Name: Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a realizar PCR quantitativa em tempo real com ensaios Solaris para análise de expressão gênica. Este método detecta variantes de splicing com alta especificidade e reprodutibilidade.

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1. A Thermo Scientific Solaris qPCR Algorithm Design de Ensaio <ol><li> O algoritmo usado no projeto de Solaris qPCR sonda / primer pares ajusta o Tm de cada componente permitindo assim condições de ciclismo universal. Incorporação do MGB, ou menor ligação groove, metade na sonda aumenta o Tm e permite sondas mais curto para ser projetado para uma maior flexibilidade de ensaio e performance. Como seu nome sugere, MGBs são uma classe de antibióticos que podem se encaixar no sulco menor da dupla hélice do DNA. MGBs são anexados ao final 3 ou 5 de uma sonda de DNA. Em solução, a fluorescência repórter FAM da sonda se apaga por Eclipse Refrescante Dark. Quando a sonda se liga a uma seqüência alvo, a mudança resultante em conformação a sonda s 3-D permite que um forte sinal fluorescente. Ligação da sonda de DNA para seqüência alvo é estabilizado pelo MGB, que permite o uso de altamente específicas, as sondas mais curtos, mantendo a temperatura de fusão apropriado para PCR. Assim, a detecção do sinal ocorre durante a fase de recozimento de amplificação do alvo. Durante a etapa de extensão, a sonda MGB desassocia ea fluorescência é novamente apagado. Porque a sonda desassocia, ela não afeta a eficiência da PCR. </li><li> Outra característica do algoritmo Solaris é o uso de Superbases. Superbases são modificados bases que têm maior capacidade de ligação para melhorar a estabilidade da AT títulos e eliminar GG auto-associação em guanina seqüências ricas. Além disso, eles não saciar fluoróforos adjacentes conectado no terminal 5. Estas bases são seletivamente colocada, de acordo com o algoritmo, para expandir a disponibilidade de seqüências-alvo. Isto torna possível a utilização de seqüências, tais como as regiões GC ricos, que poderiam ser evitados na elaboração de primers e sondas. </li><li> Sempre que possível, o algoritmo Solaris incorpora regiões junção exon abrangendo no site de destino. Isso aumenta a especificidade, evitando a amplificação do DNA genômico contaminante. </li><li> Importante, o algoritmo também identifica uma seqüência consenso para todas as variantes conhecidas de emenda, de modo que todos estão cobertos por uma única sonda / set primer. Assim, apenas um ensaio é necessário para um determinado gene de interesse. </li><li> Finalmente, o Solaris qPCR algoritmo projeto Ensaio utiliza parâmetros muito rigorosos para considerações de design críticas, incluindo o conteúdo GC, comprimento, Tm, e trechos de nucleotídeos homogênea. As seqüências resultantes são analisados ​​para a especificidade BLAST usando três diferentes bases de dados: genômica, transcrição e pseudogene. </li></ol> 2. Obtenção Solaris Reagentes <ol><li> Para obter o apropriado Solaris reagentes, visite <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Uma vez no site clique em "Pesquisar Produto GENEius". Para ir diretamente para a busca de produtos GENEius, vá para <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Clique na caixa de pesquisa de pesquisa e escolha do organismo de destino apropriado. </li><li> A pesquisa de produtos GENEius pode processar muitos identificadores gene diferente. Aqui, entrar em um dos termos de pesquisa sugeriram para encontrar o gene de interesse, incluindo Ref Seq de Adesão, a identificação do gene, o Symbol Gene, uma descrição do Gene, o ID Sanger ou número de Adesão, ou um número de catálogo. Em seguida, clique em "Pesquisar". </li><li> Identificar o gene de interesse e clique em "Select" no lado esquerdo. Isto irá abrir uma janela que mostra os diferentes produtos Thermo Scientific disponíveis para o gene de interesse. Em "Produtos" selecione a opção "Detecção de qPCR" Tab. </li><li> Sob o título "Ensaio Expressão Gênica Solaris" título, você vai ver um bem concebido Solaris sonda / ensaio primer. Este ensaio vai cobrir uma emenda todas as variantes conhecidas de seu alvo gene. Escolha a quantidade desejada. Eles estão disponíveis em 100, 200, 400 e 1000 X 25 mL reações (se o ensaio é identificado como made-to-order, o tamanho do pacote de 100 não estará disponível). Clique em "Add to Cart". </li><li> Em seguida, selecione o master mix apropriado para o termociclador que será usado. Para determinar qual master mix vai funcionar melhor com a máquina disponível, clique em "Saiba quais Mix Master funciona melhor com o seu Cycler PCR!" </li><li> Encontre o cycler qPCR que será usado no menu para determinar quais mix de usar. </li><li> Retornar à janela de busca de produtos GENEius, e selecione o master mix apropriado. O master mix vem em 100, 200, 400 e 1000 tamanhos reação. Clique em "Add to Cart". </li><li> Genes de referência propostos e kits verso cDNA síntese também pode ser encomendado para uma análise completa qRT-PCR. </li><li> Quando os reagentes Solaris qPCR chegam, armazená-los a -20 ° C até que esteja pronto para uso. Os seguintes reagentes devem ser recebidos: Uma solução de 20X, contendo dois primers fornecidos a 800 nM cada e uma sonda gene específico previsto em 200 nm, sequinformações de referência para ambos os sonda e os primers e qPCR Gene Solaris Mix Master Expressão em uma concentração 2X. Solaris qPCR Ensaios Expressão Gênica são estáveis ​​por um período mínimo de 12 meses. Evite congelar repetido descongelamento. </li></ol> 3. qPCR configuração <ol><li> Iniciar o protocolo de qPCR com cDNA. RNA total deve ser extraído usando um método de coluna de spin. A Thermo Scientific Verso kit síntese de cDNA é recomendado para transcrição reversa para gerar cDNA. </li><li> Prepare-se para qPCR por descongelar os primers, sondas e master mix no gelo. Também tem em mãos PCR água grau e opaco placas qPCR branco, o que pode melhorar a sensibilidade do PCR em tempo real. </li><li> A mistura mestre contém todos os componentes para PCR em tempo real, incluindo: 1) DNA polimerase Thermo-Start, uma versão hot-início da DNA polimerase Thermoprime. Este tipo de polimerase é utilizada para prevenir não-específico de amplificação durante a reação, configurar e requer etapa de ativação de 95 ° C min 15. 2) dNTPs na mistura Mestre Solaris, dTTP substitui dUTP para maximizar a eficiência de amplificação 3) tampão de reação Proprietário, otimizado para trabalhar com Solaris primer / sonda ensaios. Este tampão de reação contém corante azul para aumentar o contraste entre reagente e plástico. 4) ROX, se o seu instrumento qPCR requer ROX. </li><li> Uma vez que as soluções têm descongelado, misture sacudindo o tubo (não vortex). Spin-los para baixo para evitar a perda de reagente. </li><li> Em seguida, preparar um tubo de 15 mL Falcon estéril para configurar o mix de reação para o gene de interesse, mais um para o gene de referência, ampliação, dependendo do número de amostras. Prepare o suficiente tal que três repetições podem ser preparados para cada amostra, incluindo um modelo de controle não (NTC) e as amostras de curva padrão, se o método de curva padrão será usado para análise. </li><li> Para cada amostra rodar em uma placa de 96 poços, misture o seguinte: 5 mL da qPCR Solaris 2X Mix Master, 0,5 mL do conjunto Solaris Primer / Probe (20X), e PCR água grau tal que o volume final de reação, uma vez o cDNA é adicionado será de 25 mL. Para cada amostra rodar em uma placa de 384 poços misturar os seguintes: 12,5 mL da qPCR Solaris 2X Mix Master, 1,25 mL do conjunto Solaris Primer / Probe (20X), e PCR água grau tal que o volume final de reação, uma vez que o cDNA é adicionado será de 10 mL. </li><li> Usando um pipetador multicanal, transferir a mistura de mestre para nos poços apropriados da placa. O corante azul incluídos no master mix vai ajudar no progresso de pipetagem de rastreamento nas placas brancas. Em seguida, adicionar o template 1-5 mL cDNA (para uma placa de 96 poços) ou 1-2 mL de modelo de cDNA (para uma placa de 384 poços). Pipeta cima e para baixo para misturar. Coloque a placa em uma centrífuga e spin para baixo para remover as bolhas, pois estas irão interferir com as leituras de fluorescência. </li><li> Programa do termociclador: A enzima deve ser ativado com um 95 ° C 15 min (1 ciclo). Em seguida, 40 ciclos de 95 ° C, a desnaturação por 15 segundos, e recozimento e extensão a 60 ° C por 60 segundos. </li><li> Coloque a placa no instrumento qPCR. Iniciar o programa. </li></ol> Resultados representativos qPCR usando Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ensaios Solaris dar a detecção confiável, mesmo em concentrações muito baixas de entrada, a julgar pela eficiência da PCR e valores r2. 10 dez diluições de cDNA sintetizado a partir seqüência sintética amplicon RNA ou DNA seqüência amplicon foi amplificado em um instrumento 7900HT ABI usando Solaris qPCR Assay Expressão Gênica para F2RL1 ou CDC20, respectivamente. As curvas de log escala de amplificação e curvas de nível são mostrados juntamente com o desempenho de cada ensaio, incluindo a eficiência, o valor de r2, faixa dinâmica de 10 log10 diluições, eo limite mínimo de detecção. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Assays Solaris dar resultados consistentes até mesmo entre diferentes pesquisadores e laboratórios. siRNAs segmentação ALDOA e PPIB, bem como um controle não-alvo (NTC), foram transfectados em células HeLa em 100, 10, 1 e 0,1 nM concentrações final. As células foram colhidas e RNA total isolado 48 horas pós-tratamento. cDNA foi sintetizado usando Thermo Scientific Verso Kit Síntese de cDNA. Uma alíquota do cDNA foi amplificado em dois laboratórios separados geograficamente usando Solaris qPCR Ensaios Expressão Gênica para a detecção de ALDOA, PPIB, e GAPDH em um LightCycler Roche 480 (384 poços) da plataforma. Knockdown foi calculado usando o método ΔΔCq (normalizados para GAPDH referência gene e NTC tratados com células). Os mesmos níveis de knockdown foram demonstradas para alvos tanto gene entre os dois pesquisadores em ambos os locais.

Os autores deste artigo são funcionários da Thermo Scientific.

Thermo Scientific Ensaios Solaris qPCR fornecer um método simples e melhor para a realização de análise de qPCR. Usando um algoritmo de alta severidade, incorporando tecnologia e MGB Superbases, esses conjuntos de primers e sonda maximizar a fidelidade ea robustez dos experimentos qPCR. Uma cartilha e definir sonda reconhece todas as variantes conhecidas emenda de um determinado gene. O site de destino, sempre que possível, inclui as regiões exon abrangendo, para garantir que o DNA genômico não é amplificado. Estas características tornam possível executar várias amostras simultaneamente, reduzindo a quantidade de tempo necessário para realizar experimentos complexos. Desde a mistura principal é azul, é possível usar placas brancas opacas, que melhoram a sensibilidade do qPCR, sem perder de vista a pipetagem. Tomados em conjunto, as características do projeto do Ensaio qPCR Solaris fazer este ensaio qPCR romance um ensaio simples, mas de alto desempenho que é específica e robusta.

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

O Solaris qPCR Assay expressão do gene é um novo tipo de primer / sonda conjunto, projetado para simplificar o processo de qPCR, mantendo a sensibilidade e precisão do ensaio. Estes conjuntos primer / sonda são pré-concebidos para&gt; 98% dos genomas humano e do rato e melhorias característica importante das tecnologias anteriormente disponíveis. Estas melhorias foram possíveis em virtude de um algoritmo de design inovador, desenvolvido por especialistas Thermo Scientific bioinformática. Várias características convenientes foram incorporados Ensaio qPCR Solaris para agilizar o processo de realizar quantitativa PCR em tempo real. Primeiro, o protocolo é semelhante ao de alternativas comumente empregados, por isso os métodos utilizados durante a qPCR são susceptíveis de ser familiar. Segundo, a mistura principal é azul, o que torna a configuração das reações qPCR mais fácil de rastrear. Em terceiro lugar, as condições de ciclos térmicos são os mesmos para todos os ensaios (genes), tornando possível para executar muitas amostras em um tempo e reduzindo o potencial de erro. Finalmente, a sonda e informações de seqüência de primer são fornecidos, simplificando o processo de publicação. Aqui, nós demonstrar como obter os reagentes apropriados Solaris usando o recurso de busca GENEius produto encontrado no site da ordenação (www.thermo.com / solaris) e como utilizar os reagentes para a realização de qPCR Solaris usando o método de curva padrão.

O Solaris qPCR Ensaios Expressão Gênica são novos pré-concebidas qPCR primer / sonda combinações projetado para simplificar o processo de qPCR sem sacrificar a especificidade e robustez do ensaio.

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

O Solaris qPCR Gene Expression Assay é um novo tipo de conjunto de primers/sondas, concebido para simplificar o processo de qPCR, mantendo a sensibilidade e...

Neste artigo em vídeo, a PCR em tempo real é demonstrada utilizando ensaios Solaris QPCR. Os ensaios Solaris QPCR são conjuntos de sondas e iniciadores específicos para genes, projetados para detectar todas as variantes de splicing conhecidas de um determinado gene. Em condições universais de termociclagem, a sonda Solaris possui um ligante do sulco menor, uma porção e um marcador FA na extremidade cinco prima e um quencher escuro eclipsado na extremidade três prima.Durante a etapa de desnaturação da PCR em tempo real, a sonda permanece em solução e a fluorescência do marcador FAM é suprimida. Durante as fases de anelamento e extensão, os iniciadores na sonda se ligam à sequência-alvo e o supressor é separado do FAM. O FAM então emite um sinal fluorescente intenso quando a sonda se dissocia; a fluorescência é novamente suprimida.Os resultados de PCR em tempo real são obtidos demonstrando a sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade deste ensaio eficiente. Olá, sou James Covino da equipe de Pesquisa e Desenvolvimento da Thermo Fisher Scientific em Lafayette, Colorado. Hoje vamos mostrar um procedimento para montar uma reação padrão de QPCR utilizando os reagentes de expressão gênica Lars QPCR.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a silenciamento de genes-alvo usando tecnologias de interferência por RNA. Então, vamos começar. O ensaio Solaris QPCR STEM é definido por seu algoritmo exclusivo que utiliza as tecnologias MGB e super base para fornecer um ensaio único e conveniente para 98% dos genes anotados de humanos e camundongos.Normalmente, o design de sondas e iniciadores de DNA é limitado pela temperatura de fusão da sonda, que é determinada pelo número e tipo de bases. Sequências mais longas e ricas em GC apresentam temperaturas de fusão mais elevadas. A porção ligante ao sulco menor utilizada nas sondas Solaris se encaixa no sulco menor da hélice de DNA e estabiliza a interação entre a sonda e a sequência alvo.Isso aumenta a temperatura de fusão, permitindo o uso de sondas mais curtas. O algoritmo Solaris também incorpora seletivamente nucleotídeos modificados chamados bases superiores para melhorar a estabilidade das ligações AT e eliminar a autoassociação GG em sequências ricas em guanina. Isso permite o uso de sequências-alvo que de outra forma seriam evitadas.A flexibilidade aumentada na sequência proporcionada pelo uso dessas tecnologias permite o design de conjuntos de primers e sondas que reconhecem todas as variantes de splicing conhecidas de um único gene. Observe que, sempre que possível, regiões que abrangem junções de éxons foram incorporadas ao sítio alvo para aumentar a especificidade, evitando a amplificação de DNA genômico contaminante. Os conjuntos resultantes de primers e sondas são analisados por meio do blast em três bases de dados diferentes: genômica, transcritos e pseudogenes, para garantir a especificidade. Além disso, os conjuntos de primers e sondas Solaris foram completamente otimizados de modo que as condições de ciclagem para todos os ensaios de QPCR sejam idênticas, o que permite avaliar a expressão de diversos transcritos em corridas únicas de PCR.Para começar a planejar o experimento de qPCR R, identifique os reagentes necessários para realizar a qPCR do gene de interesse utilizando a busca de produtos Genius, disponível em thermo.com/solaris. Clique na caixa de pesquisa e selecione o organismo-alvo apropriado. A busca de produtos Genius pode processar diversos identificadores gênicos diferentes. Aqui.Digite um dos termos de pesquisa sugeridos para o gene de interesse, clique em pesquisar, identifique o gene de interesse e clique em selecionar no lado esquerdo. Isso abrirá uma janela que mostra os diferentes reagentes disponíveis para o gene de interesse. Clique na aba de detecção qPCR sob o ensaio de expressão gênica Solaris.O ensaio de iniciador com sonda Solaris otimizado no primeiro título é exibido. Esse único ensaio detectará todas as variantes de splicing conhecidas do gene de interesse. Após a identificação do agente apropriado para o iniciador, localize o ciclador QPCR que será usado no menu e identifique a mistura-mestra compatível, seja a mistura-mestra com um frasco separado de corante passivo de referência rocks, a mistura rocks ou a mistura com baixo conteúdo de rocks.Aqui estaremos utilizando o Roche Light Cycler 480, portanto será usada a mistura mestra mais o frasco de rock. Também é importante garantir que um gene de referência apropriado seja incluído neste estudo. O B2M será utilizado assim que todos os reagentes Solaris QP CR forem recebidos.Eles devem ser armazenados a menos 20 graus Celsius até serem utilizados. Os reagentes são estáveis por pelo menos 12 meses. Deve-se evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.Prepare o cDNA para qPCR realizando reações de transcrição reversa no RNA da amostra. Após o preparo do cDNA, descongele o ensaio Solaris e a mistura mestra em gelo. A mistura mestra contém todos os componentes para PCR quantitativa, exceto o ensaio específico para o gene e os componentes do molde, incluindo termostato, DNA polimerase dn, TPS rocks.Se o instrumento de QPCR exigir pedras e um tampão de reação proprietário contendo um corante azul interno, tenha também à mão água grau PCR e placas de QPCR. Após o descongelamento das soluções, misture-as batendo levemente no tubo e, em seguida, centrifugue brevemente para evitar perda de reagente. Em seguida, em um tubo de 15 mililitros, prepare um x do ensaio Solaris QPCR e a mistura mestra.Combine, para o número desejado de amostras a serem executadas em uma placa de 384 poços, cinco microlitros de mix mestre 2x, 0,5 microlitro de ensaio Solaris 20x e água livre de nucleases para que o volume final em cada poço seja de 10 microlitros. Após a adição do cDNA, certifique-se de preparar quantidade suficiente para três réplicas de cada amostra, incluindo um controle sem molde (NTC) e um controle sem transcriptase reversa (sem RT) para verificar, respectivamente, reagentes contaminados ou DNA genômico contaminante. Em seguida, transfira a mistura para um reservatório estéril.Em seguida, utilizando um pipetador multicanal, transfira o volume apropriado de um x de mistura-mestra para os poços apropriados da placa de PCR. Se forem utilizadas placas brancas, o corante azul interno incluído na mistura-mestra auxiliará no acompanhamento do progresso da pipetagem. Várias bibliotecas de cDNA e genes de referência podem ser analisadas na mesma placa, já que todas as condições de ciclagem são idênticas.Uma vez que a mistura mestra 1x tenha sido adicionada às poças apropriadas, adicione o molde de CD NA diluído a cada poça de modo que o volume final seja de 10 microlitros, pipetando para cima e para baixo para misturar. Sobreponha a placa com um selo adesivo ou com um selo térmico, conforme mostrado aqui.Coloque a placa em uma centrífuga e gire para levar os reagentes até o fundo do poço e remover quaisquer bolhas que possam interferir nas leituras de fluorescência. O termociclador deve ativar a polimerase com início quente na mistura mestra Solaris QPCR a 95 graus Celsius por 15 minutos, um ciclo, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 graus Celsius por 15 segundos e uma extensão a 60 graus Celsius por 60 segundos. Este protocolo é o mesmo para todos os ensaios Soliris QPCR, independentemente do gene que está sendo amplificado.Por fim, coloque a placa no instrumento de QPCR e inicie o programa. Esta figura demonstra o alto desempenho dos ensaios Solaris aqui, 10 diluições sucessivas de dez vezes de DNA sintético ou cDNA foram amplificadas utilizando os ensaios de expressão gênica Solaris QPCR para CDC 20 e F two RL one, as curvas de amplificação em escala logarítmica e as curvas padrão para 10 diluições log 10 demonstram o alto desempenho do ensaio mesmo em baixas concentrações de entrada.O desempenho de cada ensaio é medido pela eficiência, valor ao quadrado, alcance dinâmico de 10, diluições log 10 e limite inferior de detecção. Os dados apresentados aqui demonstram a reprodutibilidade dos ensaios Solaris. Neste caso, alíquotas de CD NA foram amplificadas em dois laboratórios separados geograficamente utilizando ensaios de expressão gênica Solaris QPCR e mix mestre.Os mesmos níveis de expressão foram calculados para dois alvos gênicos em ambos os laboratórios. Acabamos de mostrar como montar uma reação padrão de QPCR utilizando os reagentes de expressão gênica Solaris QPCR. Ao realizar este experimento, é importante lembrar-se de preparar misturas-mestras com a concentração final correta dos reagentes e incluir réplicas biológicas e/ou técnicas apropriadas.Além disso, é imperativo configurar o instrumento de QPCR com as condições corretas de termociclagem para o Solaris. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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