Fabricação e operação de uma inserção de oxigênio para culturas de células aderentes

O dispositivo de inserção hipóxica tem seis pilares que se aninham nos poços de seis. O gás da placa do poço flui através da rede microfluídica na base do pilar e pode se difundir através da membrana PDMS permeável ao gás, separando a rede de gás e o meio de cultura. Este dispositivo minimiza o comprimento do caminho de difusão entre a fonte de oxigênio, a rede microfluídica na base do pilar e as células, permitindo uma concentração mais rápida de oxigênio. Equilibration.

O dispositivo também permite um controle muito maior sobre o padrão espacial do oxigênio exposto às células, que é determinado pelo projeto da rede de gás microfluídico feito por fotolitografia padrão usando máscaras fotográficas. Olá, sou Sean Ard, do laboratório Dr.David Edington no Departamento de Bioengenharia da Universidade de Illinois em Chicago. Olá, sou Ellie, também do Edington Lab.

Hoje mostraremos como fabricar, validar e utilizar um dispositivo personalizado para expor culturas de células in vitro em uma placa sêxtupla a diferentes concentrações de oxigênio. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar o efeito do oxigênio na cicatrização de feridas, geração e migração de espécies reativas de oxigênio. Então vamos começar.

Para iniciar a fabricação do inserto oxigenante, prepare Polymethyl Sloane ou PDMS em uma proporção de 10 para um entre o pré-polímero e o agente de cura. De acordo com as instruções do fabricante, a mistura PDMS é adicionada a um molde Dell previamente usinado, padronizado para imitar a forma de uma placa de cultura padrão de seis poços. Uma vez curado a 75 graus Celsius durante a noite, a matriz de pilares moldados em réplica resultante formará o primeiro dos três componentes que compõem o inserto oxigenante para fabricar o segundo componente-chave do inserto oxigenante.

Um mestre SU oito é preparado girando primeiro SU 8 21 50. Em um wafer de silício, uma máscara fotográfica é aplicada ao wafer e o SU oito é exposto aos raios UV através da máscara fotográfica para criar um molde mestre com uma espessura de microcanal de 300 micrômetros. Despeje o PDMS em cima do SU oito Master e catalise por duas horas a 75 graus Celsius para obter um molde positivo que acabará por formar os microcanais na parte inferior de cada pilar.

O terceiro componente do dispositivo é fabricado girando o PDMS em um wafer de silício a 500 RPMs por 10 segundos, seguido por 900 RPMs por 30 segundos para atingir um cérebro de membrana de 100 micrômetros de espessura. Como os PDMs são permeáveis ao gás, o oxigênio pode ser fornecido aos microcanais diretamente através dessa membrana. Uma vez que todos os componentes são preparados, cada superfície de ligação é submetida a um tratamento de plasma de oxigênio por um minuto.

Usando um dispositivo de plasma portátil, primeiro una os seis componentes do microcanal ao conjunto de pilares e, em seguida, faça dois orifícios em cada pilar para servir como entradas e saídas de gás. Por fim, cole a membrana na parte inferior do microcanal para facilitar a colagem e expelir quaisquer bolhas. As superfícies tratadas com plasma são pressionadas juntas por cerca de um minuto usando a mistura, ponta de uma pinça, aguarde uma hora entre cada colagem para garantir que o dispositivo esteja completamente colado e possa ser calibrado.

Uma vez que um dispositivo completo tenha sido fabricado, o nível de oxigênio recebido pelas células ao usar o inserto de oxigenação em experimentos reais precisa ser calibrado. Para calibração, use um sensor de oxigênio fluorescente ou uma lâmina foxy, que contém um revestimento de corante de rutênio fluorescente que é extinto pelo oxigênio. As lâminas Foxy são pré-cortadas para caber no fundo de uma placa de seis poços.

A corrediça foxy deve ser cortada para cobrir o máximo possível da superfície do poço. Como o slide foxy tem uma espessura de cerca de um milímetro, modifique o dispositivo para manter a distância desejada para uma membrana adequada. Difusão de lâminas.

Essa distância depende do experimento, mas para a maioria dos casos deve ser inferior a um milímetro usando o dispositivo de plasma portátil bond quatro corte um microscópio de vidro de um milímetro de espessura. Deslize postes de aproximadamente seis milímetros de comprimento e quatro milímetros de largura para a parte inferior do dispositivo. O dispositivo ficará apoiado em postes no topo do corte do slide.

As lamínulas de vidro também podem ser usadas para uma lacuna de difusão de 0,17 milímetros para validar o uso de oxigênio. A três mililitros de água deionizada à temperatura ambiente nos poços da placa de seis poços onde o oxigênio será medido. Coloque o dispositivo na placa e, usando o software metamorfo, selecione o número e a localização das posições desejadas no sensor foxy.

Deslize para testar as concentrações de oxigênio. Conecte o tubo da pistola tai entre o tanque de gás oxigênio e o dispositivo de inserção hipóxica. Um regulador de fluxo de precisão ajustado para uma taxa de fluxo de 50 a 100 mililitros por minuto é usado para o controle fino do gás fornecido.

Certificando-se de que o regulador de fluxo de precisão esteja fechado. Abra primeiro o regulador da tampa do tanque, seguido pelo regulador de precisão. Reduza a taxa de fluxo para entre 10 a 20 por minuto após 15 minutos.

Para evitar a criação de bolhas na água, observe o valor da taxa de fluxo de perto na próxima hora e faça os ajustes necessários, pois a queda de pressão mudará enquanto o sistema equilibra a alteração da taxa de fluxo para capturar imagens da placa e dos sensores foxy. Um microscópio Olympus IX 71 equipado com fluorescência, uma câmera de dispositivo de carga da Q Imaging, Tiga, SRV e software de aquisição de imagem Metamorpho são usados. O microscópio está equipado com um Olympus 3 1 0 2 0, um filtro fluorescente compatível com foxy com um comprimento de onda de excitação de 475 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 600 nanômetros.

Para testar o tempo de equilíbrio e a extensão da oxigenação do dispositivo, escolha três pontos no slide foxy para medir a concentração de oxigênio. Capture uma imagem do slide imediatamente antes de iniciar o fluxo de gás. Capture imagens e intervalos de 10 segundos ao longo de 30 minutos à medida que o gás flui através do dispositivo para testar a heterogeneidade e o fornecimento de oxigênio.

Estabeleça vários pontos em intervalos de um milímetro abrangendo a largura do canal e meça a concentração de oxigênio na superfície do poço usando metamorfose. Exporte a intensidade média da imagem para cada posição e plote a concentração de oxigenação como dependente da intensidade de fluorescência. Gere uma curva de calibração ajustando curvas lineares à linha de zero a 10% e 10 a 21% relacionando a intensidade de fluorescência à concentração de oxigênio Para cada posição medida, os dados brutos de intensidade podem ser exportados do metamorfo e analisados posteriormente com o Microsoft Excel ou outro software estatístico.

Uma vez que o dispositivo tenha sido calibrado, experimentos como ensaios de cicatrização de feridas podem começar a autoclave do inserto calibrado a 121 graus Celsius por 15 minutos dentro de 24 horas antes do experimento e trabalhar com ele em uma capela de cultura de fluxo laminar para evitar contaminação subsequente. Mergulhe a inserção de PDMS esterilizada em meio livre de soro por 24 horas para inibir bolhas de gás ao inserir na cultura de poços de placa, células MDCK ou outras células aderentes a 100% de fluência em uma placa de seis poços, crie arranhões retos nas camadas mono com uma ponta de pipeta P 200. Os arranhões simulam feridas na monocamada aderente.

Aspirar o meio celular sem perturbar a monocamada e enxaguar com cinco mililitros de meio. Aspire novamente e reabasteça os poços com três mililitros de soro livre. Médio insira suavemente o dispositivo na placa, certificando-se de evitar bolhas.

Inclinar o dispositivo durante a inserção ajuda a expelir as bolhas de um lado. Tenha cuidado para evitar colocar pressão excessiva no dispositivo, o que pode deformar o PDMS o suficiente para esmagar as células subjacentes. Coloque a placa e o dispositivo em um microscópio aquecido a 37 graus Celsius stage e conecte a tubulação do tanque de gás de origem às portas de entrada e saída do dispositivo.

A incubadora de cultura deve ter um orifício para permitir a entrada do tubo e o tubo deve ser conectado Depois de colocar o dispositivo na incubadora, siga o mesmo procedimento para iniciar o fluxo de gás descrito anteriormente para avaliar a cicatrização de feridas capturar imagens de lapso de tempo das células a cada 20 minutos por 15 a 18 horas usando equipamento e software de imagem conforme descrito anteriormente, T scratch um algoritmo de medição de ferida pode ser usado para analisar a área de superfície não cicatrizada após uma duração experimental desejada. Pare o fluxo de gás, remova a placa e prossiga para o processamento adicional da célula, se desejar. O dispositivo de inserção hipóxica requer menos de dois minutos para estabilizar a 0,5% de oxigênio, conforme mostrado aqui.

O tamanho da folga do fundo do poço da membrana do dispositivo foi um fator crítico na determinação da eficiência de equilíbrio com tamanhos de folga maiores exigindo mais tempo para atingir valores de concentração de oxigênio em estado estacionário. O dispositivo também permite um grande controle sobre a oxigenação espacial em um único poço, permitindo a formação de múltiplas condições e até mesmo gerando um perfil cíclico de oxigênio em toda a superfície do poço. As monocamadas de células MDCK foram expostas a 10% ou 21% de oxigênio e a área de superfície da ferida foi analisada ao longo do tempo usando o algoritmo de rejeito de ferida de arranhões MATLAB Ts.

Após 11 horas de um total de 17 horas, 6,87% da ferida original permaneceu quando exposta a 10% de oxigênio, enquanto 64,4% da ferida permaneceu abaixo de 21% Como mostrado aqui, as concentrações de oxigênio estão negativamente correlacionadas com a área aberta da ferida para ambas as concentrações de oxigênio. Durante o experimento, acabamos de mostrar como fabricar, validar e utilizar o dispositivo de inserção hipóxica para um ensaio de cicatrização de feridas por arranhões. O dispositivo oferece uma série de vantagens sobre outros sistemas de oxigenação, como uma pegada de laboratório menor e um controle muito maior sobre a oxigenação espacial e temporal na superfície da célula.

O dispositivo pode ser utilizado por praticamente qualquer laboratório que estude o efeito do oxigênio ou de outros gases como o dióxido de carbono em culturas de células in vitro. Ao fazer este procedimento, é importante embeber o dispositivo esterilizado e o meio de cultura durante a noite, minimizar a formação de bolhas durante o experimento. Além disso, permita que o sistema seja equacionado antes de iniciar o experimento.

Isso ocorre porque a taxa de fluxo muda à medida que a pressão no sistema é igualada. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.