A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

O objetivo geral deste artigo em vídeo é fornecer respostas para as duas perguntas a seguir. Primeiro, os estudos de interações proteicas podem ser feitos de forma mais confiável medindo a fração de uma amostra de proteína que é realmente capaz de se ligar a outra proteína? Dois, como a análise cinética pode nos dar uma melhor compreensão das relações de estrutura e função?

Ambas as questões serão abordadas em um experimento envolvendo o Corp X 100, um instrumento que detecta interações de proteínas em tempo real sem o uso de rótulos. Este experimento examinará a interação da cistatina B bovina com a cistina protease papaína, a estrutura cristalina das duas proteínas em complexos aponta para vários resíduos envolvidos na ligação à protease para determinar como cada um dos resíduos que interagem afeta a interação cistatina B papin. Várias variantes da cistatina B são produzidas por mutagênese dirigida ao local.

Em tais experimentos, sempre existe a possibilidade de que as proteínas recombinantes não se dobrem corretamente, se agreguem ou se deteriorem, levando a resultados incorretos e irreproduzíveis. O VIACORE X 100 tem a capacidade de determinar a fração de proteína que está disponível para ligação por meio de análise de concentração livre de calibração abreviada como CFCA. Essa abordagem permite determinar a concentração de proteína com atividade de ligação retida, mesmo quando os padrões de calibração não estão disponíveis.

O CFCA será usado aqui para determinar a concentração das variantes da cistatina B. Esses dados serão então usados como entrada na determinação da cinética de ligação das variantes da cistatina B à Pepin, que também é avaliada usando BOR X 100. Olá, sou CLA gram da GE Healthcare na Suécia.

Hoje, minha colega Eva Pool mostrará como fazer a análise de relacionamento de função de estrutura usando BOR X 100 As proteínas recombinantes podem exibir dobramento inadequado ou atividade de caixa solta ao longo do tempo, e esse comportamento não pode ser detectado por métodos que dependem da medição da concentração total. Isso pode, com efeito, levar a dados cinéticos incorretos após as medições de concentração por análise de concentração livre de calibração. O núcleo B.A X 100 é usado para analisar a cinética e a afinidade da interação das variantes da cistatina B com o pepane.

Esses parâmetros fornecerão uma visão do mecanismo de ligação. Começamos com uma breve explicação do design experimental, então vamos começar. A interação entre a cistina, protease, papina e o inibidor cistatina B é dominada por contatos hidrofóbicos, conforme revelado pela estrutura cristalina das duas proteínas em complexo.

Do lado do inibidor, as áreas de contato são os terminais N e C Ns e duas alças fechadas. Neste estudo, quatro mutantes são examinados, cada um dos quais contém cisteína três para mutação síria introduzida para prevenir a dimerização cistatina B. Com base no contexto revelado na estrutura cristalina, a leucina 73 foi mutada em glicina, histamina 75 em glicina e tirosina 97 foi alterada para alanina. As duas mutações da glicina foram introduzidas para examinar a importância das cadeias laterais da histidina 75 e leucina 73 para a ligação à Pepin, o resíduo de tirosina foi mutado em alanina para investigar a interação entre o terminal C da cistatina B e a Pepin.

Os três mutantes duplos, bem como o INE três para o mutante único sírio, são testados quanto à sua interação com uma variante catalisamente inativa da papaína S metil popina. Esta forma catalisamente inativa do Proteus tem um grupo metil ligado a CYS 25 na fenda ativa. Para simplificar, chamaremos essa variante de propan em todo o protocolo.

O CFCA depende da medição da taxa de ligação em condições em que a taxa é limitada pela difusão de moléculas de analito para a superfície. Isso é favorecido por altos níveis de imobilização do ligante. Antes de iniciar o procedimento de imobilização, coloque o tampão HEPs usado nos experimentos na bandeja esquerda e insira os dois tubos.

Coloque também uma garrafa de lixo vazia na bandeja direita. Em seguida, insira um novo sensor de gesso cinco no instrumento, inicialize por meio do software core X 100 e, na tela inicial, clique no item de ferramenta de chip de doca. Clique em iniciar documento no software.

Em seguida, use o assistente de imobilização para configurar o pape e a imobilização visando o acoplamento à censura CM cinco na tela inicial, clique no botão de outras opções e selecione assistentes. Isso exibe uma janela com os assistentes disponíveis. Selecione imobilização e clique no novo botão No canto inferior direito, a primeira tela do assistente de imobilização aparece com o objetivo de acoplar ao sensor de gesso cinco é o padrão.

Marque a caixa na célula de fluxo dois para imobilizar na célula de fluxo dois. A célula de fluxo um é deixada sem modificações para usá-la como uma superfície de referência entre as três opções disponíveis abaixo. Marque a caixa especificar tempo de contato no nível de destino correto muda para o tempo de contato, especifique um tempo de contato de 900 segundos.

Em seguida, insira os parâmetros de imobilização em solução de ligante de barra de molécula de captura. Digite papaína. Em seguida, clique em Avançar.

A próxima tela exibe o layout do rack de amostras. A posição um vai segurar et etanolamina usado para desativar o ativo restante após o acoplamento de mira do ligante papaína à superfície do chip. Insira a solução de etanolamina na posição um na posição dois.

Coloque o ligante papaína papaína é armazenado em excesso de sulfato de metila e aludido a 50 microgramas por mililitro em tampão de acetato de sódio 10 milimolar. pH 4,5 reconstitui os reagentes de acoplamento EDC e NHS do kit de acoplamento amina com pipeta de água destilada dupla 85 microlitros de EDC em um frasco. Tampe e coloque-o na posição três.

Use o mesmo volume para NHS na posição quatro. Observe que o arquivo cinco deve ser tampado e vazio para que o instrumento misture ED, C e NHS neste arquivo. Lembre-se também de encher o arquivo de lavagem na posição H2O com água fresca deionizada.

Quando o rack estiver cheio de acordo com o contorno na tela, clique em carregar amostras e carregue o rack no instrumento. Quando o rack estiver carregado, clique em Avançar. Antes de iniciar a execução, uma lista de verificação é mostrada.

Certifique-se de que todos os marcadores sejam cumpridos quando estiverem. A corrida é iniciada pressionando o botão Iniciar. A corrida é iniciada durante o procedimento de imobilização.

Os dados são coletados em tempo real. Primeiro, os reagentes de acoplamento são injetados. Em seguida, o pape é acoplado à superfície do chip e o procedimento termina na desativação dos ésteres ativos restantes.

Após a execução, uma janela de diálogo resume o resultado da execução. Nesta janela, o nível de imobilização é exibido. Todo o procedimento de acoplamento deve resultar em cerca de 3000 RU de papaína imobilizada.

Uma vez que a papaína tenha sido imobilizada no chip do sensor, comece a análise de CFCA diluindo as amostras mutantes de cistatina B até uma concentração total de cerca de 10 nanomolares em pelo menos 300 microlitros. Registre o fator de diluição, pois o usaremos posteriormente na configuração do ensaio. Comece abrindo a caixa de diálogo do assistente conforme descrito na seção anterior na seção de concentração da pasta de ensaio.

Escolha calibração livre e, em seguida, escolha novo. A primeira tela do assistente mostra a sequência de injeção. As configurações podem permanecer inalteradas, pois o chip sensor CM cinco e uma abordagem de ensaio de imobilização direta são usados aqui.

Clique em Avançar na próxima tela. Deixe as caixas de seleção prime antes de executar e execute os ciclos de inicialização marcados. Além disso, deixe o número padrão de ciclos de inicialização inalterado em três.

Insira heaps buffer no nome do campo de solução. Em seguida, clique em Avançar. Na próxima tela, digite o nome da solução de regeneração, que é hidróxido de sódio 20 milimolar.

Deixe os outros parâmetros inalterados. Clique em Avançar para exibir a tabela de exemplo. Configure as amostras de acordo com a tabela de amostras.

Cada linha na tabela de exemplo resulta em dois ciclos. Um com vazão de 10 microlitros por minuto e outro com 100 microlitros por minuto. Comece a corrida com um espaço em branco.

Em seguida, indicar o nome coeficiente de difusão do factor de diluição a 20 graus Celsius e o peso molecular. Para cada mutante, o coeficiente de difusão pode ser calculado usando a ferramenta da web no site do produto. Um link para esta ferramenta é fornecido no navegador de suporte do software.

Como é recomendável executar cada exemplo e duplicar, copie a tabela inteira da linha em branco para o último exemplo e cole-o na parte inferior da tabela. Clique em Avançar para prosseguir. A próxima tela exibe o rack de amostras.

Coloque as amostras e reagentes no rack de acordo com o layout delineado pelo software. Carregue o rack no instrumento pressionando o botão de carga de amostras. Em seguida, clique em Avançar.

Depois de carregar as amostras, uma tela de lembrete com uma lista de verificação é exibida. Certifique-se de verificar tudo e pressione iniciar. Os dados são coletados em tempo real durante a execução.

Quando a execução for concluída, feche a janela que exibe os dados coletados. Observe que um novo item de resultado apareceu na janela principal. Para calcular as concentrações a partir dos dados, selecione o novo item de resultado e clique no botão.

Avalie via núcleo X 100. O software de avaliação é iniciado exibindo todos os dados coletados na barra de ferramentas, selecione a análise de concentração e, em seguida, a calibração livre no menu. Na primeira janela, escolha os dados a serem incluídos na análise.

Percorra a lista e percorra a lista de exibição para exibir os dados de todas as amostras. Se você quiser excluir algum dado, remova a marca de seleção da lista. Clique em Avançar para iniciar o cálculo.

O modelo de interação CFCA é ajustado automaticamente aos dados experimentais quando o ajuste é concluído, os resultados são relatados para cada amostra na janela de resultados. Percorra os acessórios para cada exemplo selecionando a linha correspondente na tabela. A coluna chamada concentração medida mostra a concentração na amostra que foi analisada.

A concentração na amostra original é calculada usando o fator de diluição inserido anteriormente e mostrado na coluna concentração calculada quando terminar, clique em concluir para salvar o resultado. Agora que conhecemos as concentrações das proteínas da análise de CFCA, temos uma excelente base para nossas medições cinéticas subsequentes. A análise cinética agora nos ajudará a entender a importância dos principais resíduos de aminoácidos para o mecanismo de ligação.

Vamos começar com uma configuração da análise cinética. A análise cinética começa com o encaixe de um novo chip sensor CM cinco no instrumento na tela inicial. Escolha criar um fluxo de trabalho de ensaio para a afinidade da cinética.

No canto superior esquerdo, aparece uma janela de diálogo onde são inseridas informações sobre o ligante. Digite o nome papaína na caixa de nome do ligante e escolha outra proteína da lista de tipos de espécies. Em seguida, selecione imobilizar o ligante covalentemente usando o chip sensor CM cinco das duas abordagens alternativas de fixação de ligantes apresentadas, o fluxo de trabalho de ensaio recomendado agora está descrito no lado direito da janela.

Começa com uma etapa de imobilização seguida por uma etapa de ensaio. Pressione continuar para continuar. Salve o fluxo de trabalho do ensaio conforme solicitado, inserindo um nome e pressionando salvar.

O software agora descreve o fluxo de trabalho do ensaio com botões associados a cada etapa. O primeiro passo na preparação da superfície do sensor é encontrar um pH de mobilização. Como esse pH é conhecido, pressione inserir valor conhecido na caixa de diálogo exibida.

Insira o nome do tampão, acetato e pH 4,5 e escolha salvar. O fluxo de trabalho do ensaio agora é atualizado com uma marca de seleção verde para indicar que esta etapa foi concluída. Agora é hora de imobilizar pressione o botão de corrida na etapa imobilizada.

Isso traz o mesmo assistente que foi usado para propano e imobilização para a análise CFCA a imobilização de papin para análise cinética é configurada da mesma maneira aqui, exceto que uma solução mais diluída é injetada por menos tempo. Isso é para imobilizar menos papin para evitar situações em que as taxas de ligação dos mutantes da cistatina sejam limitadas pela difusão, de modo que os dados cinéticos possam ser medidos isoladamente. Como o nome do ligante e o pH da imobilização foram inseridos nas etapas anteriores do fluxo de trabalho do ensaio, ambos estão predefinidos aqui.

A única atualização necessária é de 50 segundos para o tempo de contato. A imobilização prossegue como mostrado anteriormente. A ligação esperada após o nível de imobilização é de 50 R ru.

Uma marca de seleção verde ao lado do botão de execução indica que a imobilização foi concluída. Em seguida, insira a solução de regeneração no fluxo de trabalho na etapa. Encontre as condições de regeneração clicando em inserir valores conhecidos na caixa de diálogo exibida.

Insira a solução de regeneração e o tempo de contato. Em seguida, clique em salvar. Agora que o ligante está imobilizado e as condições de regeneração inseridas, tudo está configurado para gerar dados cinéticos na caixa de ensaio de afinidade cinética de execução, pressione o botão de execução na primeira etapa da cinética.

O assistente de afinidade descreve a sequência de injeção de cada ciclo para cinética de ciclo único, que é usada aqui, não há necessidade de alterar nada. Clique em próximo para prosseguir. Na próxima etapa, mantenha as configurações padrão indicando a preparação do sistema antes de executar.

Escolha executar um ciclo de inicialização para equilibrar a superfície do cavaco. Em seguida, defina os parâmetros de injeção para a amostra. Como a solução de regeneração foi especificada anteriormente e a configuração é predefinida, não há necessidade de alterar nenhum dos parâmetros na tela.

Clique em Avançar. Por fim, especifique os exemplos. Insira duas linhas para cada variante mutante, uma em branco e outra com amostra.

Um ciclo em branco é indicado definindo o parâmetro de concentração mais alta como zero. Dois. As variantes da cistatina B podem ser ajustadas em cada corrida. Para cada mutante, insira o peso molecular, a concentração mais alta e o fator de diluição, pressione próximo.

Na tela a seguir, o rack de amostras é esboçado. Prepare uma série de diluições das amostras de proteínas e coloque os frascos com tampas no rack Conforme descrito na tela, um frasco com tampão é colocado na posição 13 e um frasco com a solução de regeneração é colocado na posição 14. Certifique-se de preencher a posição da água com água doce.

Coloque o rack na máquina e carregue as amostras pressionando o botão carregar amostras e clique em próximo. Como antes, execute uma verificação final antes de prosseguir com a execução do experimento pressionando iniciar dados de interação aparecem em tempo real. Quando a corrida terminar, prossiga imediatamente com a execução das variantes restantes da cistatina B de acordo com o que acabamos de demonstrar.

Se as variantes restantes da cistatina B forem executadas sucessivamente, omita a etapa principal e o ciclo de inicialização desmarcando as caixas de seleção correspondentes na etapa. Quando cada execução é concluída, os dados podem ser acessados a partir do link. Todos os resultados no fluxo de trabalho do ensaio.

Uma janela de diálogo com todos os resultados gerados neste fluxo de trabalho é exibida. Para calcular as constantes de taxa cinética, selecione o resultado a ser avaliado e pressione evaluate para que um software de avaliação X 100 core seja iniciado novamente exibindo todos os dados coletivos. Selecione afinidade cinética no menu da barra de ferramentas.

Na primeira triagem, o mutante cisteína três para sírio é selecionado para avaliação. Os dados desse mutante são exibidos junto com a execução em branco executada para esse mutante, continue clicando. Próximo. A próxima tela mostra os dados com a execução em branco subtraída da execução com amostra.

Escolha avaliar a cinética clicando no botão cinética. Agora escolha ajustar os dados a um modelo de interação um-para-um. Ao clicar no botão ajustar, o ajuste é exibido na tela à medida que é calculado.

Quando estiver pronto, os controles de qualidade são aplicados automaticamente e destacados na parte inferior. Examine os itens de controle de qualidade e, em seguida, observe os dados do grama do sensor para garantir que os gramas do sensor mostrem curvatura suficiente. Além disso, dê uma olhada no gráfico de resíduos que mostra as diferenças entre os dados coletados e o modelo ajustado.

Preste atenção aos desvios sistemáticos e não aleatórios. Este ajuste é aceitável. Agora dê uma olhada nos dados cinéticos na guia do relatório.

A constante de taxa de associação, a constante de taxa de dissociação e a constante de dissociação de equilíbrio. Quando terminar, pressione concluir para repetir o mesmo procedimento para todos os outros mutantes. Aqui estão os resultados representativos da análise de CFCA para as diferentes variantes de cistatina B examinadas.

Os dados de concentração de ligação específica são extraídos dos gramas do sensor obtidos em vazões de 10 e 100 microlitros por minuto. Ao comparar a concentração determinada por uma medição de dois 80 com a determinada pelo CFCA, fica claro que, embora na maioria dos casos a proteína esteja totalmente ativa para a variante da glicina leucina 73, a fração da proteína ativa é muito baixa. A cinética das variantes da cistatina B que se ligam à pepina é determinada usando cinética de ciclo único.

Os gramas do sensor mostram dados em branco e subtraídos de referência com cinética para um modelo de interação um-para-um sobreposto em preto. A concentração de ligação específica medida pelo CFCA para a variante leucina 73 é apenas cerca de 10% da concentração total de proteínas, conforme determinado por uma medição de dois 80. Ao usar a concentração correta no cálculo dos parâmetros cinéticos, fica claro que a taxa de associação para Lucien 73 é semelhante à das outras variantes.

Embora as taxas de associação dos mutantes sejam comparáveis às da proteína do tipo selvagem, a constante de taxa de dissociação dos mutantes pode ser maior em cerca de duas ordens de magnitude com um aumento correspondente na constante de dissociação de equilíbrio. As afinidades reduzidas dependem principalmente do aumento das taxas de dissociação, indicando que tanto a segunda alça de ligação quanto a extremidade terminal C da cistatina B contribuem para a afinidade de ligação, mantendo o inibidor ligado à enzima uma vez que o complexo foi formado, o uso da análise de concentração livre de calibração foi essencial para esta conclusão porque um dos mutantes acabou por ter uma atividade de ligação muito baixa, Meu colega Pol agora mostrou como usar o bi core X 100 em um estudo de função estruturada. Ao realizar esses experimentos, é importante lembrar que, embora a concentração e a análise cinética sejam baseadas no mesmo procedimento de ligação, as condições experimentais são bastante diferentes.