Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Neste artigo em vídeo, a PCR em tempo real é demonstrada utilizando ensaios Solaris QPCR. Os ensaios Solaris QPCR são conjuntos de sondas e iniciadores específicos para genes, projetados para detectar todas as variantes de splicing conhecidas de um determinado gene. Em condições universais de termociclagem, a sonda Solaris possui um ligante do sulco menor, uma porção e um marcador FA na extremidade cinco prima e um quencher escuro eclipsado na extremidade três prima.

Durante a etapa de desnaturação da PCR em tempo real, a sonda permanece em solução e a fluorescência do marcador FAM é suprimida. Durante as fases de anelamento e extensão, os iniciadores na sonda se ligam à sequência-alvo e o supressor é separado do FAM. O FAM então emite um sinal fluorescente intenso quando a sonda se dissocia; a fluorescência é novamente suprimida.

Os resultados de PCR em tempo real são obtidos demonstrando a sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade deste ensaio eficiente. Olá, sou James Covino da equipe de Pesquisa e Desenvolvimento da Thermo Fisher Scientific em Lafayette, Colorado. Hoje vamos mostrar um procedimento para montar uma reação padrão de QPCR utilizando os reagentes de expressão gênica Lars QPCR.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a silenciamento de genes-alvo usando tecnologias de interferência por RNA. Então, vamos começar. O ensaio Solaris QPCR STEM é definido por seu algoritmo exclusivo que utiliza as tecnologias MGB e super base para fornecer um ensaio único e conveniente para 98% dos genes anotados de humanos e camundongos.

Normalmente, o design de sondas e iniciadores de DNA é limitado pela temperatura de fusão da sonda, que é determinada pelo número e tipo de bases. Sequências mais longas e ricas em GC apresentam temperaturas de fusão mais elevadas. A porção ligante ao sulco menor utilizada nas sondas Solaris se encaixa no sulco menor da hélice de DNA e estabiliza a interação entre a sonda e a sequência alvo.

Isso aumenta a temperatura de fusão, permitindo o uso de sondas mais curtas. O algoritmo Solaris também incorpora seletivamente nucleotídeos modificados chamados bases superiores para melhorar a estabilidade das ligações AT e eliminar a autoassociação GG em sequências ricas em guanina. Isso permite o uso de sequências-alvo que de outra forma seriam evitadas.

A flexibilidade aumentada na sequência proporcionada pelo uso dessas tecnologias permite o design de conjuntos de primers e sondas que reconhecem todas as variantes de splicing conhecidas de um único gene. Observe que, sempre que possível, regiões que abrangem junções de éxons foram incorporadas ao sítio alvo para aumentar a especificidade, evitando a amplificação de DNA genômico contaminante. Os conjuntos resultantes de primers e sondas são analisados por meio do blast em três bases de dados diferentes: genômica, transcritos e pseudogenes, para garantir a especificidade. Além disso, os conjuntos de primers e sondas Solaris foram completamente otimizados de modo que as condições de ciclagem para todos os ensaios de QPCR sejam idênticas, o que permite avaliar a expressão de diversos transcritos em corridas únicas de PCR.

Para começar a planejar o experimento de qPCR R, identifique os reagentes necessários para realizar a qPCR do gene de interesse utilizando a busca de produtos Genius, disponível em thermo.com/solaris. Clique na caixa de pesquisa e selecione o organismo-alvo apropriado. A busca de produtos Genius pode processar diversos identificadores gênicos diferentes. Aqui.

Digite um dos termos de pesquisa sugeridos para o gene de interesse, clique em pesquisar, identifique o gene de interesse e clique em selecionar no lado esquerdo. Isso abrirá uma janela que mostra os diferentes reagentes disponíveis para o gene de interesse. Clique na aba de detecção qPCR sob o ensaio de expressão gênica Solaris.

O ensaio de iniciador com sonda Solaris otimizado no primeiro título é exibido. Esse único ensaio detectará todas as variantes de splicing conhecidas do gene de interesse. Após a identificação do agente apropriado para o iniciador, localize o ciclador QPCR que será usado no menu e identifique a mistura-mestra compatível, seja a mistura-mestra com um frasco separado de corante passivo de referência rocks, a mistura rocks ou a mistura com baixo conteúdo de rocks.

Aqui estaremos utilizando o Roche Light Cycler 480, portanto será usada a mistura mestra mais o frasco de rock. Também é importante garantir que um gene de referência apropriado seja incluído neste estudo. O B2M será utilizado assim que todos os reagentes Solaris QP CR forem recebidos.

Eles devem ser armazenados a menos 20 graus Celsius até serem utilizados. Os reagentes são estáveis por pelo menos 12 meses. Deve-se evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.

Prepare o cDNA para qPCR realizando reações de transcrição reversa no RNA da amostra. Após o preparo do cDNA, descongele o ensaio Solaris e a mistura mestra em gelo. A mistura mestra contém todos os componentes para PCR quantitativa, exceto o ensaio específico para o gene e os componentes do molde, incluindo termostato, DNA polimerase dn, TPS rocks.

Se o instrumento de QPCR exigir pedras e um tampão de reação proprietário contendo um corante azul interno, tenha também à mão água grau PCR e placas de QPCR. Após o descongelamento das soluções, misture-as batendo levemente no tubo e, em seguida, centrifugue brevemente para evitar perda de reagente. Em seguida, em um tubo de 15 mililitros, prepare um x do ensaio Solaris QPCR e a mistura mestra.

Combine, para o número desejado de amostras a serem executadas em uma placa de 384 poços, cinco microlitros de mix mestre 2x, 0,5 microlitro de ensaio Solaris 20x e água livre de nucleases para que o volume final em cada poço seja de 10 microlitros. Após a adição do cDNA, certifique-se de preparar quantidade suficiente para três réplicas de cada amostra, incluindo um controle sem molde (NTC) e um controle sem transcriptase reversa (sem RT) para verificar, respectivamente, reagentes contaminados ou DNA genômico contaminante. Em seguida, transfira a mistura para um reservatório estéril.

Em seguida, utilizando um pipetador multicanal, transfira o volume apropriado de um x de mistura-mestra para os poços apropriados da placa de PCR. Se forem utilizadas placas brancas, o corante azul interno incluído na mistura-mestra auxiliará no acompanhamento do progresso da pipetagem. Várias bibliotecas de cDNA e genes de referência podem ser analisadas na mesma placa, já que todas as condições de ciclagem são idênticas.

Uma vez que a mistura mestra 1x tenha sido adicionada às poças apropriadas, adicione o molde de CD NA diluído a cada poça de modo que o volume final seja de 10 microlitros, pipetando para cima e para baixo para misturar. Sobreponha a placa com um selo adesivo ou com um selo térmico, conforme mostrado aqui.

Coloque a placa em uma centrífuga e gire para levar os reagentes até o fundo do poço e remover quaisquer bolhas que possam interferir nas leituras de fluorescência. O termociclador deve ativar a polimerase com início quente na mistura mestra Solaris QPCR a 95 graus Celsius por 15 minutos, um ciclo, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 graus Celsius por 15 segundos e uma extensão a 60 graus Celsius por 60 segundos. Este protocolo é o mesmo para todos os ensaios Soliris QPCR, independentemente do gene que está sendo amplificado.

Por fim, coloque a placa no instrumento de QPCR e inicie o programa. Esta figura demonstra o alto desempenho dos ensaios Solaris aqui, 10 diluições sucessivas de dez vezes de DNA sintético ou cDNA foram amplificadas utilizando os ensaios de expressão gênica Solaris QPCR para CDC 20 e F two RL one, as curvas de amplificação em escala logarítmica e as curvas padrão para 10 diluições log 10 demonstram o alto desempenho do ensaio mesmo em baixas concentrações de entrada.

O desempenho de cada ensaio é medido pela eficiência, valor ao quadrado, alcance dinâmico de 10, diluições log 10 e limite inferior de detecção. Os dados apresentados aqui demonstram a reprodutibilidade dos ensaios Solaris. Neste caso, alíquotas de CD NA foram amplificadas em dois laboratórios separados geograficamente utilizando ensaios de expressão gênica Solaris QPCR e mix mestre.

Os mesmos níveis de expressão foram calculados para dois alvos gênicos em ambos os laboratórios. Acabamos de mostrar como montar uma reação padrão de QPCR utilizando os reagentes de expressão gênica Solaris QPCR. Ao realizar este experimento, é importante lembrar-se de preparar misturas-mestras com a concentração final correta dos reagentes e incluir réplicas biológicas e/ou técnicas apropriadas.

Além disso, é imperativo configurar o instrumento de QPCR com as condições corretas de termociclagem para o Solaris. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.