Name: Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: Aprenda a gravar respostas de flash de cones de camundongo usando eletrodo de sucção. Este método demonstra dissecação de retina e aquisição de registros de célula única para estudo da fisiologia de fotorreceptores.

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Suportado pelo Prémio Carreira de Desenvolvimento de Pesquisa para prevenir a cegueira, NIH conceder EY 019.312, e concessão irrestrita de Pesquisa para prevenir a cegueira e EY 02.687 (Departamento de Oftalmologia &amp; Visual Sciences da Universidade de Washington).

Fazendo eletrodos <ol><li> Fazer a gravação usando eletrodos de um puxador de micropipeta e polonês os eletrodos com filamento de aquecimento sob o microscópio. Para mouse gravação de sucção cone de uma única célula, o diâmetro interno da ponta do eletrodo é de cerca de M 6-7. </li><li> Prepare eletrodos de referência. Pesar agar 1% em água destilada. Derreta a solução ágar-ágar em banho de água quente. Preencha as pipetas de vidro (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) com 1% agar usando seringa. Solidificar o ágar em temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Cortar as pipetas em metades usando uma faca de diamante. </li><li> Mergulhe os eletrodos de referência na solução de referência para pelo menos 24 horas a 4 ° C. </li></ol> Configurando o experimento <ol start="5"><li> Escuro adaptar um rato em uma gaiola preta durante a noite. </li><li> Preparar 100 mL de solução de referência e uma solução de perfusão L (veja abaixo) e filtrar a solução. </li><li> Dissolver 0,1% BSA e 10 mM de glicose em 20 mL de solução de referência. </li><li> Calibrar a intensidade de luz do estimulador óptico utilizando fotômetro. </li><li> Monte a câmara de gravação no palco do microscópio invertido. </li><li> Solução da bolha da perfusão com 95% O 2 / 5% CO 2, incubar em banho-maria 40 ° C para aumentar a solubilidade de CO 2. A solução flui da garrafa para a câmara de gravação passando por um resistor de cerâmica aquecendo-a 36-38 ° C. O aquecedor deve estar localizado o mais próximo da câmara de gravação possível, de preferência na fase do microscópio. </li><li> Ajuste o regulador de fluxo de um fluxo de cerca de 1-1,5 mL / min. </li><li> Preencher o eletrodo de registro com a solução de referência. Insira o eletrodo em um porta-eletrodo. Certifique-se que não há bolhas no eletrodo. Montar o suporte no headstage do amplificador. Conecte o seu titular a um dispositivo de sucção, que é construído ligando tubo parcialmente cheio com óleo mineral ao lado da porta do porta-eletrodo. A outra extremidade do tubo é conectado a um pequeno reservatório de óleo mineral, para que a pressão pode ser aplicada por via oral. </li><li> Conecte o eletrodo de referência para o outro pólo da headstage. Vincular o casal térmica (TC) para o eletrodo de referência. Certifique-se que as pontas de eletrodos e TC estão juntos para que a leitura da temperatura é tida como próxima da célula como possível. </li><li> Ligue a iluminação por infravermelhos para visualizar o eletrodo. O eletrodo é visto pela câmera de infravermelho conectado a um monitor. Centro da imagem o eletrodo no campo visual e do monitor usando um micro-manipulador. </li><li> Ajustar a posição do próximo da ponta do eletrodo de referência (2-4 mm) para a ponta do eletrodo de gravação. </li><li> Ajustar a tensão DC para o aquecedor de modo que a temperatura da solução é de cerca de 36-38 ° C. </li><li> Executar um teste de vedação para verificar a resistência do eletrodo de registro, normalmente cerca de 900 kW. </li></ol> Isolar a retina do rato <ol start="18"><li> Sob luz vermelha ofuscante, euthanize o mouse de adaptação ao escuro com CO 2 e deslocamento cervical. Marcar o globo ocular com a ponta de uma tocha de metal líquido, cauterização o ponto mais dorsal da esclera ligeiramente. Enuclear do globo ocular usando uma tesoura. Todos os procedimentos subseqüentes são realizadas sob a luz infravermelha. </li><li> Hemisect os globos oculares em microscópio com iluminação infravermelha e conversores de imagem. </li><li> Remova a córnea ea lente. Remover o máximo do vítreo possível. </li><li> Para gravar M cone-respostas, remova a parte ventral da ocular 4 com uma lâmina de barbear a julgar pela marca cautério. </li><li> Descasque a retina da camada de epitélio pigmentar. </li><li> Achatar a retina e colocá-lo na parte inferior da placa de Petri cheia de 1-2 mL solução de referência. </li><li> Fatia da retina em pequenos pedaços finos usando uma lâmina de barbear e incube a preparação em uma caixa à prova de luz saturada com oxigênio puro. </li></ol> Gravações <ol start="25"><li> Desligue o aquecedor temporariamente. Mudar o fluxo de perfusão a uma tubulação de desvio para evitar que a câmara de secagem. </li><li> Escorra a maioria da solução na câmara usando um pedaço de tecido Kimwipe. Transferir a suspensão retina para a câmara de gravação usando uma pipeta de vidro. </li><li> Aguarde cerca de 2 minutos até as fatias de retina sossegar. Mudar a perfusão de volta. Ligar o aquecedor. </li><li> Ligue iluminação por infravermelhos para visualizar a preparação. Busca de um pedaço de retina deitado na câmara com segmentos fotorreceptoras exterior saindo (ver figura exemplo). Desenhar segmentos interior suavemente o eléctrodo por sucção. Nesta configuração, vários núcleos e segmentos internos devem ser atraídos para o eletrodo. Registre a photoresponse a um flash brilhante para testar se um segmento de cone interior é no eletrodo e se a célula é curartua, a julgar pela cinética de resposta e amplitude. </li><li> Inferior do reservatório mineral de aplicar uma ligeira pressão negativa para a ponta do eletrodo para ajudar a segurar o segmento interno no eletrodo. </li><li> Registro de teste flash-respostas de dim com a intensidade luminosa, uma vez por celular bom é encontrado. Flashes de teste são fornecidos a partir de um estimulador calibrado óptica 5. Flash intensidade e comprimento de onda são controladas por um conjunto de filtros de densidade neutra e filtros de interferência de banda estreita, respectivamente. Teste de flash duração (20 ms) é controlado por computador-driven persianas. </li></ol> Soluções <ol><li> Solução de perfusão do mouse: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinato, 0,5 mM Na glutamato, 0,02 mM EDTA, e 10 mM de glicose. </li><li> Rato solução eletrodo de registro: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

De uma única célula de gravação de sucção de células fotorreceptoras foi desenvolvido três décadas atrás. Ele nos permite gravar trans-membrana mudança corrente induzida pela estimulação luminosa sem penetrar a membrana celular. Por causa da adesão celular de alta, é difícil isolar vara única saudável e cone da retina do rato como retina de anfíbios e é difícil encontrar cones individuais devido ao baixo percentual (3%) e tamanho pequeno. O segmento interno--in (IS-in) método de gravação supera esta dificuldade actual d...

gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Haste e cone fotorreceptores na retina são responsáveis ​​pela detecção de luz. Na escuridão, nucleotídeo cíclico-gated (CNG) no segmento de canais externos são abertos e permitem o fluxo constante cátions para o interior através da membrana, despolarizando a célula. Exposição à luz provoca o fechamento dos canais de CNG, bloqueia o fluxo para dentro cação atual, e, portanto, resulta em hiperpolarização celular. Com base na polaridade de fotorreceptores, um método de gravação de sucção foi desenvolvido em 1970 que, ao contrário da técnica patch-clamp clássico, não requer penetrar a membrana plasmática<sup&gt; 1</sup&gt;. Desenhar o segmento externo em uma pipeta de vidro bem presas preenchido com solução extracelular permite a gravação das mudanças atuais em células individuais por testes de flash-exposição. No entanto, este bem estabelecido &quot;outer-segmento-in (OS-in)&quot; de gravação de sucção não é adequado para gravações cone mouse, por causa da baixa porcentagem de cones na retina do rato (3%) e as dificuldades na identificação do cone segmentos externos. Recentemente, um segmento interno--in de configuração (IS-in) de gravação foi desenvolvido para desenhar o segmento de interior / região nuclear do fotoreceptor para a pipeta de gravação<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Neste vídeo, vamos mostrar como gravar a partir photoresponses mouse individual cone usando uma única célula do eletrodo de sucção.

Vamos mostrar como gravar respostas flash de cones do mouse usando um eletrodo de sucção.

Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Os fotorreceptores bastonetes e cones na retina são responsáveis pela detecção da luz. No escuro, os canais dependentes de nucleotídeos cíclicos (CNG) no segmento externo...

Este vídeo demonstra a dissecação da retina de camundongo e a subsequente obtenção de gravações de sucção em células isoladas para cones. Os olhos de um camundongo eutanasiado e adaptado à escuridão são cauterizados na parte dorsal e nucleados sob luz vermelha fraca. Em seguida, os olhos são seccionados ao meio.Ao longo do equador, a córnea e as partes ventrais dos globos oculares são então removidas. A retina dorsal é isolada da camada de epitélio pigmentado e cortada em pequenos pedaços finos usando uma lâmina de barbear. Os fragmentos de retina são então colocados na câmara de registro que se adapta à platina de um microscópio.Vários corpos celulares de fotorreceptores são aspirados para dentro do eletrodo de registro. Quando um fotorreceptor do tipo cone é aspirado para o eletrodo, um breve estímulo luminoso intenso induzirá uma resposta fototransduzida com amplitude acima de quatro picoampères. Olá. Olá. Sou Jin do Laboratório do Dr. Mir Kopf, do Departamento de Oftalmologia e do censo visual da Universidade de Washington em St. Louis.Hoje vamos mostrar um procedimento para registrar respostas fotônicas de fotorreceptores individuais de Moscon. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as propriedades de adaptação dos cones de mamíferos, os fotorreceptores responsáveis pela nossa visão diurna. Então, vamos começar.No dia anterior à gravação, mantenha o experimento no escuro. Adapte um camundongo colocando-o em uma gaiola hermética à luz durante a noite. Use um puxador de micropipetas para fabricar eletrodos de gravação a partir de tubos de vidro borossilicato sob um microscópio composto.Use um filamento de aquecimento para puxar. Polir a ponta de cada eletrodo para suavizá-la e reduzir sua abertura ao diâmetro desejado. Para o registro por sucção de uma única célula cônica de camundongo, o diâmetro interno na ponta do eletrodo deve ser de cerca de seis a sete micrômetros.Prepare uma solução de 1% de ágar em água destilada. Coloque a solução em banho-maria fervente para derreter o ágar. Após a fusão do ágar, transfira-o para uma seringa e preencha as pipetas de vidro com a solução.Para preparar os eletrodos de referência, deixe-os solidificar por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a solidificação do ágar, use uma lâmina de diamante para cortar cada pipeta ao meio, obtendo dois eletrodos de referência. Coloque os eletrodos de referência em um frasco de cintilação cheio com solução de referência e deixe-os embebendo por pelo menos 24 horas a quatro graus Celsius para permitir que a solução penetre no gel de ágar.Os eletrodos de referência podem ser utilizados por até três meses a partir da data de preparação. Os eletrodos usados são descartados após o experimento. O sistema de gravação é composto por um microscópio invertido montado sobre uma mesa com suspensão pneumática para minimizar o ruído de vibração, blindado por uma gaiola de Faraday para reduzir o ruído eletromagnético.Um micromanipulador motorizado é usado para posicionar o eletrodo de registro. O estimulador óptico é composto por um filamento de tungstênio, obturadores controlados por computador e filtros ópticos para controlar o comprimento de onda e a intensidade da luz. Um amplificador de grampo de patch é utilizado para detectar correntes da membrana de células fotorreceptoras individuais.Durante as gravações, o tecido será perfundido. Coloque um litro do tampão de perfusão preparado em um banho-maria a 40 graus Celsius próximo ao sistema de gravação. Em seguida, utilizando tubos, conecte o tampão de perfusão a uma mistura de 95%oxigênio e 5%dióxido de carbono, de modo que borbulhe continuamente.Utilizando um fotômetro, meça a potência da luz não atenuada proveniente do estimulador óptico; o detector do fotômetro é colocado sobre a platina do microscópio, no plano onde será posicionada a preparação. Posteriormente, converta a leitura fornecida em micro watts em fótons por micrômetro quadrado por segundo para estimar o número de fótons por teste. Considere o pulso de luz, levando em conta a atenuação da luz pelos filtros neutros de densidade.Uma vez que a potência da luz não atenuada tenha sido medida, remova o fotômetro da platina e fixe a câmara de gravação a ser utilizada nos experimentos na platina do microscópio invertido. Utilizando tubos, conecte o frasco da solução de perfusão, por meio de uma válvula reguladora, à câmara de gravação. Passe os tubos através de um resistor de aquecimento.Certifique-se de que o resistor de aquecimento esteja posicionado imediatamente antes da câmara de gravação. Em seguida, conecte a tubulação de desvio da válvula reguladora à câmara de gravação. Inicie a perfusão abrindo e ajustando a válvula reguladora de fluxo para uma taxa de fluxo de um a 1,5 mililitros por minuto.A solução profusão escoa para fora da câmara de registro e entra em um frasco de coleta por gravidade. Use uma seringa com agulha romba para encher os suportes dos eletrodos com solução de referência. Usando uma agulha de seringa microfill, encha e lave o eletrodo de registro com a solução de referência, garantindo que não haja bolhas no interior do eletrodo.Insira o eletrodo de referência em um suporte de eletrodo e conecte-o ao polo de referência do estágio inicial do amplificador. Use um anel de borracha para fixar o termopar ao eletrodo de referência. Certifique-se de posicionar as pontas do eletrodo e do termopar próximas uma da outra, para garantir que a leitura de temperatura seja realizada o mais próximo possível da célula.Em seguida, insira o eletrodo de gravação em um suporte de eletrodo e fixe o suporte ao estágio de cabeça do amplificador. Usando tubos, conecte um pequeno reservatório de óleo mineral à porta lateral do suporte de eletrodo. Uma sucção suave pela boca, por meio de um tubo conectado ao reservatório, atrairá a célula para dentro do eletrodo.Utilizando o software do computador, abra uma das obturadoras do estimulador óptico. Para visualizar a área do feixe do estímulo de teste na platina do microscópio, foque o microscópio até o fundo da câmara de gravação. Usando o micromanipulador, mova o eletrodo para o centro da área do feixe do estímulo de teste.Posicione o eletrodo de referência próximo à ponta do eletrodo de gravação. Ajuste a voltagem do aquecedor de modo que a temperatura da solução na câmara de gravação seja de aproximadamente 36 a 38 graus Celsius. Quando um teste de selamento, que mede a voltagem em uma amplitude de corrente pré-definida, para calcular a resistência a fim de verificar a resistência do eletrodo de gravação, normalmente cerca de 900 kiloohms.O teste de selamento permite detectar bolhas nos eletrodos de gravação ou de referência ou tamanho inadequado da ponta do eletrodo de gravação. O teste de selamento é controlado por software pelo programa de aquisição Clamp X. A leitura da resistência é exibida na tela do computador. Se a resistência for muito baixa, inferior a 500 kiloohms, a ponta do eletrodo provavelmente é muito grande e um novo eletrodo precisará ser instalado.Se a resistência for superior a um mili ohm, pode haver uma bolha no eletrodo ou sua ponta é muito estreita, sendo necessário lavar ou substituir o eletrodo. Uma vez que o equipamento de gravação esteja pronto, prepare as fatias retinianas para o experimento sob luz vermelha fraca; use a ponta da agulha de dissecação aquecida para cauterizar a esclera no ponto mais dorsal de cada globo ocular de um camundongo adaptado à escuridão e eutanasiado. Em seguida, enucleie os globos oculares usando tesoura.Use pin&ccedil;as rombas para transferir os olhos para um microsc&oacute;pio de disseca&ccedil;&atilde;o equipado com ilumina&ccedil;&atilde;o de infravermelho e conversores de imagem de infravermelho. Todas as manipula&ccedil;&otilde;es de disseca&ccedil;&atilde;o subsequentes s&atilde;o realizadas sob luz de infravermelho. Em seguida, utilizando tesouras microcir&uacute;rgicas, corte o olho aberto ao longo do equador, exceto no ponto de cauteriza&ccedil;&atilde;o.Use pin&ccedil;as afiadas para remover a lente. Em seguida, remova o m&aacute;ximo poss&iacute;vel do v&iacute;treo utilizando a ponta da caneta de cauteriza&ccedil;&atilde;o como refer&ecirc;ncia. Use uma l&acirc;mina de barbear para remover a parte ventral da c&uacute;pula ocular.Em seguida, remova a córnea. Depois, use uma pinça para destacar a retina dorsal da camada do epitélio pigmentado. Em seguida, posicione a retina com o lado dos receptores voltado para cima no fundo de um novo recipiente de Petri contendo um a dois mililitros de uma solução referência de glicose 10 milimolar com BSA 0,1%, pressionando suavemente a retina com uma lâmina de barbear para aplaná-la.Corte a retina em pequenos pedaços finos. Em seguida, incube o preparo em uma caixa de tipo luminoso saturada continuamente com oxigênio puro antes de adicionar os fragmentos de retina à câmara de registro. Desligue temporariamente o aquecedor.Alterne o fluxo de perfusão para o tubo de desvio. Em seguida, utilizando um lenço de papel kim, drene a maior parte da solução da câmara. Ligue a iluminação de infravermelho.Retire a suspensão da retina do incubador e transfira as fatias para a câmara de registro. Usando uma pipeta de transferência de abertura larga, permita que as fatias sedimentem por dois minutos. Após a sedimentação das fatias de retina, religue a perfusão direta e o aquecedor.Identifique um fragmento de retina com seus segmentos externos dos fotorreceptores projetando-se para fora. Posicione a ponta do eletrodo de registro acima da camada nuclear externa da retina utilizando sucção bucal. Aspire suavemente vários corpos celulares de fotorreceptores para dentro do eletrodo, trazendo as células para seu interior.Dê um estímulo luminoso de teste de 20 milissegundos a 500 nanômetros. A alteração induzida pela luz na corrente que flui através do fotorreceptor representa a resposta ao estímulo de teste. Um cone saudável produzirá uma amplitude de resposta máxima de quatro a sete picoamperés, ou pA.Quando estimulado com um flash de teste não atenuado. Após encontrar uma boa célula, abaixe suavemente o reservatório de óleo mineral manualmente para aplicar uma leve pressão negativa na ponta do eletrodo, ajudando a manter o segmento interno da célula dentro do eletrodo. Se a célula for responsiva, registre uma série de respostas a flashes de teste com intensidade variando do limiar até a saturação.Utilizando esta técnica, podemos obter respostas fotoelétricas de cones em fatias de retina de camundongo com a ajuda de um eletrodo de sucção. Aqui, é mostrada uma sobreposição de várias gravações da mesma célula. As respostas fotoelétricas de um único cone foram induzidas por flashes de teste de intensidade crescente, desde intensidade baixa, que gera uma resposta limiar de cerca de um picoampére, até intensidade elevada, que gera uma resposta saturada de cerca de 5,5 picoampères.À medida que a intensidade do estímulo luminoso aumenta, a amplitude da resposta fotônica cresce até atingir a saturação. Os estímulos luminosos são aplicados no tempo igual a zero. Mostraremos apenas como registrar respostas fotônicas de fotorreceptores individuais de mosca-das-frutas utilizando um eletrodo de sucção.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de obter a parte do do da retina, cortar a retina em fatias finas, manter o eletrodo limpo de bolhas e minimizar tanto os ruídos mecânicos quanto os eletromagnéticos. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biology

Biologia

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Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

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Vibratome Seccionamento Rato Retina de Preparar culturas Fotorreceptoras

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Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

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Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

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Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

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