Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus
22 de abril de 2010
Demonstramos a utilidade da multicolor citometria de fluxo para caracterização fenotípica e funcional detalhada do total, bem como subconjuntos memória de CD4 + e CD8 + T em macacos rhesus, o modelo ideal para estudos de HIV / AIDS vacina.
Este vídeo demonstra um procedimento para estimular e corar células mononucleares do sangue periférico ou pbmc. Para análise de citometria de fluxo multicolorida, Alec Watts de pbmc isolado de sangue total é colocado em placas de cultura de tecidos. As células são estimuladas química ou biologicamente para produzir uma resposta imune.
Após a estimulação, um coquetel de anticorpos é adicionado para identificar os tipos de células com base em marcadores de superfície expressos. As células são então permeadas e um coquetel diferente de anticorpos é adicionado para detectar a expressão de citocinas intracelulares, as células são então analisadas por fatos para determinar os perfis de citocinas para subconjuntos específicos de pbmc. Olá, sou Amy Courtney, do laboratório do Dr.Jagan SAS no Departamento de Imunologia do Centro de Câncer MB Anderson da Universidade do Texas.
Oi, eu sou Hong, ela também do laboratório. Hoje mostraremos uma análise multicitometria das respostas das células T. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar as respostas imunes celulares em Reus Maca.
Então vamos começar. Comece este protocolo usando um hemocitômetro para determinar as contagens de células viáveis de pbmc de Reuss Maca pelo método de exclusão Trian Blue Dye. Trabalhando em uma capela de fluxo laminar reus.
Suspenda as células em meio completo a uma concentração de 10 milhões de células por mililitro para estimulação não específica a 100 microlitros da suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio contendo PMA e CIN para elevar o volume total para 0,2 mililitros com uma concentração final de 50 nanogramas por mililitro de PMA e 500 nanogramas por mililitro de CIN para poços de controle negativo, adicione 100 microlitros de meio completo sozinho a cada um. Bem, incube as células a 37 graus Celsius na atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono após 1,5 horas.
Um felden A para a cultura a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e incubar por mais 4,5 horas. O felden A é adicionado às citocinas trapp no aparelho G de ouro para aumentar a visibilidade com imunocoloração, após a centrífuga de estimulação para remover o meio e, em seguida, lavar adicionando 200 microlitros de lavagem de fluxo frio, tampão e centrífuga em baixa velocidade. Repita esta lavagem e reenvie 50 microlitros de tampão de lavagem de fluxo.
As células estão agora prontas para serem coradas para expressão de marcadores de superfície em cada poço das células ressuspensas. Adicione um microlitro de corante reativo aqua fluorescente fixável morto vivo preparado de acordo com as instruções do fabricante e S. Incube a quatro graus Celsius no escuro por 30 minutos enquanto as células estão incubando.
Prepare as soluções de coloração que serão usadas para fatos em microtubos. Primeiro, prepare um coquetel em pé para incluir o seguinte adequadamente. Anticorpos monoclonais marcados com fluorescência titulada, anti CD três PE SCI sete, anti CD oito Alexa 700 anti CD 28 por CCP SCI 5.5, anti CD 95 A PC e anti CD quatro Pacific Blue Inflow Wash Buffer.
Em seguida, prepare os controles de compensação, que serão usados para determinar os coeficientes de transbordamento de cada coloração individual em outros detectores, preparando um tubo de cada anticorpo conjugado fluorescentemente individualmente como uma coloração de cor única. Finalmente, prepare a fluorescência menos uma ou as colorações FMO combinando todos os reagentes, exceto o de interesse. Isso será usado para determinar o limite entre uma população positiva e negativa, duplicando os níveis de autofluorescência e os dados presentes em amostras totalmente coradas.
Depois que as células forem incubadas na mancha de mortos-vivos, lave-as uma vez com tampão de lavagem de fluxo frio para remover o excesso de corante, aspire o tampão de lavagem. Em seguida, adicione as soluções de coloração preparadas. Incube as células a quatro graus Celsius no escuro por 30 minutos.
Lave as células coradas com tampão de lavagem de fluxo frio para remover o excesso de anticorpos. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de permeação de fixação BD por pelo menos 10 minutos. Armazene as células a quatro graus Celsius no escuro por até 24 horas até que sejam usadas ou continue a marcar as citocinas intracelulares para rotular as citocinas intracelulares.
Primeiro permee as células em 100 microlitros de um permanente X. Tampão de lavagem incube por 10 minutos a quatro graus Celsius no escuro enquanto as células estão incubando. Prepare os anticorpos de coloração, os controles de compensação e os controles FMO em um tampão de lavagem permanente como antes.
Depois que as células forem incubadas por 10 minutos, gire para baixo e remova o tampão de lavagem de um x permanente. Adicione os anticorpos de coloração apropriados. Em seguida, incube as células e anticorpos por 60 minutos a quatro graus Celsius no escuro após a incubação.
Lave as células duas vezes com a solução de permeação. Após a lavagem final, resus suspende as células em aldeído paraforme a 1% em DPBS para fixar as células. Armazene as células a quatro graus Celsius no escuro até que sejam usadas por até 24 horas.
Uma vez que as células tenham sido coradas, use um citômetro de fluxo LSR dois ou ciano um citômetro de fluxo DP para realizar os fatos. Em seguida, analise os dados usando o FlowJo ou software semelhante. A composição do PBMC em reuss Maca foi determinada usando análise de fax.
Esta figura mostra o esquema de gating utilizado para a análise dos diferentes subconjuntos de células T de um animal representativo. Os linfócitos foram primeiro fechados por meio de FSC de dispersão direta versus SSC de dispersão lateral e, em seguida, os linfócitos vivos foram identificados com base na população negativa de SSC e AQUA. As células T foram então identificadas por expressão de CD três, CD quatro positivos, CD oito negativos e CD quatro negativos, oito populações positivas dentro da população de células T CDs três positivas também foram determinadas.
As células T CD quatro positivas e CD oito positivas foram distinguidas em diferentes subconjuntos com base na expressão de CD 28 e CD 95 como células de memória central e efetoras ingênuas. Esta figura mostra a produção de interferon gama e IL dois em Unstimulated e pma. A NIC estimulou quatro células T positivas e subconjuntos de CD.
Observe os perfis distintos de citocinas provocados pela estimulação. Em cada subconjunto. Temos que mostrar como realizar a análise de citometria de fluxo múltiplo do pbmc.
Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de configurar os controles de compensação de cor única e os controles fluorescentes menos um. Ambos os controles são necessários para a análise adequada dos dados de citometria de fluxo. Consulte nosso protocolo escrito para obter mais informações sobre como escolher controles de remuneração.
Além disso, lembre-se de que, ao usar anticorpos marcados com fluorescência, é importante cobrir as amostras para proteger da exposição à luz. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra um procedimento para estimular e corar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) para análise por citometria de fluxo multicolorida. O estudo foca na caracterização fenotípica e funcional de subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ em macacos-ruivos, um modelo para pesquisa de vacinas contra HIV/AIDS.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Citometria de Fluxo
- Pesquisa sobre HIV/AIDS
Antecedentes
- Macacos-ruivos são usados como modelo para o estudo do HIV/AIDS.
- O entendimento dos subconjuntos de células T é essencial para o desenvolvimento de vacinas.
- A citometria de fluxo multicolor permite uma análise detalhada das células imunes.
- Os PBMCs são componentes-chave no estudo das respostas imunes.
Objetivo do Estudo
- Caracterizar subconjuntos totais e de memória de linfócitos T.
- Utilizar citometria de fluxo multicolor para perfilhamento imune detalhado.
- Aprimorar a compreensão das respostas imunes no contexto do HIV/AIDS.
Métodos Utilizados
- Isolamento de PBMC a partir de sangue total.
- Estímulo químico ou biológico de PBMCs.
- Uso de coquetéis de anticorpos para identificar tipos celulares e marcadores de superfície.
- Análise de perfis de citocinas utilizando citometria de fluxo.
Resultados Principais
- Estimulação e coloração bem-sucedidas de PBMCs para análise.
- Identificação de subconjuntos específicos de linfócitos T com base em marcadores de superfície.
- Caracterização da expressão intracelular de citocinas.
- Informações sobre respostas imunes relevantes para HIV/AIDS.
Conclusões
- A citometria de fluxo multicolor é eficaz para a análise de linfócitos T.
- Os macacos-ruivos fornecem informações valiosas para a pesquisa de vacinas contra o HIV.
- Compreender a dinâmica dos linfócitos T é essencial para o desenvolvimento de terapias eficazes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A citometria de fluxo multicolor permite o perfilamento fenotípico e funcional preciso de subpopulações de linfócitos T em macacos-ruivos, um modelo pré-clínico essencial para o desenvolvimento de vacinas contra o HIV. Esta abordagem apoia a validação de alvos ao quantificar respostas imunes produtoras de citocinas, orientando decisões de avanço ou interrupção no estágio inicial de descoberta. O método aumenta a confiança preditiva ao associar a estimulação específica de antígenos a saídas mensuráveis de citocinas intracelulares em populações definidas de memória.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição da produção de IFN-γ e IL-2 em subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ após estimulação.
- Valor Operacional: Fornece medidas qualitativas e quantitativas da expressão intracelular de citocinas para reduzir a ambiguidade mecanicista na validação de alvos imunológicos.
- Valor Científico: Apoia a desoneração biológica por meio da detecção sensível de frações minoritárias de linfócitos T específicos por antígenos em amostras de PBMC de animais vacinados.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, estabelecendo protocolos padronizados de coloração e estimulação para perfis imunológicos reprodutíveis.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade do ensaio mediante o uso de controles de compensação e controles FMO para garantir o direcionamento preciso das populações celulares.
- Valor Científico: Destaca a preparação para triagem ao permitir a detecção de perfis de citocinas em subpopulações de células T naïve, de memória central e de memória efetora.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância para doenças ao correlacionar medições de citocinas intracelulares em macacos-ruivos com a patogênese do HIV e respostas imunes induzidas por vacinas.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade do processo, desde a descoberta até a validação pré-clínica, ao associar os resultados da estimulação de PBMCs à caracterização funcional de linfócitos T.
- Valor Científico: Enfoca o valor preditivo de redução de riscos, utilizando a produção de citocinas como leitura funcional para avaliação da imunogenicidade de vacinas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se posiciona dentro do continuum de descoberta, desde o perfil imunológico inicial até a identificação de candidatos promissores, apoiando a verificação de hipóteses e a clarificação de vias em modelos de doenças infecciosas.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses ao quantificar a produção de citocinas em subconjuntos específicos de linfócitos T após estimulação com PMA/ionomicina ou estímulo específico por antígeno.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio de estimulação padronizada, coloração de superfície e intracelular e análise citométrica de fluxo de amostras de PBMC.
- Análises: Destaca medições como as frequências de produção de IFN-γ e IL-2, que permitem a comparação de respostas imunes entre diferentes condições e subconjuntos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica ao vincular as respostas de linfócitos T induzidas por vacinas em macacos-ruivos a perfis imunológicos funcionais relevantes para o desenvolvimento de vacinas contra o HIV.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável para monitoramento imunológico longitudinal entre diferentes candidatos a vacinas e formulações de adjuvantes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista em respostas imunes mediadas por linfócitos T.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios de citometria de fluxo multicolor para perfilhamento imunológico.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre avanço ou interrupção de projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em fases avançadas de programas de desenvolvimento de vacinas.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em perfis quantitativos de citocinas em modelos pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária no design de painéis de citometria de fluxo, compensação e estratégia de seleção de eventos para imunofenotipagem multicolorida.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo citômetro de fluxo (por exemplo, LSR II) e software (por exemplo, FlowJo) para análise de dados de alta dimensionalidade.
- Requisitos de padronização entre equipes para condições de estímulo, titulação de anticorpos e configuração de controles (cores únicas e FMO) entre laboratórios.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, incluindo otimização das concentrações de estímulo e tempos de incubação para PBMC de primatas não humanos.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem: necessidade de proteção contra a luz para anticorpos fluorescentes e titulação cuidadosa para minimizar o derramamento em painéis multicoloridos.
