triagem de alto conteúdo.

Culturas enriquecidas por cone da retina de embriões de frango para estudar rod a interações celulares cone

Aprenda a gravar respostas de flash de cones de camundongo usando eletrodo de sucção. Este método demonstra dissecação de retina e aquisição de registros de célula única para estudo da fisiologia de fotorreceptores.

Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

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