Obtenção Hemócitos do Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes Observando e sua adesão a bactérias simbióticas e não-simbióticas

Após a remoção dos adultos de lula bobtail de seus tanques e sua anestesia com uma solução de água do mar filtrada contendo 2% de etanol, eles são sangrados através do vaso sanguíneo cefálico. Com uma seringa de 26 e meia polegadas de diâmetro, o hemolinfa extraído aparece azul.

Devido à presença de hemo cian, os hemócitos são diluídos até uma concentração desejada e aliquotados em uma lamínula com oito câmaras. Após os hemócitos aderirem à lamínula, eles são corados com um rastreador celular laranja, um corante fluorescente, e desafiados com bactérias marcadas com GFP, que podem ser visualizadas em um microscópio fluorescente. Olá, sou Spencer Olm do Departamento de Biologia Molecular e Celular da Universidade de Connecticut.

E eu sou Andrew Collins do NY Home Lab. Hoje vamos mostrar um procedimento para extrair hemolinfa ou sangue da lula bobtail havaiana. Você prepara este opis.

Agora, as lulas bobtail são animais noturnos encontrados ao largo da costa do Havaí, próximas a recifes de corais, e utilizam a luz produzida pela sua simbiose para se camuflarem à noite, quando saem à procura de seu alimento favorito, que é camarão. Utilizamos essa associação em laboratório para estudar como bactérias benéficas colonizam tecidos animais. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para investigar as interações entre componentes do sistema imunológico inato do hospedeiro e seu parceiro bacteriano bioluminescente VIO ide.

Então vamos começar. Antes de extrair o hemolinfa, anestesie um polvo adulto em um béquer de um litro contendo uma solução recém-preparada de 2% de etanol em 500 mililitros de água do mar artificial filtrada e esterilizada. Após 10 minutos, o polvo parará de nadar e não responderá ativamente ao toque.

No entanto, deve-se ainda observar a respiração contínua, indicada pelo movimento do manto, e a atividade dos cromatóforos, indicando atividade das células pigmentares. Despeje um pouco da solução estéril de água do mar com etanol do béquer em uma bandeja de dissecação padrão de cera e submerja o polvo na bandeja com a face ventral voltada para cima. Usando uma ponteira padrão de pipeta de 200 microlitros, puxe para trás o funil e o manto para expor o principal vaso sanguíneo cefálico localizado entre os dois olhos.

Utilize uma seringa estéril com uma agulha de 26 e meia polegadas para perfurar o vaso sanguíneo cefálico e retirar entre 50 e 100 microlitros de hemolinfa ou 10 a 20 microlitros. Se o animal for servir como doador várias vezes, coloque a hemolinfa em um tubo estéril de 1,5 mililitro sobre gelo. Observe que, se este passo for realizado corretamente, o sangue da lula deverá apresentar-se azul escuro.

Substitua o animal em um tanque com água do mar normal para recuperação. Gire o hemolinfa em uma microcentrífuga à temperatura ambiente para obter o pellet dos hemócitos e remova o sobrenadante com pipeta. Re-suspenda os hemócitos em 500 microlitros de solução de Ringer para lula para lavagem. Em seguida, gire novamente para obter o pellet celular e remova o sobrenadante.

Por fim, ressuspenda os hemo e a solução de Ringer para lula. Determine a concentração celular por meio de hemocitômetro. Em seguida, adicione aproximadamente 2000 células a cada câmara de um lamínula de vidro.

Deixe as células aderirem ao vidro por aproximadamente 10 minutos. Nessa densidade, os hemos devem formar uma monocamada uniforme na superfície do vidro. Mantenha os hemos em gelo enquanto prepara as bactérias em um agitador orbital a 28 graus Celsius.

Cultive uma ou mais cepas de bactérias Vireo contendo um gene repórter fluorescente verde até a fase logarítmica média em meio de água do mar com tritão. Utilizando um espectrofotômetro, meça a densidade óptica do cultivo a 600 para determinar a densidade celular; em seguida, centrifugue as bactérias, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet. Em um mililitro de solução de Ringer para lula, adicione as bactérias aos hemócitos.

Nos lâminas de vidro com câmaras, coloque 100.000 bactérias por câmara. Incube as lâminas à temperatura ambiente por uma hora. Para obter ligação máxima, adicione o rastreador celular laranja, adicionando uma concentração final de 0,005% para corar o citoplasma hemocitário.

Incube por 30 minutos e, em seguida, lave com 150 microlitros de solução fresca de ringer de lula. Adicione um microscópio confocal, visualize os hecitos corados e enumere as bactérias associadas em toda a superfície do hecito. Agora mostraremos algumas imagens representativas de hecitos desafiados com a bactéria não simbiótica marcada com GFP Filio Harvey Eye e com a bactéria simbiótica natural da lula Filio fii.

Aqui está uma imagem de um local hemo que não foi desafiado com nenhuma bactéria. A célula aparece vermelha e tornou-se ativada. Assim, é possível observar suas extensões semelhantes a pseudópodes.

Quando a célula é desafiada com a bactéria simbiótica *Vibrio fischeri*, algumas bactérias são vistas aderindo à superfície da célula. No entanto, quando a bactéria não simbiótica *Vibrio harveyi* é exposta aos hemócitos, um número significativamente maior de bactérias se liga. Acabamos de mostrar como extrair hemolinfa de uma lula-pé-rapado, isolar os hemócitos e utilizá-los em experimentos para caracterizar a adesão bacteriana a essas células da lula.

Este protocolo pode ser modificado para imunoquímica fixando-se os hemócitos após eles aderirem à superfície da lamínula. R-N-A-D-N-A e proteínas também podem ser extraídos uma vez que os hemócitos tenham sido obtidos do animal. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.