Name: Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-04T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda a dissecar órgãos de zebrafish adulto, incluindo gônadas, coração, fígado e cérebro. Este protocolo detalhado facilita estudos de anatomia comparada e biologia do desenvolvimento em Danio rerio.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01 HD050901 a MCM e bolsa de estudos da American Cancer Society de pós-doutorado # PF-05-041-01-DDC para TG.

<ol><li> Um peixe-zebra macho será dissecado em primeiro lugar, seguido por um peixe fêmea. Antes de iniciar a dissecação, anestesiar um peixe na tricaina 0,2% e depois sacrificá-lo por incubação em água gelada por 15 minutos. </li><li> Comece acariciando levemente o peixe seco numa toalha de papel e colocá-lo em uma esteira de dissecação. Externamente, peixe-zebra tem única dorsal, nadadeiras caudais e anal e emparelhado barbatanas peitorais e pélvicas (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Peixes machos adultos com barbatanas rotulados. </li><li> Pin o peixe para o tapete dissecando através da parte carnuda da cauda e na parte ventral da cavidade ocular. </li><li> Snip a pele na barriga do peixe só anterior à barbatana anal. Cortar a pele eo músculo subjacente ao longo da barriga da nadadeira anal à opérculo (o revestimento rígido sobre o gill) (Figura 2, etapa 1). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Passos na remoção de pele e músculos da parede do corpo para expor os órgãos internos. </li><li> Em seguida, retire o opérculo ea barbatana peitoral, incluindo a cintura peitoral (na região, de espessura óssea na base da nadadeira) (Figura 2, etapa 2). Cortar a pele e músculo subjacente início de cima do agora exposto gill posteriormente ao longo do lado do peixe e, em seguida, até o fin anal (Figura 2, etapa 3). </li><li> Remova cuidadosamente a pele eo músculo subjacente do lado do peixe. Muitos dos órgãos internos são agora visíveis (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Peixes machos adultos com parede do corpo e do músculo removido permitindo a visualização dos órgãos internos. </li><li> Os testículos são longas, brancas, órgãos pares que estão ligados à parede do corpo dorsal. Remover um testículo e coloque-o em um prato de PBS. Examinar os testículos com a luz refletida para visualizar os túbulos seminíferos (Figura 4), que contêm cistos com vários estágios de células germinativas em desenvolvimento de spermatagonia para espermátides (Leal et al., 2009). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Dissecação de um testículo. As estruturas brancas arredondadas são os túbulos seminíferos. </li><li> Em seguida, remova o sistema gastrointestinal da cavidade do corpo do peixe. O fígado pode ser identificado pelo seu grande tamanho, morfologia lobed, cor tannish e vascularização extensiva. A vesícula biliar, um verde saco cheio de líquido translúcido, eo baço, que aparece vermelho brilhante, são encontrados dentro das vísceras. </li><li> Separar os intestinos do resto dos órgãos e esticá-la. O anterior, as regiões média e posterior do intestino são definidos pela altura das pregas epiteliais (Wallace et al., 2005). </li><li> Coloque um pedaço do intestino em PBS e observar as dobras epiteliais usando luz transmitida. </li><li> Em seguida, examine a bexiga natatória. A bexiga natatória consiste em uma câmara posterior, que é ligado ao esôfago através do ducto pneumático, e uma câmara anterior, que é conectado ao ouvido interno através do aparelho weberiano (Finney et al., 2006). </li><li> Remova e descarte a bexiga natatória. Unpin os peixes e re-pin lado ventral que até dissecar o rim, que está localizado ao longo da parede do corpo dorsal. O rim é uma estrutura translúcida rosa associados com a aorta dorsal e as células pigmentadas. O rim é dividido em cabeça, corpo e cauda regiões (Figura 5). Dissecar um pedaço do rim e colocá-lo em PBS. Separar os tecido renal para revelar os túbulos renais. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Localização de cabeça, corpo e cauda renal ao longo da parede do corpo dorsal. </li><li> Dissecar um peixe fêmea. Como descrito anteriormente, euthanize o peixe em água gelada e seque antes fixando-o para o tapete de dissecação. Retire a pele do lado do peixe como se demonstrou anteriormente. O ovário é uma estrutura bilobado que é suspenso na cavidade do corpo por um mesovário vascularizada. </li><li> Remover um lobo do ovário, colocá-lo em PBS, e examiná-lo com luz transmitida. Os ovócitos podem ser separadas usando agulhas finas e depois encenado (Figura 6, Selman et al., 1993). Estágio I oócitos são aproximadamente 10 - 150 microns em tamanho e translúcido. Oócitos fase II são cerca de 150 - 350 microns em tamanho e definido pelo aparecimento de grânulos corticais. Oócitos fase III são 350-750 microns em tamanho e são opacas devido ao acúmulo de vitelo. Oócitos estágio maduro IV e V são translúcidas e geralmente não encontrados nos ovários de fêmeas que recentemente acoplado. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Palco ao vivo I, II, III e oócitos observado sob umdissecando microscópio com luz transmitida. </li><li> Em seguida, dissecar o coração do peixe. O coração está localizado posterior e ventral à brânquia. Comece por cortar o coração e todo o tecido circundante e colocando-o em PBS. Dissecar cuidadosamente afastado o tecido que envolve o coração, tomando cuidado para não danificar o átrio delicado. </li><li> Coloque o coração dissecado em solução de Ringer para observar o batimento cardíaco. Identificar o átrio, ventrículo e bulbo arterial (Figura 7, Hu et al., 2001). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Dissecada coração adulto. </li><li> Completar a dissecção, removendo o cérebro do peixe. Comece por Unpinning o peixe e retirar a cabeça com uma lâmina de barbear. Remover o tecido mole tanto quanto possível, a partir do lado ventral do crânio, com fórceps. Remove os olhos com uma tesoura pequena mola. Ruptura de abrir o crânio e remover o osso do lado ventral do cérebro. Agora coloque a cabeça em um prato de PBS e remover os ossos do crânio e da pele do lado dorsal do cérebro. </li><li> Identificar os bulbos olfativos, telencéfalo, habenula, tectum óptico, cerebelo e medula (Figura 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Cérebro zebrafish Dissecada adulto. Vista dorsal, anterior ao topo. </li></ol>

<ol><li>Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Autonomic+Innervation+of+the+Swim+Bladder+in+the+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio).</a> J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).</li>
<li>Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+morphology+and+blood+pressure+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish.</a> Anat Rec. 264, 1-12 (2001).</li>
<li>Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+stereological+evaluation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+spermatogenesis+with+an+emphasis+on+spermatogonial+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations.</a> Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).</li>
<li>Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+larval+and+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach+%28The+Practical+Approach+Series%29%22%5BJournal%5D)">The morphology of larval and adult zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+Zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J. Morphol. 218, 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , Birkhäuser Verlag. (1996).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela University of Pennsylvania Animal Care Institucional e Comitê de uso.

Reagentes: 0,2% tricaina (etílico 3-aminobenzoato) 200 mg tricaina pó 97,9 ml de água DD ~ 1 ml 1 M Tris (pH 9) Ajustar o pH para 7,0 Tampão fosfato salino (PBS) 4,0 g NaCl 0,1 g KCl 100 ml 0,1 M PO 4 tampão, pH 7,3 150 ml dH 2 O Solução de Ringer 6.7g NaCl 0,2 g KCl 0,2 g CaCl 2 Hepes 1.2g 1 LH 2 O Ajustar o pH para 7,2 Equipamento: Prato de dissecação com esteira Microscopia Eletrônica de Ciências catalogo 70540 Vannas Primavera tesoura Multa Ferramentas Ciência catalogo 91500-09

dissecção de Órgãos do zebrafish adulto

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Nos últimos 20 anos, o peixe-zebra tornou-se um organismo modelo poderoso para a compreensão do desenvolvimento de vertebrados e doença. Embora a análise experimental do embrião e larva é extensa ea morfologia tem sido bem documentada, descrições da anatomia do peixe-zebra adulto e estudos de desenvolvimento das estruturas e órgãos adultos, juntamente com técnicas para trabalhar com adultos estão faltando. Os órgãos da larva sofrer mudanças significativas em sua estrutura geral, morfologia e localização anatômica durante o larval para a transição do adulto. Externamente, a larva transparente desenvolve sua característica adulto padrão pigmentar listrada e emparelhado nadadeiras pélvicas, enquanto internamente, os órgãos submetidos a enorme crescimento e remodelação. Além disso, o primórdio gônadas bipotential desenvolve em ambos os testículos ou ovários. Este protocolo identifica muitos dos órgãos do adulto e demonstra métodos para dissecção do cérebro, gônadas, sistema gastrointestinal, coração e rim de peixe-zebra adulto. Os órgãos dissecados podem ser utilizados para hibridização in situ, imuno-histoquímica, histologia, extração de RNA, análise de proteínas, e outras técnicas moleculares. Este protocolo vai ajudar na ampliação de estudos na zebrafish para incluir a remodelação dos órgãos larval, a morfogênese de órgãos específicos para as investigações adultos e outros sistemas de órgãos do adulto.

Este protocolo descreve um procedimento para identificar e dissecar os órgãos do peixe-zebra adulto.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Nos últimos 20 anos, o peixe-zebra tornou-se um organismo modelo poderoso para a compreensão do desenvolvimento e de doenças em vertebrados. Embora a experimentação...

Nos últimos 20 anos, o peixe-zebra tornou-se um organismo modelo poderoso para a compreensão do desenvolvimento e das doenças em vertebrados. Embora a morfologia do embrião e da larva tenha sido bem documentada, há poucas descrições da anatomia de peixes-zebra adultos e das técnicas para trabalhar com indivíduos adultos. O laboratório de Mary Mullin, na Universidade da Pensilvânia, estuda o desenvolvimento das gônadas e rotineiramente realiza dissecações de ovários e testículos de peixes adultos.Este protocolo demonstra a dissecação das gônadas, bem como a identificação e dissecação dos outros sistemas orgânicos principais. Para começar, um peixe é anestesiado e eutanasiado, e então fixado em uma bandeja de dissecação. A pele e o músculo subjacente são removidos do peixe para expor o coração, o fígado, o intestino, a gônada e a bexiga natatória.Os órgãos internos são removidos da cavidade corporal. Para exames ou experimentos adicionais, Tripti Gupta, do laboratório de Mary Mullins do departamento de biologia celular e do desenvolvimento da Universidade da Pensilvânia, identificará muitos dos órgãos do adulto e demonstrará como dissecá-los de um peixe-zebra adulto. Para maior clareza e facilidade de dissecação, o sistema gastrointestinal, os testículos e o rim serão dissecados de um peixe-zebra macho e, em seguida, os ovários, o coração e o cérebro serão dissecados de uma fêmea.Para reduzir a quantidade de alimento no intestino. Não alimente os peixes no dia anterior à dissecação. Um peixe-zebra macho será dissecado.Primeiro, você precisará de uma bandeja de dissecação, tesoura de dissecação tipo Venice Spring, pinças, alfinetes de dissecação, um recipiente com PBS e um peixe que tenha sido anestesiado e eutanasiado. Seque levemente o peixe com uma toalha de papel e coloque-o de lado. Sobre a bandeja de dissecação, os peixes-zebra possuem uma única nadadeira dorsal e uma nadadeira anal, além de nadadeiras pélvicas e peitorais pareadas.Use alfinetes de dissecação para fixar o peixe ao tapete de dissecação através da parte carnuda da cauda e da porção ventral da órbita ocular. Com uma tesoura de mola, corte a pele do abdômen do peixe logo anterior à nadadeira anal. Corte a pele e o músculo subjacente ao longo do abdômen, da nadadeira anal até a cobertura dura das brânquias chamada opérculo.Use as tesouras e pin&ccedil;as para recortar o op&eacute;rculo e a barbatana peitoral, incluindo a regi&atilde;o &oacute;ssea espessa na base da barbatana chamada cintura peitoral. Remova-os para expor as br&acirc;nquias. Corte a pele e o m&uacute;sculo subjacente come&ccedil;ando acima das br&acirc;nquias expostas, seguindo posteriormente ao longo do lado do peixe, e depois descendo at&eacute; a barbatana anal.Remova cuidadosamente a pele e o músculo subjacente do lado do peixe para expor os órgãos internos. Os testículos são órgãos longos, brancos e pareados que estão presos à parede corporal dorsal. Remova um testículo e coloque-o em uma placa com PBS à temperatura ambiente. Remova a gordura associada ao testículo.Examine o testículo com luz refletida sob um microscópio estereoscópico para visualizar os túbulos seminíferos, que contêm cistos com diversos estágios de células germinativas em desenvolvimento, desde espermatogônias até espermátides. Em seguida, remova o sistema gastrointestinal da cavidade corporal do peixe; a vesícula biliar, um saco verde translúcido cheio de líquido, e o baço, que apresenta coloração vermelha brilhante, são encontrados dentro das vísceras. O fígado pode ser identificado por sua grande dimensão, morfologia lobulada, cor acastanhada e vascularização extensa.Seccione o intestino separando-o do restante dos órgãos e estique-o. As regiões anterior, média e posterior do intestino são definidas pela altura das dobras epiteliais, sendo a anterior a mais alta. Coloque um pedaço do intestino em PBS e observe as dobras epiteliais ao microscópio utilizando luz transmitida.Agora, examine a bexiga natatória. A bexiga natatória é composta por uma câmara posterior, que se conecta ao esôfago por meio do ducto pneumático, e uma câmara anterior, que se liga à orelha interna através do aparelho arquiano. Remova e descarte a bexiga natatória, retire os alfinetes do peixe e posicione-o com a face ventral voltada para cima para dissecar o rim.O rim é uma estrutura cor-de-rosa translúcida localizada ao longo da parede corporal dorsal e está associada à aorta dorsal e às células pigmentadas. O rim é dividido em regiões cefálica, corporal e caudal. Ok, então há a cabeça, o corpo do rim e a cauda.Esta é a aorta e estas são as células pigmentadas. Disseque um pedaço do rim e coloque-o em PBS sob o microscópio. Separe os tecidos renais com as agulhas para revelar os túbulos renais.Para a dissecação de um peixe fêmea, você precisará das mesmas ferramentas anteriores, acrescidas de algumas agulhas finas, uma lâmina de barbear e um recipiente com solução de Ringer. Para a dissecação do coração, seque levemente o peixe eutanasiado e fixe-o no tapete de dissecação. Como antes, utilize as mesmas técnicas descritas anteriormente para remover a pele do lado do peixe fêmea.O ovário é uma estrutura bilobada que está suspensa na cavidade corporal por um mesentério vascularizado. Remova um lobo do ovário e coloque-o em PBS. Examine o ovário com luz incidente ao microscópio.Os citos podem ser separados com agulhas finas e, em seguida, classificados em estágios com base em seu tamanho e aparência. Em seguida, dissecar o coração do peixe. O coração está localizado posterior e ventralmente às brânquias.Comece removendo o coração e todos os tecidos ao redor e colocando-o em PBS sob o microscópio. Disseque cuidadosamente os tecidos que envolvem o coração, tomando cuidado para não danificar o átrio delicado. Coloque o coração disseca­do na solução de Ringer e posicione-o sob o microscópio.Para observar a batida cardíaca, identifique o átrio, o ventrículo e o bulbo arterial. Para acessar o cérebro, remova os alfinetes do peixe e retire a cabeça com a lâmina de barbear. Remova o máximo de tecido mole possível do lado ventral do crânio com pinça.Identifique o quiasma óptico e, em seguida, remova os olhos utilizando tesoura pequena de mola. Com a pinça, quebre, abra o crânio e remova o osso do lado ventral do cérebro. Corte os nervos cranianos com a tesoura de mola.Se necessário, transfira a cabeça para um recipiente com PBS. Vire a cabeça e remova a pele e os ossos do crânio do lado dorsal do cérebro sob o microscópio, identificando os bulbos olfativos. Identifique o cefálon, o tubo óptico ULA, o cerebelo e a mácula.Aqui estão os bulbos olfativos, o cefalópodo ciano, o ula, o túbulo óptico, o cerebelo e a medula, o coração, o sistema gastrointestinal, as gônadas, a bexiga natatória, o rim e o cérebro. Foram dissecados de peixes-zebra adultos. Esses órgãos podem agora ser utilizados para hibridização in situ, imunohistoquímica, histologia, extração de RNA ou outras técnicas moleculares.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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