Name: Microfluídicos Co-cultura de células epiteliais e bactérias para a Investigação Solúvel sinal mediada por interações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-20T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprenda a usar um modelo microfluídico de co-cultura para estudar a colonização de patógenos em células epiteliais HeLa com E. coli comensal e EHEC. Este método permite visualizar interações bacterianas por microscopia de fluorescência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado em parte pelo National Science Foundation (CBET 0.846.453) e os Institutos Nacionais de Saúde (1R01GM089999).

1. Fabricação de mestres de silício usando fotolitografia SU-8 padrão 1 (não é mostrado neste vídeo). <ol><li> Uso padrão SU-8 métodos de fotolitografia para criar um SU-8 "mestres" (SU-8 2050, Microchem, Newton, MA) para a fabricação de diferentes componentes (membranas PDMS de diferentes espessuras, co-cultura câmara) em uma sala limpa. Moldes como mestre pode ser fabricado em qualquer instalação de microfabricação (por exemplo, Stanford microfluídica Fundição; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Antes da replicação do PDMS, exponha o SU-8 mestres de vapor fluorosilane em um dessecador conectado a uma fonte de vácuo para facilitar a liberação fácil de PDMS do mestre. Adicionar uma gota de fluorosilane para uma toalha de papel e aplicar vácuo para uma min. Remova a vácuo e aguarde 30 min para a deposição de fluorosilane. Mantenha o mestre SU-8 em um recipiente fechado para uso futuro. </li></ol> 2. Moldagem réplica de PDMS de SU-8 master 2 <ol><li> A camada fluídica ea camada de controle são feitos por moldagem réplica de PDMS de SU-8 master. </li><li> Misture o PDMS pré-polímero e cross-linker em um wt 10:01. relação e desgaseificar em secador durante uma hora (ou até que as bolhas de ar são removidos da mistura de PDMS). </li><li> Coloque o mestre-8 SU numa placa de Petri e cuidadosamente despeje a mistura PDMS em cima do mestre SU-8. Degas do PDMS novamente. </li><li> Girar o molde a 1200 rpm por um minuto para obter uma espessura uniforme de cerca de PDMS 100μm sobre o molde. </li><li> Aqueça a placa de petri contendo o PDMS eo SU-8 molde mestre em 80 ° C por uma hora para curar o PDMS. </li><li> Remover o curado PDMS coberto SU-8 mestre do fogão. </li><li> Descasque o molde PDMS do mestre SU-8. </li><li> Faça quatro furos no molde PDMS usando uma agulha de calibre 20 blunt-end para duas entradas bactérias, uma saída e uma porta pneumática. </li></ol> 3. Colagem de Multilayer PDMS dispositivos: Este dispositivo é montado com três camadas, uma camada superior que contém o canal principal, uma camada pneumática meio, e uma camada inferior de bactérias que contém os canais para as bactérias. As três camadas são montados conforme descrito abaixo. <ol><li> Molhar as membranas PDMS com metanol e cuidadosamente descascá-los de seus SU-8 molde mestre usando uma pinça limpa. Membrana lugar em uma folha de teflon. </li><li> Coloque a membrana pneumática ea camada fluídica em uma câmara de plasma de oxigênio. Ligue plasma por 40 segundos (pressão de oxigênio 10 sccm, RF potência de 100W). </li><li> Após a exposição ao plasma, alinhar (10 minutos) da membrana na parte inferior PDMS canal usando o fórceps. Adição de metanol na membrana e as camadas de PDMS ajuda a livre circulação das camadas, alinhamento e torna mais fácil. Neste caso, o dispositivo é colocado em um pedaço de gaze para permitir que os vapores de metanol para escapar. </li><li> Cure as camadas alinhadas PDMS numa placa de aquecimento a 80 ° C por 8 h. </li><li> Após a colagem da membrana pneumática para a camada inferior, repita os passos de 3,2-3,4 para unir o canal superior para o dispositivo montado PDMS composto. </li></ol> 4. A montagem do dispositivo de PDMS 3,4 <ol><li> Faça furos nos portos de entrada e saída usado para semeadura células eucarióticas e bactérias. </li><li> Conecte a tubulação de Tygon (0,01 polegadas OD) para os portos e operam na camada pneumática, puxando com uma seringa de 20 mL. </li><li> Coloque o modelo PDMS e uma lâmina de vidro pré-limpeza em uma câmara de plasma de oxigênio. Ligue plasma por 20 segundos (pressão de oxigênio 20 sccm, RF potência de 300W) sem aplicar o vácuo. </li><li> , A fim de evitar o contacto entre a parede ilha de ligação (PDMS) para a lâmina de vidro, imediatamente se conectar uma seringa para o dispositivo e aplicar vácuo puxando a seringa e mantê-lo no lugar. </li><li> Pressione suavemente o modelo PDMS no vidro (2 minutos). </li><li> Cure o dispositivo PDMS a 80 ° C por 10 minutos. </li></ol> 5. Tratar a superfície de vidro com fibronectina <ol><li> Esterilizar dispositivo sob UV por 15 minutos depois de conectar tubos Tygon para cada porta. </li><li> Preenchimento e fluxo da PBS esterilizado para o canal para remover quaisquer detritos no canal. Aplicar o fluxo por 10 minutos para remover bolhas de ar. As bolhas de ar podem facilmente escapar do PDMS por causa de sua permeabilidade ao gás. </li><li> Preencher uma solução corante de cor no canal pneumático para prevenir a formação de bolhas de ar no canal. </li><li> Para facilitar a semeadura célula eucariótica no vidro, introduzir uma solução a 1 mg / mL de fibronectina no dispositivo e incubar por 40 min a 37 ° C. </li><li> Lavar o excesso de fibronectina com 1 mL de meio de crescimento. </li></ol> 6. Formação e medição de comensais E. biofilme em Escherichiailhas <ol><li> Diluir as bactérias comensais (eg, E. coli BW25113/pCM18) em media M9 mínimos para OD 600 ~ 1 para a formação de um biofilme comensais nas câmaras fechadas / ilhas. </li><li> Feche a parede ilha, aplicando-líquido positivo de pressão. Um conversor de pressão caseira ar-líquido é usado para prevenir a formação de bolha de ar no canal. </li><li> Introduzir o E. comensais coli nas ilhas com a válvula fechada, e permitir que as bactérias para anexar por 1 hora a 32 ° C. </li><li> Lave as bactérias solto e perfundir uma suspensão bacteriana diluída (OD 600 ~ 0,05) em 0.25mL/hr por 12 horas. </li><li> Lavar o biofilme com a mídia crescimento fresco DMEM para remover bactérias fracamente ligados e se preparar para fixação das células eucarióticas. </li><li> A imagem do biofilme usando uma Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope (Bannockburn, IL), e visualizar a arquitetura do biofilme usando o software IMARIS 5. </li></ol> 7. Semeadura células eucarióticas em torno de ilhas bacteriana 6-8 <ol><li> Trypsinize células HeLa do frasco de cultura de tecidos e ressuspender em DMEM mídia para uma densidade de semeadura de 5 x 10 5 células / mL. </li><li> Introduzir células HeLa no dispositivo a uma vazão de 2 mL / min usando uma bomba de seringa Picoplus (Harvard Apparattus, MA). Certifique-se que a parede ilha é reduzida para que o biofilme bacteriano é separada da região de células HeLa. Esta etapa deve ser realizada no palco de um microscópio de luz para que a uniformidade de semeadura pode ser determinada. </li><li> Grampo da tomada de célula para reduzir o movimento da suspensão de células no canal e incubar por 6 horas a 37 ° C em 5% incubadora de CO 2. </li><li> Perfundir o dispositivo com o meio de crescimento de 0,5 mL / hr para remover as células acopladas. </li><li> Atualizar os meios de comunicação DMEM para HeLa e E. comensais coli a cada 6 horas. </li></ol> 8. Introdução de bactérias patogênicas na ilha e exposição a células eucarióticas <ol><li> Prepare E. coli O157: H7 (EHEC) para infectar as células HeLa em uma multiplicidade de infecção (moi) de 100:1 200:1 (número de EHEC por célula HeLa). </li><li> Enxaguar e lavar fracamente ligados bactérias comensais. </li><li> Introduzir uma suspensão diluída EHEC (OD 600 ~ 0,1) para as ilhas. </li><li> Incubar dispositivo a 37 ° C em 5% incubadora de CO 2 por 6 horas sem fluxo para permitir a EHEC ser exposto a sinais presentes no biofilme comensais. </li><li> Levantar o muro PDMS para expor EHEC nas ilhas comensais às células HeLa por 6 horas. </li><li> Lave o canal com PBS e mancha para as células vivas e mortas utilizando o kit Live / Dead (L3224, Invitrogen, CA). </li><li> Locais de várias imagens em um microscópio Zeiss 200M Axiovert fluorescência e estimar o número de células vivas e mortas. </li></ol> 9. Resultados representativos 9 A seqüência de eventos em infecções do trato GI foi imitado pelo desenvolvimento de uma monocamada de células HeLa e um comensal E. biofilme coli e expondo EHEC para o biofilme comensais antes da infecção de células HeLa. As etapas envolvidas na fabricação do modelo de co-cultura microfluídicos são mostrados na Figura 1. Figura 2A mostra uma renderização 3-dimensional do dispositivo co-cultura. As duas regiões no dispositivo de co-cultura da câmara de cultura de células eucarióticas e da ilha de bactérias são mostrados na Figura 2B com tintas de cores diferentes (roxo para as regiões eucarióticas e verde para a ilha de bactérias). A viabilidade de isolar as regiões cultura bacteriana da região envolvente eucarióticas é mostrado na Figura 2C usando corantes. Figura 3 mostra os resultados representante da co-cultura de células epiteliais e bactérias. Figura 3A mostra a colonização do biofilme comensais (verde) por ilha EHEC (vermelho) Figura. 3B mostra a justaposição das células epiteliais e E. comensais coli com EHEC na ilha bacteriana. O RFP expressando GFP EHEC e expressando bactérias comensais estão localizadas na ilha quando a parede PDMS é reduzida, ilustrando a viabilidade de isolar a ilha de bactérias a partir de células epiteliais. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: esquema de celular semeadura no modelo de co-cultura. (1) A parede PDMS é reduzido para formar uma ilha, bactérias comensais são introduzidos na ilha, e fibronectina é corria ao redor da ilha. (2) células HeLa são semeados nas regiões que cercam a ilha. (3) Depois de células HeLa atingir confluência e do biofilme comensais se desenvolveu, EHEC é introduzido na ilha. (4) A parede PDMS é levantadaaté expor as células HeLa em torno da ilha para EHEC. Inset mostra detalhes do funcionamento da válvula. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="Figura 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2a"> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="Figura 2bc" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2BC"> Figura 2: Modelo microfluídicos para co-cultura de células epiteliais e bactérias. (A) versão tridimensional do dispositivo co-cultura mostrando-pneumaticamente acionada regiões armadilhas para a formação de ilhas de bactérias entre as células epiteliais. Cada ilha bacteriana (1200 mm e diâmetro de 1.000 M de distância) tem uma entrada separada e saída para fornecer meios de crescimento e remoção de resíduos da ilha. (B) Micrografia do dispositivo co-cultura com tintas de cores mostrando as diferentes regiões (zona de células epiteliais, ilhas bacteriana). (C) A fidelidade do sistema de captura pneumático é mostrado através da redução da parede PDMS (painel esquerdo) usando um canal de pneumaticamente ativada (azul), introduzindo a tintura roxa nas ilhas fechadas ilha, e fluindo corante amarelo em torno dele por 48 h. Quando a parede é levantada PDMS (painel direito), a região insular é exposta ao corante amarelo ao redor. Barra de escala representa 500 mm. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Co-cultura de células HeLa e bactérias. (A) imagem de fluorescência de RFP-expressando GFP-EHEC e expressando E. coli BW25113 na ilha. (B) Sobreposição de transmissão, verde e vermelho imagens de fluorescência no dispositivo. Barra de escala representa 200 mM.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+integrated+passive+valves+and+pumps+for+flexible+polymer+3-dimensional+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems.</a> Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).</li>
<li>Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatically+controllable+flexible+and+polymeric+microfluidic+valve+fabricated+via+in+situ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromech+Microeng%22%5BJournal%5D)">A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development.</a> J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).</li>
<li>Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+multiplexed+control+of+latching+pneumatic+valves+using+microfluidic+logical+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures.</a> Lab Chip. 6, 623-631 (2006).</li>
<li>Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole+is+an+inter-species+biofilm+signal+mediated+by+SdiA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA.</a> BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+with+tunable+topographies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices with tunable topographies.</a> Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).</li>
<li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+sensing+hydrogel+microstructures+into+micropatterned+hepatocellular+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures.</a> Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).</li>
<li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-Chip%22%5BJournal%5D)">Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions.</a> Lab-on-Chip. , (2009).</li>
</ol>

Ensaios convencionais para fixação e colonização de patógenos utilizam uma monocamada de células eucarióticas em placas de cultura de tecido em que os patógenos são adicionados. Estes modelos não são fisiologicamente relevantes como eles não incorporam um biofilme bacteriano comensais desenvolvida em células eucarióticas. Simples adição de uma cultura pré-grown bacteriana às células eucarióticas é improvável que levam a essa conformação como biofilmes são estruturas altamente organizadas que se desenvolvem ao longo do t...

<table><tbody><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>máscara de fotolitografia de alta resolução (16.256 dpi)</td><td>Fineline-Imaging Inc, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctil)silano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77279</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30002.02</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga programável</td><td>Laurell Tech Corp</td><td>WS0650S</td><td></td></tr><tr><td>alinhamador de máscara</td><td>Neurotronix</td><td>Q4000</td><td></td></tr><tr><td>gravador a plasma de oxigênio</td><td>March Plasma System, CA</td><td>CS-1701</td><td></td></tr><tr><td>bomba de seringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidade/Citotoxicidade Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluídicos co-cultura de células epiteliais e bactérias para a investigação solúvel sinal mediada por interações

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

O ser humano no trato gastrointestinal (GI) é um ambiente único em que células do epitélio intestinal e não-patogênicos (comensais) bactérias coexistem. Tem sido proposto que o microambiente que o patógeno encontra na camada de comensais é importante para determinar a extensão da colonização. Métodos de cultura atual para investigar a colonização de patógenos não são adequados para investigar esta hipótese, pois não permitem co-cultura de bactérias e células epiteliais de uma forma que imita o microambiente do trato GI. Descrevemos aqui um modelo de co-cultura microfluídicos que permite que a cultura independente de células eucarióticas e bactérias, e testar o efeito do microambiente comensais sobre a colonização do patógeno. O modelo de co-cultura é demonstrada através do desenvolvimento de um comensal<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Biofilme entre as células HeLa, seguido pela introdução de entero<em&gt; E. coli</em&gt; (EHEC) na ilha comensais, em uma seqüência que imita a seqüência de eventos em infecção do trato GI.

Este protocolo descreve um modelo de co-cultura microfluídicos para a cultura simultânea e localizada de células epiteliais e bactérias. Este modelo pode ser usado para investigar o papel dos diferentes sinais moleculares solúveis na patogênese, bem como tela a eficácia do suposto probiótico cepas bacterianas.

Microfluídicos Co-cultura de células epiteliais e bactérias para a Investigação Solúvel sinal mediada por interações

O trato gastrointestinal (GI) humano é um ambiente único no qual células epiteliais intestinais e bactérias não patogênicas (comensais) coexistem. Ele possui ...

Este protocolo demonstra o uso de um novo modelo de co-cultivo microfluídico que permite o cultivo independente de células eucarióticas e bactérias, a fim de testar o efeito do microambiente comensal na colonização por patógenos. O modelo de co-cultivo é demonstrado mediante o desenvolvimento de um biofilme de Escherichia coli comensal entre células HeLa, seguido pela introdução de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) na ilha comensal, em uma sequência que simula a ordem de eventos observada na infecção do trato gastrointestinal.O grau resultante de colonização das células epiteliais por EHEC é visualizado utilizando microscopia de fluorescência. Olá, sou do laboratório de biotecnologia de sistemas moleculares do Departamento de Engenharia Química da Texas e M University. Hoje vamos mostrar um procedimento para cultivar bactérias e células eCard juntas em um dispositivo microfluídico, de maneira que imita a organização do trato gastrointestinal humano.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar como a colonização de células epiteliais por bactérias patogênicas é afetada pelos sinais que elas encontram no trato tri antes da colonização. Vamos começar. Antes da experimentação, prepare um molde de silício projetado e fabricado de acordo com o uso experimental pretendido.Por exemplo, a Stanford Microfluidics Foundry fabricará moldes mestres projetados a partir dos quais podem ser feitos moldes réplica subsequentes para experimentos. São necessários moldes para duas membranas da camada de cultura de células eucarióticas e da camada pneumática, e um canal bacteriano para o dispositivo de três camadas descrito neste protocolo; as alturas dos canais para as camadas bacteriana, pneumática e de cultura de células eucarióticas são de 5, 200 e 100 micrômetros, respectivamente. Antes de preparar um molde réplica, exponha o molde mestre de SU-8 ao vapor de fluorociclina em um dessecador conectado a uma fonte de vácuo. Para facilitar a liberação fácil do molde de PDMS do molde mestre, adicione uma gota de fluoro lane a uma toalha de papel na câmara de vácuo e aplique vácuo por um minuto.Remova o vácuo e aguarde 30 minutos para a deposição de fluoro. Mantenha o molde mestre de SU-8 em uma placa de Petri para uso futuro na criação de moldes réplica. Prepare o pré-polímero de PDMS e o agente reticulante em uma proporção de peso de 10 para 1 e misture bem; dessaque a mistura em uma câmara de vácuo por uma hora.Para remover bolhas de ar, coloque o molde mestre SU-8 em uma placa de Petri e despeje cuidadosamente o PDMS sobre o molde mestre usando cinco gramas de PDMS para a e 30 gramas de PDMS para a camada bacteriana. Desgaseifique novamente o PDMS por 10 minutos para remover bolhas de ar. Em seguida, gire o molde por um minuto para espalhar o PDMS em uma membrana uniforme.Neste protocolo, a membrana de cultura celular de eucariotos é centrifugada a 1200 RPM para uma espessura de 150 micrômetros, e a membrana pneumática é centrifugada a 800 RPM para uma espessura de 250 micrômetros. Após a centrifugação, mantenha a placa de Petri contendo o PDMS centrifugado e o molde-mestre SU oito por 15 minutos à temperatura ambiente antes de aquecer em uma placa aquecedora a 80 graus Celsius por uma hora. Para curar o PDMS após a cura, umedeça o PDMS com metanol e retire cuidadosamente dos moldes-mestres SU oito usando pinças limpas.Coloque a camada bacteriana sobre um estereoscópio e, utilizando uma agulha de ponta romba de 20 gauge, faça três furos: duas entradas para bactérias e uma saída. O dispositivo de três camadas é montado na seguinte ordem: ligação da camada pneumática à camada bacteriana e, em seguida, ligação da camada de cultura de células eucarióticas à camada bacteriana mais a camada pneumática.Coloque a membrana pneumática e a camada bacteriana sobre uma lâmina de vidro e exponha ao plasma em uma câmara de plasma de oxigênio por 40 segundos, a uma pressão de oxigênio de 10 centímetros cúbicos padrão por minuto, ou SCCM, e potência de radiofrequência, ou RF, de 100 watts. A adição de metanol nas membranas facilita o movimento livre das camadas e torna o alinhamento mais fácil. Dentro de 10 minutos após a exposição ao plasma de oxigênio, posicione a camada bacteriana em uma placa de Petri utilizando pinça e estereoscópio.Alinhe a membrana pneumática central à camada bacteriana com base nos orifícios de entrada e saída para as bactérias. Após o alinhamento, coloque a placa de Petri com a estrutura de PDMS alinhada em uma placa aquecedora a 80 graus Celsius por oito horas para promover a ligação. Quando esse processo estiver concluído, faça um furo na camada pneumática para controlar o canal pneumático.Em seguida, repita os passos de montagem até alinhamento para ligar o canal de cultura de células eucarióticas ao dispositivo PDMS compósito montado. Faça furos nas portas de entrada e saída utilizadas para semear as células eucarióticas. Conecte tubos de tigon às portas e opere a camada pneumática puxando com a seringa de 20 mililitros.Coloque a estrutura composta de PDMS e uma lâmina de vidro previamente limpa em uma câmara de plasma de oxigênio. Ligue o plasma por 20 segundos sem aplicar vácuo. Remova a estrutura composta de PDMS da câmara de plasma de oxigênio e conecte uma seringa de 20 mililitros a ela.Puxe imediatamente, criando um vácuo para evitar o contato entre as válvulas e o vidro. Deslize dentro de um minuto. Após a exposição ao plasma, pressione suavemente a estrutura de PDMS compósito contra o vidro.Polimerize o dispositivo de PDMS em uma placa aquecedora a 80 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, conecte tubos de tigon a cada porta e esterilize o dispositivo sob luz UV por 15 minutos. A seguir, preencha 500 microlitros de PBS estéril em uma seringa de um mililitro e introduza no canal para remover qualquer resíduo.Se uma bolha de ar for observada, prenda o tubo de saída com um tubo de microcentrífuga einor e aplique pressão leve para forçar a bolha a sair através das camadas de PDMS permeáveis a gases. Encha o canal pneumático com água estéril para prevenir a formação de bolhas de ar no canal.Um conversor caseiro de pressão de ar para líquido é utilizado para prevenir a formação de bolhas de ar no canal pneumático. Para preparar a semeadura de células eucarióticas sobre o vidro, introduza 500 microlitros de fibronectina na região de cultura celular pela entrada de cultura de células eucarióticas. Usando uma seringa, mantenha a válvula fechada e incube por 40 minutos a 37 graus Celsius.Por fim, lave o excesso de fibronectina com um mililitro de meio de crescimento utilizando a bomba de seringa. O dispositivo está agora pronto para ser usado no experimento para formar um biofilme comensal: dilua as bactérias em meio mínimo M nove até uma OD 600 de aproximadamente um. Neste exemplo, utilizamos uma linhagem de laboratório de e coli, mas qualquer linhagem bacteriana não patogênica pode ser utilizada.Feche a válvula que separa as regiões de cultura celular bacteriana e eucariótica aplicando pressão líquida positiva. Introduza 0,2 mililitros de E. coli com um OD 600 de aproximadamente 1,0 nas ilhas utilizando uma bomba de seringa e permita que as bactérias se liguem por uma hora a 32 graus Celsius. Após a incubação.Perfunde uma suspensão bacteriana diluída com OD 600 de aproximadamente 0,05 e meio mínimo M nove a 0,25 mililitros por hora durante 12 horas. Usando a bomba de seringa, lave o biofilme com 0,5 mililitros de meio DMEM fresco, sem soro e sem antibiótico, a 0,5 mililitros por hora com uma bomba de seringa para remover bactérias fracamente aderidas e preparar para a imagem da adesão de células eucarióticas ao biofilme. Utilize um microscópio confocal a laser de varredura Leica T-C-S-S-P cinco e visualize a arquitetura do biofilme usando o software MS.Descongele os olhos com tripsina, células HeLa de um frasco de cultura de tecidos e ressuspenda. Suspenda-as em meio DMEM até um volume total de 0,1 mililitros com uma densidade de semeadura de cinco vezes 10 à quinta células por mililitro. Introduza as células HeLa na região eucariótica do dispositivo a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto utilizando uma bomba de seringa Pico Plus.Em seguida, utilizando um microscópio óptico, certifique-se de que a válvula que separa a região bacteriana comensal da região de células eucarióticas está completamente fechada, de modo que o biofilme bacteriano fique separado da região das células helo. Usando um grampo para tubo de microcentrífuga einor, feche a saída celular para reduzir o movimento da suspensão celular no canal e incube por seis horas a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, perfunda o dispositivo utilizando uma bomba de seringa com 50 microlitros de meio de crescimento DMEM a 0,5 mililitros por hora.Para remover as células não aderidas, troque o meio DMEM para as regiões de hela e de e coli comensal a cada seis horas. Prepare o e coli oh 1 5 7 H sete, ou EHEC, em meio M nove para infectar as células hela com uma multiplicidade de infecção, ou MOI, de 100 a 200 células de EHEC para uma célula hela. Lave as bactérias comensais fracamente aderidas conforme descrito na seção anterior. Introduza uma suspensão diluída de EHEC de 100 microlitros com OD 600 de aproximadamente 0,1 nas ilhas por meio de uma bomba de seringa com uma taxa de fluxo de 0,25 mililitros por hora.Em seguida, incubar o dispositivo a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de dióxido de carbono por seis horas sem fluxo, para permitir que a EHEC seja exposta aos sinais presentes no biofilme comensal. Após a incubação, abrir a válvula que separa as regiões bacteriana comensal e de células eucarióticas utilizando uma bomba de vácuo para criar vácuo e manter a válvula aberta por seis horas. Isso exporá a HEC no biofilme bacteriano comensal às células HeLa; em seguida, realizar nova incubação por seis horas a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de dióxido de carbono.Introduza a coloração vital viva-morta no dispositivo preparado de acordo com as instruções do fabricante. Para coloração da viabilidade celular helo, injete 0,1 mililitros da solução padrão na área eucariótica do dispositivo utilizando uma seringa de um mililitro como controle para estimar a morte celular helo. Na ausência de EHEC, repita os três passos anteriores e introduza meio DMEM estéril, livre de soro e antibióticos, no dispositivo.Em vez de EHEC, visualize múltiplas localizações em um microscópio de fluorescência Zeiss AIOt 200 M e estime o número de células epiteliais vivas em verde entre as células epiteliais mortas em vermelho, contando o número de células verdes a partir de imagens obtidas em pelo menos sete localizações. Agora, mostraremos algumas imagens representativas do dispositivo microfluídico com camada de ensaio. Nesta imagem, utilizamos corante alimentício inerte para representar as diferentes regiões de cultura.O corante roxo representa a região de cultura celular eucariótica, enquanto o corante verde representa o biofilme bacteriano comensal. Nesta imagem, demonstramos a viabilidade de manter as regiões eucariótica e bacteriana distintas uma da outra, já que o corante roxo na região bacteriana é distinto do corante amarelo ao redor. A colonização do biofilme bacteriano comensal que expressa proteína verde por bactérias patogênicas que expressam proteína vermelha é mostrada aqui.Como mostrado nesta imagem, as bactérias EHEC e as bactérias comensais são distintas das células HeLa que circundam o biofilme bacteriano. Acabamos de mostrar como montar um dispositivo microfluídico em camada seca para o cultivo conjunto de bactérias e células epiteliais e investigar normalmente o efeito de sinais solúveis na colonização por patógenos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de remover quaisquer bolhas no dispositivo e usar o patógeno em uma multiplicidade de infecção celular apropriada.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

microfluidic-co-culture-epithelial-cells-bacteria-for-investigating

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

As bactérias produzem compostos secretados que têm o potencial de afetar a fisiologia de seus vizinhos microbianas. Aqui nós descrevemos uma tela de co-cultura, que permite a detecção de tais quimicamente mediadas entre espécies interações misturando os micróbios do solo com cepas repórter transcrição fluorescentes de Bacillus subtilis em meios sólidos.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

Descreve-se um protocolo in vitro de co-cultura intestino microbiota e vilosidades intestinais por um período prolongado utilizando um sistema microphysiological intestino humano-on-a-chip.

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Apresentamos um protocolo para investigar o crosstalk entre Caco-2 X-ray-irradiados e células mononucleares do sangue periférico (PBMC). O protocolo começa com a instalação e Caco-2 irradiação da cultura co com PBMC; posteriormente, resistência elétrica trans-epitelial é medida regularmente durante 48 h e ocidental do borrão realizados em PBMC e Caco-2.

Um método de co-cultura para investigar o Crosstalk entre raio-x irradiados PBMC e células Caco-2

Este relatório descreve um método chip-baseado microfluídicos para estabelecer uma única experiência da cultura da pilha em que o emparelhamento de alta eficiência e a análise microscópica de pilhas únicas múltiplas podem ser conseguidos.

Estabelecendo co-culturas baseadas em uma única célula de forma determinística com um chip Microfluídico

Este estudo descreve o monitoramento microscópico da adesão pneumococcus às cordas do fator von Willebrand produzidas na superfície de células endotélias primárias humanas diferenciadas estresse de cisalhamento em condições de fluxo definidas. Este protocolo pode ser estendido à visualização detalhada de estruturas celulares específicas e quantificação de bactérias aplicando procedimentos diferenciais de imunocoloração.

Infecção pneumocócica de células endotélias humanas primárias em fluxo constante

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

O protocolo apresentado descreve o desenvolvimento e o uso de uma técnica de coloração de actina filamentosa à base de faloidina com microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) para visualizar a estrutura da camada celular aderente em canais de cultura dinâmica microfluídica e câmaras tradicionais de cultura estática de poço fixo. Essa abordagem auxilia na avaliação da confluência da camada celular, da formação da monocamada e da uniformidade da espessura da camada.

Preparação e avaliação estrutural de monocamadas de células epiteliais em um dispositivo de cultura microfluídica de tamanho fisiológico

Este artigo fornece um protocolo detalhado com as principais etapas para orientar a engenharia e a utilização do 3D Flipwell. Descrevemos e mostramos como montar as pilhas de inserções de co-cultura e utilizá-las para co-cultura de camadas estratificadas de bactérias intestinais, epitélios intestinais e macrófagos para modelar o ambiente da mucosa intestinal.

Engenharia 3D Flipwell para o desenvolvimento de sistemas assíncronos para terapias toxicológicas e imunomoduladoras em células bacterianas, intestinais e imunológicas

O estudo apresenta um método para investigação in vitro de infecção bacteriana utilizando organoides intestinais derivados de células-tronco teciduais. O protocolo descreve como cultivar e diferenciar organoides em duas dimensões, infectá-los com Escherichia coli invasiva aderente e avaliar leituras-chave, incluindo ruptura da barreira epitelial, imagem de infecção e resposta de RNA epitelial.

Uma cultura organoide bidimensional em extrato de invasina ou membrana basal para estudar as interações hospedeiro-bactéria

Aprenda a usar um modelo microfluídico de co-cultura para estudar a colonização de patógenos em células epiteliais HeLa com E. coli comensal e EHEC. Este método permite visualizar interações bacterianas por microscopia de fluorescência.

Microfluídicos Co-cultura de células epiteliais e bactérias para a Investigação Solúvel sinal mediada por interações

Explorar mais vídeos