Name: Obtenção Hemócitos do Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes Observando e sua adesão a bactérias simbióticas e não-simbióticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-11T04:52:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Aprenda a obter hemócitos de Euprymna scolopes para estudos de adesão bacteriana. Este método permite visualizar interações entre células imunes e bactérias simbióticas usando marcadores fluorescentes.

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Fontes de financiamento: Universidade de Connecticut Research Foundation e do Departamento de Biologia Molecular e Celular para SVN, Sigma Xi Grant-in-Aid de Pesquisa e H. e R. Antonio Majorie Romano de Pós-Graduação Educação Fellowship para AJC

<ol><li> Prepare 500 mL de 0,22 M esterilizada por filtração, a água do mar artificial (FSW; salinidade 35 ppt). Filtro de água do mar artificial ou natural através de um filtro de 0,22 micron M para remover partículas e bactérias. </li><li> Anestesiar um adulto Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes), colocando em uma solução 2% de etanol na FSW. Colocar o animal na anestesia por aproximadamente 10 minutos. A lula deixará de natação e não responder ativamente ao toque. Respiração contínua, indicado pelo movimento do manto, ea atividade chromatophore ainda deve ser observado. </li><li> Lugar squid com o lado ventral para cima em uma bandeja padrão de cera dissecção. Submergir o animal com FSW contendo 2% de etanol. </li><li> Usando um padrão de 200 mL pontas de pipeta, retirar o funil e manto para expor os principais vasos sanguíneos localizados cefálica entre os dois olhos. </li><li> Usando uma seringa estéril mL 1 com 26,5 calibre da agulha, punção do vaso sangüíneo cefálico e retirar entre 50-100 mL de hemolinfa. Coloque o hemolinfa em um tubo de 1,5 mL estéril no gelo. Nota: Se um animal servirá como um doador de múltiplos vezes, apenas retirar 10-20 mL de hemolinfa a qualquer momento. Devolver o animal para um tanque de água do mar normal. O animal irá reviver dentro de 30 min. </li><li> Hemócitos de colheita recente são lavadas e re-suspenso em 500 ml de solução Ringer Squid s (S-Ringers; 530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl 2, 10 mM CaCl 2 e 10 mM tampão HEPES, pH 7,5). </li><li> Hemócitos concentrações são determinadas por hemocitômetro, e cerca de 2.000 células são adicionadas ao lamínulas câmaras de vidro, e permitiu a aderir ao vidro por 10 min em temperatura ambiente. Neste densidade, o hemócitos formar uma monocamada uniforme sobre a superfície da lâmina de vidro. </li><li> Observar bacteriana ligação a hemócitos host, hemócitos são expostos a uma cepa bacteriana fluorescente etiquetado como o Vibrio fischeri ES114 e / ou Vibrio harveyi B392, cada um contendo um repórter fluorescente verde. V. fischeri ES114 e V. harveyi B392 são cultivadas para log-mid fase em uma água do mar triptona media (SWT) a 28 ° C em um agitador orbital. A densidade óptica a 600nm é medido espectrofotometricamente para determinar a densidade de células. As bactérias são peletizadas por centrifugação (5.000 rpm por 5 min), o sobrenadante é descartado, eo pellet é ressuspenso em S-Ringers. </li><li> 100.000 células bacterianas são adicionados a cada câmara de bem para que existem 50 bactérias por hemócitos em média. Os hemócitos misturas / bactérias são incubadas em solução Ringer S-s a 25 ° C durante 1 h, um tempo determinado para produzir o nível máximo de ligação. </li><li> O citoplasma dos hemócitos são então marcadas com fluorescência 0,005% CellTracker Orange (Invitrogen) e, em seguida, lavados em S-Ringers para visualizar as células. </li><li> Hemócitos corados com bactérias associadas são vistos por fluorescência utilizando um estereoscópio Zeiss Descoberta V20 fluorescente ou um microscópio Leica SP2 do laser confocal espectral, e enumerou sobre toda a superfície da célula animal. </li></ol> Resultados representante Porque hemolinfa cefalópode contém hemocianina e hemoglobina extracelular não, sobre a oxigenação, a hemolinfa ficará azul escuro. Uma média de ~ 5000 hemócitos por mL de hemolinfa serão obtidos utilizando este método. Após a adesão ao lamínulas septadas e coloração fluorescente, o hemócitos deve aparecer brilhante fluorescente vermelha e amoeboid em forma. Para adesão bacteriana, V. fischeri irá aderir mal ao hemócitos (1-2 células bacterianas por célula do sangue), enquanto V. harveyi irá aderir fortemente (10-15 células bacterianas por hemócitos). <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Adulto Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes mostrando a posição dos vasos sanguíneos cefálica. <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resultados da exposição hemócitos de Vibrio fischeri (A) e Vibrio harveyi (B). Vermelho, Cell Rastreador Orange; Green, GFP-rotulados bactérias.

<ol><li>Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+host+hemocytes+during+the+initiation+of+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis.</a> Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unseen+forces%3A+the+influence+of+bacteria+on+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unseen forces: the influence of bacteria on animal development.</a> Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+between+symbiotic+Vibrio+fischeri+and+the+haemocytes+of+Euprymna+scolopes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes.</a> Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+animal-bacterial+association%3A+recruiting+symbiotic+Vibrios+from+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+the+light-organ+microenvironment+of+Euprymna+scolopes%3A+description+of+a+population+of+host+cells+in+association+with+the+bacterial+symbiont+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri.</a> Biol Bull. 195, 89-97 (1998).</li>
<li>Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+fischeri+and+its+host%3A+it+takes+two+to+tango%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).</li>
</ol>

Estudos sobre o papel do sistema imunológico na mediação de sinalização molecular entre bactérias benéficas e os seus anfitriões têm, nos últimos anos, fez contribuições significativas para a nossa compreensão da co-evolução dos eucariotos com sua microbiota. O sistema squid / vibrio provou-se como um sistema modelo tratável para responder a perguntas fundamentais neste campo 2,3,5,6,8. A luz de órgãos do Euprymna squid scolopes permite a colonização exclusivamente pela bactéria Vibrio f...

<table><tbody><tr><td>Sistema de lamínulas de borossilicato nº 1.0 com câmara (8 câmaras)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina sem látex de 1 ml, 26,5 G</td><td>BD Biosciences</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio SteREO Discovery V20</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obtenção hemócitos do hawaiian bobtail squid euprymna scolopes observando e sua adesão a bactérias simbióticas e não-simbióticas

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Estudos sobre o papel do sistema imunológico na mediação de sinalização molecular entre bactérias benéficas e os seus anfitriões têm, nos últimos anos, fez contribuições significativas para a nossa compreensão da co-evolução dos eucariotos com sua microbiota. A associação simbiótica entre o havaiano bobtail lula,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; E bactéria bioluminescente<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt; Tem sido utilizado como um sistema modelo para entender os efeitos das bactérias benéficas no desenvolvimento animal. Estudos recentes têm demonstrado que macrófagos-like hemócitos, o único componente celular do sistema inato do hospedeiro lula imune, provavelmente desempenham um papel importante na mediação do estabelecimento e manutenção da associação. Este protocolo irá demonstrar como obter hemócitos de<em&gt; E. scolopes</em&gt; E depois usar essas células em ensaios de ligação bacteriana. Adulto lula são os primeiros anestesiados antes de hemolinfa coletadas pela seringa do vaso sanguíneo principal cefálica. Os hemócitos host, contidas na hemolinfa extraídos, são aderidas em lamínulas de vidro câmaras e expostos à proteína fluorescente verde marcado simbiótica<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt; E não-simbiótica<em&gt; Vibrio harveyi</em&gt;. Os hemócitos são contrastado com um corante fluorescente (Cell Rastreador de Orange, Invitrogen) e, em seguida, visualizado por microscopia de fluorescência.

Este vídeo vai demonstrar como obter hemócitos (células sangüíneas) a partir do Hawaiian bobtail lula,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; Para utilização em ensaios biológicos de células bacterianas e aderência. Hemócitos serão marcadas com um corante fluorescente e expostos a GFP-rotulados bactérias.

Obtenção Hemócitos do Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes Observando e sua adesão a bactérias simbióticas e não-simbióticas

Estudos relativos ao papel do sistema imunitário na mediação da sinalização molecular entre bactérias benéficas e os seus hospedeiros têm, nos últimos anos, realizado ...

Após a remoção dos adultos de lula bobtail de seus tanques e sua anestesia com uma solução de água do mar filtrada contendo 2% de etanol, eles são sangrados através do vaso sanguíneo cefálico. Com uma seringa de 26 e meia polegadas de diâmetro, o hemolinfa extraído aparece azul.Devido à presença de hemo cian, os hemócitos são diluídos até uma concentração desejada e aliquotados em uma lamínula com oito câmaras. Após os hemócitos aderirem à lamínula, eles são corados com um rastreador celular laranja, um corante fluorescente, e desafiados com bactérias marcadas com GFP, que podem ser visualizadas em um microscópio fluorescente. Olá, sou Spencer Olm do Departamento de Biologia Molecular e Celular da Universidade de Connecticut.E eu sou Andrew Collins do NY Home Lab. Hoje vamos mostrar um procedimento para extrair hemolinfa ou sangue da lula bobtail havaiana. Você prepara este opis.Agora, as lulas bobtail são animais noturnos encontrados ao largo da costa do Havaí, próximas a recifes de corais, e utilizam a luz produzida pela sua simbiose para se camuflarem à noite, quando saem à procura de seu alimento favorito, que é camarão. Utilizamos essa associação em laboratório para estudar como bactérias benéficas colonizam tecidos animais. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para investigar as interações entre componentes do sistema imunológico inato do hospedeiro e seu parceiro bacteriano bioluminescente VIO ide.Então vamos começar. Antes de extrair o hemolinfa, anestesie um polvo adulto em um béquer de um litro contendo uma solução recém-preparada de 2% de etanol em 500 mililitros de água do mar artificial filtrada e esterilizada. Após 10 minutos, o polvo parará de nadar e não responderá ativamente ao toque.No entanto, deve-se ainda observar a respiração contínua, indicada pelo movimento do manto, e a atividade dos cromatóforos, indicando atividade das células pigmentares. Despeje um pouco da solução estéril de água do mar com etanol do béquer em uma bandeja de dissecação padrão de cera e submerja o polvo na bandeja com a face ventral voltada para cima. Usando uma ponteira padrão de pipeta de 200 microlitros, puxe para trás o funil e o manto para expor o principal vaso sanguíneo cefálico localizado entre os dois olhos.Utilize uma seringa estéril com uma agulha de 26 e meia polegadas para perfurar o vaso sanguíneo cefálico e retirar entre 50 e 100 microlitros de hemolinfa ou 10 a 20 microlitros. Se o animal for servir como doador várias vezes, coloque a hemolinfa em um tubo estéril de 1,5 mililitro sobre gelo. Observe que, se este passo for realizado corretamente, o sangue da lula deverá apresentar-se azul escuro.Substitua o animal em um tanque com água do mar normal para recuperação. Gire o hemolinfa em uma microcentrífuga à temperatura ambiente para obter o pellet dos hemócitos e remova o sobrenadante com pipeta. Re-suspenda os hemócitos em 500 microlitros de solução de Ringer para lula para lavagem. Em seguida, gire novamente para obter o pellet celular e remova o sobrenadante.Por fim, ressuspenda os hemo e a solução de Ringer para lula. Determine a concentração celular por meio de hemocitômetro. Em seguida, adicione aproximadamente 2000 células a cada câmara de um lamínula de vidro.Deixe as células aderirem ao vidro por aproximadamente 10 minutos. Nessa densidade, os hemos devem formar uma monocamada uniforme na superfície do vidro. Mantenha os hemos em gelo enquanto prepara as bactérias em um agitador orbital a 28 graus Celsius.Cultive uma ou mais cepas de bactérias Vireo contendo um gene repórter fluorescente verde até a fase logarítmica média em meio de água do mar com tritão. Utilizando um espectrofotômetro, meça a densidade óptica do cultivo a 600 para determinar a densidade celular; em seguida, centrifugue as bactérias, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet. Em um mililitro de solução de Ringer para lula, adicione as bactérias aos hemócitos.Nos lâminas de vidro com câmaras, coloque 100.000 bactérias por câmara. Incube as lâminas à temperatura ambiente por uma hora. Para obter ligação máxima, adicione o rastreador celular laranja, adicionando uma concentração final de 0,005% para corar o citoplasma hemocitário.Incube por 30 minutos e, em seguida, lave com 150 microlitros de solução fresca de ringer de lula. Adicione um microscópio confocal, visualize os hecitos corados e enumere as bactérias associadas em toda a superfície do hecito. Agora mostraremos algumas imagens representativas de hecitos desafiados com a bactéria não simbiótica marcada com GFP Filio Harvey Eye e com a bactéria simbiótica natural da lula Filio fii.Aqui está uma imagem de um local hemo que não foi desafiado com nenhuma bactéria. A célula aparece vermelha e tornou-se ativada. Assim, é possível observar suas extensões semelhantes a pseudópodes.Quando a célula é desafiada com a bactéria simbiótica *Vibrio fischeri*, algumas bactérias são vistas aderindo à superfície da célula. No entanto, quando a bactéria não simbiótica *Vibrio harveyi* é exposta aos hemócitos, um número significativamente maior de bactérias se liga. Acabamos de mostrar como extrair hemolinfa de uma lula-pé-rapado, isolar os hemócitos e utilizá-los em experimentos para caracterizar a adesão bacteriana a essas células da lula.Este protocolo pode ser modificado para imunoquímica fixando-se os hemócitos após eles aderirem à superfície da lamínula. R-N-A-D-N-A e proteínas também podem ser extraídos uma vez que os hemócitos tenham sido obtidos do animal. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Coleta de sangue do caranguejo em ferradura americano, Limulus Polyphemus

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Microfluídicos Co-cultura de células epiteliais e bactérias para a Investigação Solúvel sinal mediada por interações

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