Name: Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda a quantificar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável usando um dispositivo microfluídico com E. coli RP 4 37. Este método permite estudar o movimento direcionado de bactérias em resposta a estímulos químicos.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo National Science Foundation (CBET 0.846.453).

1. Fabricação de mestres de silício usando fotolitografia SU-8 padrão 1 (não é mostrado neste vídeo). <ol><li> Uso padrão SU-8 métodos de fotolitografia para criar um SU-8 "master" (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA) para a fabricação do molde PDMS que contém a rede microfluídicos e câmara de quimiotaxia. Moldes como mestre pode ser fabricado em qualquer instalação de microfabricação (por exemplo, Stanford microfluídica Fundição; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Antes da replicação do PDMS, exponha o SU-8 master vapor fluorosilane em um dessecador conectado a uma fonte de vácuo para facilitar a liberação fácil de PDMS do mestre. Adicionar uma gota de fluorosilane para uma toalha de papel e aplicar vácuo para uma min. Remova a vácuo e aguarde 30 min para a deposição de fluorosilane. Mantenha o mestre SU-8 em um recipiente fechado para uso futuro. </li></ol> 2. Moldagem réplica de PDMS de SU-8 master: A camada fluídica ea camada de controle são feitos por moldagem réplica de PDMS de SU-8 master. <ol><li> Misture o PDMS pré-polímero e cross-linker em um wt 10:01. relação e desgaseificar em um dessecador por 1 hora (ou até que as bolhas de ar são removidos da mistura de PDMS). </li><li> Coloque o mestre-8 SU numa placa de Petri e cuidadosamente despeje a mistura PDMS em cima do mestre SU-8 com a espessura desejada. </li><li> Aqueça a placa de petri contendo o PDMS eo SU-8 molde mestre em 80 ° C por duas horas para curar o PDMS. </li><li> Remover o curado PDMS coberto SU-8 mestre da placa e casca do molde PDMS do SU-8 master. A estrutura desejada será incorporado no molde PDMS. </li><li> Faça furos no molde PDMS para tubulação para o gerador de gradiente e de entrada de células usando uma agulha de calibre 20 blunt-end. </li></ol> 3. Colagem de PDMS dispositivos: <ol><li> Limpe uma lâmina de vidro com isopropanol e seco com nitrogênio ou um fluxo de ar. </li><li> Expor o PDMS e vidro deslizante para plasma de oxigênio em um asher plasma. </li><li> Traga o molde PDMS em contato com a lâmina de vidro. Aqueça o slide contactado e mofo PDMS a 65 ° C por 15 min. </li></ol> 4. A montagem do dispositivo de PDMS <ol><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar tubos em um ângulo de 45 ° para o comprimento correto necessário para o dispositivo. </li><li> Insira uma extremidade do tubo nos orifícios perfurados no dispositivo (por exemplo, saída) usando uma pinça. </li><li> Utilizando uma pinça, insira uma agulha de calibre 30 sem corte na outra extremidade do tubo. </li><li> Repita o passo 4.2 para todos os buracos restantes. </li><li> Coletar 1 ml de quimiotaxia buffer (CB) em uma seringa de 3ml, tendo o cuidado de remover bolhas de ar da seringa. </li><li> Fixar um hub agulha para uma extremidade da tubulação de saída. </li><li> Adicionar CB ao hub agulha, e toque no hub agulha para remover quaisquer bolhas de ar. </li><li> Empurrar um pouco para fora CB da ponta da seringa e conecte a seringa 3mL ao hub agulha sem aprisionamento de ar. </li><li> Empurre CB através do dispositivo até que todos os hubs agulha restantes são preenchidos com a CB. Isso deve remover a maioria das bolhas de ar. </li><li> Preencher duas seringas com 500μL CB contendo as concentrações adequadas dos chemoeffector sendo testado. Eliminar a formação de bolhas de ar empurrando uma pequena gota do conteúdo da seringa e tocar a gota do líquido no hub agulha e anexando. </li><li> Da mesma forma, conectar uma seringa contendo CB para a entrada de bactérias. Este será removida quando as bactérias são introduzidas no dispositivo. </li></ol> 5. Crescimento de E. altamente móveis coli <ol><li> Crescer durante a noite culturas de E. coli RP437 com uma expressão de GFP plasmídeo em 20 mL de caldo de triptona (TB) em 32 ° C com agitação. Adicionar concentrações adequadas de antibiótico para manter o plasmídeo. Em nosso protocolo, usamos um pCM182 baixa cópia do plasmídeo para a detecção de bactérias com base na fluorescência no dispositivo. Para E. coli, as culturas a crescer a 32 ° C é recomendado para alta motilidade, sendo a mobilidade é menor em temperaturas mais altas. </li><li> Use a cultura durante a noite para inocular uma cultura de 20 mL de TB em um erlenmeyer de 250 mL de densidade óptica, a 600nm de ~ 0,05. Crescer a cultura com agitação a 32 ° C. </li><li> Colher as células em uma OD de 600 ~ 0,35 0,45 pela baixa velocidade de centrifugação a 400 xg por 5 min. </li><li> Ressuspender as células a uma OD de 600 ~ 0,35 em CB contendo o chemoeffector na concentração esperada no meio do canal. </li><li> Adicionar RFP marcado células mortas em uma OD de 600 ~ 0,35 para as células expressando GFP-viver. Os mortos (vermelho), as células são usados ​​como um controle interno para assegurar que qualquer migração não é devido aos efeitos de fluxo. </li></ol> 6. Quimiotaxia de monitoramento <ol><li> Remover alguns dos CB da agulha de entrada celularhub. Refil com a suspensão de células. </li><li> Preencha cuidadosamente a seringa 50μL com as células ressuspenso. Esta etapa deve ser feito lentamente como flagelos pode ser cortado e vai reduzir a motilidade. </li><li> Conecte a seringa 50μL para o hub de entrada agulha conforme descrito nas etapas passo 4.10. </li><li> A posição do dispositivo no palco de um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera de alta velocidade para aquisição de imagem. Coloque as seringas de entrada (tanto os 500 seringas gradiente mL e 50 mL seringa de células) na bomba de seringa e iniciar o fluxo de tal forma que o gradiente é formado e células estão fluindo através do tubo. </li><li> Uma vez que as células entram na câmara de quimiotaxia, espere ~ 20 min para o sistema se estabilize antes de imagem. </li><li> Colete verde (ao vivo) e vermelho (mortos) imagens de fluorescência em diferentes locais ao longo do comprimento da câmara (correspondentes a diferentes tempos de exposição). Normalmente, coletamos 100 imagens de cada local em intervalos de 3 segundos. </li></ol> 7. Análise de dados: Os seguintes passos podem ser realizadas usando qualquer programa de análise de imagem disponível no mercado (por exemplo, ImageJ, Metamorph) ou usando códigos simples escrito em Matlab. <ol><li> Remover os pixels na imagem de fundo (ou seja, regular a intensidade do pixel limiar e remover todos os pixels que têm intensidade menor do que o limiar). Este ruído minimiza na análise. </li><li> Use a posição das células mortas (fluorescência vermelha) para determinar o centro da imagem. Uma vez que as células mortas não mostram quimiotaxia, esta representa a posição onde as células entraram na câmara de quimiotaxia e seria detectada na ausência de qualquer migração. </li><li> Localizar células vivas (fluorescência verde) na imagem. </li><li> Divide a imagem em canais e determinar o número de células vivas em cada canal. Em nosso trabalho anterior 3, a 1050 m de largura quimiotaxia câmara foi dividida em 64 canais que são cada ~ 16 m de largura. </li><li> Repita os passos 7,1 7,3 para todas as imagens e soma a contagem celular total para cada canal em todas as imagens. Isto dá a contagem de células total detectado em cada canal ao longo da duração do experimento. </li><li> Calcular o coeficiente de partição quimiotaxia (CPC), que representa a direção da migração, da seguinte forma: Cada célula localizada na alta concentração (direita) e baixa concentração (à esquerda) os lados das células mortas é atribuído um multiplicador de +1 e -1 , respectivamente. Isto é, uma célula que migra de um gradiente é multiplicado por um, enquanto as células se movendo para baixo o gradiente são multiplicados por -1. Todos os valores multiplicados são somados e normalizados para o número total de células detectadas. Por exemplo, um valor de CPC de 0,40 indica que 40% a mais do total de bactérias mudou-se para o lado concentração elevada do que o lado de baixa concentração (ou seja, o chemoeffector é um atrativo a mais bactérias foram detectadas movendo-se o gradiente). </li><li> Calcular o coeficiente de migração quimiotaxia (CMC), que pesa a migração de células, a distância percorrida, como segue: contagem de Peso da célula em cada canal por um fator que é proporcional à distância que as células migram. Uma célula que se move para a posição mais distante de alta concentração (canal 64) é dado um factor de ponderação de 1, enquanto que aquele que se move na metade do lado maior concentração é dado um factor de ponderação de 0,5, e uma célula de se mudar para o mais distante baixa concentração de posição é ponderada por -1. Soma-se todas as contagens de células ponderada e normalizar o número de células para gerar o CMC. </li></ol> Resultados representante 3,4: Temos utilizado o dispositivo micro (Figura 1A) descrito aqui para investigar quimiotaxia de E. coli em gradientes de atrativos (ácido aspártico, autoinducer-2) e repelentes (NISO 4, indole) 3,4. O protótipo tensão quimiotaxia 5 E. coli expressando GFP RP437 foi utilizado, juntamente com canamicina-morto E. coli TG1 células expressando a proteína fluorescente vermelha para monitorar os efeitos de fluxo. O gradiente de concentração formado no dispositivo μFlow é mostrado na Figura 1B. A entrada de celulares foi tampado para que não havia fluxo através dele e um gradiente estável de 0 a 100 ng / mL de fluoresscein foi estabelecido no dispositivo. A intensidade dos pixels através do dispositivo foi utilizado para determinar o perfil de concentração de fluoresceína. Os dados mostram que as bactérias encontram um gradiente linear quando entram na câmara de quimiotaxia. Figura 2A e B mostra imagens de fluorescência de E. migrando RP437 coli em resposta a gradientes de ácido aspártico (0 100 mM) e Niso 4 (0 225 mM). As respostas observadas para essas attractant canônica e repelente são como previsto. Figura 3A mostra a distribuição quantificada da E. coli RP437 na ausência de um gradiente de concentração (ou seja, gradiente nulo de ácido aspártico), enquantoFiguras 3B e C mostram a distribuição em gradientes de ácido aspártico ea NISO 4. A especificidade dessas respostas (ou seja, o viés da migração) é evidente como E. RP437 coli Δ tar tensão (ie, sem a tensão quimiorreceptora Tar que é usado em E. coli para detectar o ácido aspártico e níquel) não demonstra a tendência da migração na presença de um gradiente de concentração de ácido aspártico ou NISO 4. As tendências evidentes nos perfis de distribuição espacial também são consistentes com os valores calculados e CPC CMC. Os valores de CPC para a migração de E. coli RP437 em gradientes de ácido aspártico ou NISO 4 são 0,33 e -0,33, respectivamente. Os valores correspondentes CMC são 0,13 e -0,14, respectivamente. Em contraste, o CPC ea CMC valores com o E. coli RP437 Δ tensão tar em gradientes de ácido aspártico ou NISO 4 são desprezíveis. Além disso, o CPC e CMC em um gradiente nulo de ácido aspártico são 0,03 e 0,02, respectivamente, e indicam a falta de parcialidade na migração, na ausência de um gradiente. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> Figura 1. Esquemática do dispositivo e gradiente de concentração. (A) Representação esquemática do dispositivo quimiotaxia microfluídicos. O dispositivo consiste de um módulo de gradiente de mistura (20 x 100 x 18.750 mm) e um módulo quimiotaxia de observação (20 x 1050 x 11500 mm). As larguras dos dois canais gradiente de entrar no dispositivo são 500 mm ea largura da entrada da bactéria é 50 mm. A inserção mostra um gradiente de molécula sinalizadora (cinza) e bactérias migrar em resposta a ele. Bactérias vivas são descritas como formas ovais sólida, enquanto que bactérias mortas são mostrados como ovais aberto. (B) um gradiente de concentração entre 0 e 100 ng / mL de fluoresceína foi gerada no dispositivo e fotografada usando microscopia de fluorescência. Imagens de fluorescência foram adquiridas após 30 min e quantificadas por análise de imagem. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Quimiotaxia de E. coli RP437 no dispositivo microfluídicos. E. coli RP437 foi exposto a um gradiente de (A) 0-100 mM L-aspartato ou (B) 0-225 mM NISO 4 no dispositivo e a migração de bactérias vivas (verde) em direção a L-aspartato ou longe de níquel imaged cada segundo de 2,5 para 30 min. Bactérias mortas (vermelho) serviu como controle dos efeitos de fluxo no dispositivo. As imagens foram quantificados utilizando um in-house desenvolveu análise Program3. Os dados apresentados são representativos pseudo-colored imagens a partir de três experimentos independentes. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Figura 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Figura 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3b"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Figura 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3c"> Figura 3: Quantificação de perfis de migração para um atrativo canônica e repelente. Distribuição espacial da RP437 no dispositivo microfluídicos em resposta a (A) 100 uniformes mM L-aspartato (ie, sem gradiente), (B) um 0 gradiente M 100 de aspartato, e (C) um 0 gradiente M 225 da NISO 4 . A distribuição de células mortas é mostrado como uma linha sólida, a distribuição das células RP437 é mostrado como uma linha tracejada, ea distribuição de células RP437 eda + Δ tar é mostrado como uma linha pontilhada. Os dados apresentados são uma média de três experimentos independentes.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

O coeficiente de partição quimiotaxia (CPC) eo coeficiente de migração quimiotaxia (CMC) pode ser calculado como descrito na Mao et al 5. Se uma célula é detectada no lado de alta concentração, é dado um valor de 1, enquanto que uma célula detectada no lado de baixa concentração é dado um valor de -1. Os valores são somados e divididos pelo número total de células para gerar o CPC. O sinal do CPC (positivo ou negativo) dá a direção da migração (ou para longe de um sinal). Embora o CPC indica se as c...

um dispositivo micro para quantificar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Quimiotaxia permite que as bactérias abordagem fontes de produtos químicos ou atrativo para evitar fontes de produtos químicos repelentes. Bactérias monitorar constantemente a concentração de chemoeffectors específicas, comparando a concentração atual para a concentração detectados alguns segundos antes. Esta comparação determina a direção líquido de movimento. Embora múltiplos, gradientes concorrentes freqüentemente coexistem na natureza, abordagens convencionais para investigar quimiotaxia bacteriana são de qualidade inferior para a quantificação da migração em resposta a gradientes de concentração de atrativos e repelentes. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo de quimiotaxia microfluídicos para a apresentação de gradientes de concentração precisa e estável de chemoeffectors a bactérias e quantitativamente a investigar sua resposta ao gradiente aplicado. O dispositivo é versátil na medida em que gradientes de concentração de qualquer concentração desejada absoluta e força de gradiente pode ser facilmente gerado pela mistura difusivo. O dispositivo é demonstrada usando a resposta de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 a gradientes de aminoácidos e íons níquel.

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um dispositivo micro para investigar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável de chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

A quimiotaxia permite que as bactérias se aproximem de fontes de substâncias químicas atraentes ou evitem fontes de substâncias químicas repelentes. As bactérias monitoram constantemente o...

E. coli RP4-37 são introduzidas em um dispositivo de quimiotaxia onde são expostas a uma concentração espacial definida. Os gradientes aos quais as células estão expostas ao entrar na câmara encontram o ponto médio do gradiente de concentração. Dependendo de o sinal ser percebido como um atrativo ou repelente, as bactérias se movem rapidamente para cima ou para baixo ao longo do gradiente de concentração.Olá, sou Derek Engler do Laboratório de Biotecnologia de Sistemas Moleculares e do Departamento de Engenharia Química da Universidade Texas A&M. Hoje vamos mostrar um procedimento para investigar o quimiotaxismo bacteriano em um dispositivo microfluídico. Utilizamos este procedimento em nossos laboratórios para estudar como o E. coli RP437 migra em um gradiente de concentração de sulfato de níquel.Então vamos começar. A camada fluidica e a camada de controle são fabricadas por moldagem por replica&ccedil;&atilde;o de Polymethyl SUBOXANE ou PDMS a partir do molde SU oito. Para iniciar este procedimento, misture o pr&eacute;-pol&iacute;mero de PDMS e o agente de reticula&ccedil;&atilde;o numa propor&ccedil;&atilde;o de 10 para 1 em peso.Desgasifique a mistura em um dessecador por uma hora, até que as bolhas de ar sejam removidas. Quando a mistura de PDMS estiver pronta, coloque o molde SU oito em uma placa de Petri e despeje cuidadosamente a mistura sobre o molde SU oito até a espessura desejada. Aqueça a placa de Petri contendo o PDMS e o molde SU oito a 80 graus Celsius por duas horas para curar o PDMS.Após duas horas, remova da placa aquecida o SU-8 mestre revestido com PDMS curado e desprenda o molde de PDMS do mestre SU-8. A estrutura desejada ficará embutida no molde de PDMS; utilize uma agulha romba de calibre 20 para perfurar quatro orifícios no molde de PDMS, destinados à tubulação para o gerador de gradiente, entrada celular e saída celular. Agora estamos prontos para montar o dispositivo de PDMS e selar o dispositivo de PDMS.Primeiro, limpe uma lâmina de microscópio de vidro com isopropanol e seque-a com um jato de ar. Em seguida, exponha o molde de PDMS e a lâmina de vidro ao plasma de oxigênio em um atacador a plasma por cerca de 30 segundos. Coloque o molde de PDMS em contato com a lâmina de vidro. Aqueça a lâmina e o molde de PDMS em contato a 65 graus Celsius em uma placa aquecedora por 15 minutos.Para montar o dispositivo de PDMS, use uma lâmina de barbear para cortar a tubulação em um ângulo de 45 graus no comprimento correto necessário, dependendo da configuração do microscópio. Em seguida, usando pinças, insira uma extremidade da tubulação em um dos quatro orifícios perfurados no dispositivo.Insira a extremidade romba da agulha de calibre 30 na outra ponta do tubo. Repita a inserção do tubo e da extremidade da agulha em todos os orifícios restantes. Carregue um mililitro de quimiotáticos, tampão ou CB em uma seringa de três mililitros.Cuidado para remover o ar da seringa. Adicione CB à conexão da agulha de saída usando uma pipeta e bata suavemente na conexão para remover quaisquer bolhas de ar. Expulse um pouco de CB pela ponta da seringa de três mililitros e conecte a seringa à conexão da agulha sem aprisionar ar.Empurre o CB através do dispositivo até que todas as conexões restantes da agulha estejam preenchidas com CB. Isso deve remover a maioria das bolhas de ar. Em seguida, encha duas seringas de 500 microlitros com CB contendo as concentrações apropriadas do efetor químico que está sendo testado.Elimine a formação de bolhas de ar expulsando uma pequena gota do conteúdo da seringa e tocando as gotas do líquido no conector da agulha, e fixe a seringa para preparar bactérias altamente móveis. Para o experimento de quimiotaxia, cultive uma cultura de E. coli RP437 com expressão de GFP, contendo um plasmídeo, em caldo tripton ou TB a 32 graus Celsius com agitação, no dia seguinte. Use a cultura de crescimento noturno para inoculação de uma cultura de 20 mililitros de TB em um frasco erlenmeyer de 250 mililitros até uma densidade óptica a 600 nanômetros de aproximadamente 0,05.Cultive a cultura a 32 graus Celsius com agitação quando as células apresentarem uma OD 600 de aproximadamente 0,35 a 0,45. Recolha-as por centrifugação de baixa velocidade e ressuspenda as células até uma OD 600 de cerca de 0,35 em CB contendo o efetor químico na concentração esperada no centro do canal. Por fim, adicione células mortas marcadas com RFP a uma OD 600 de aproximadamente 0,35 às células vivas que expressam GFP.Essas células mortas servirão como controle interno para garantir que qualquer migração não seja devida a efeitos de fluxo. A suspensão celular está agora pronta para ser carregada no dispositivo microfluídico para o experimento de quimiotaxia. Para iniciar o experimento de quimiotaxia, remova parte do CB da agulha de entrada celular e reabasteça com a suspensão celular.Encha cuidadosamente uma seringa de 50 microlitros com as células ressuspendidas. Faça isso lentamente, pois os flagelos podem ser rompidos, o que reduzirá a motilidade. Conecte a seringa de 50 microlitros ao alojamento da agulha de entrada conforme mostrado anteriormente, expulsando uma pequena gota do conteúdo da seringa e tocando a gota ao líquido no alojamento da agulha; em seguida, conecte a seringa e posicione o dispositivo na platina de um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera de alta velocidade para aquisição de imagens.Coloque ambas as seringas de entrada na bomba de seringa e inicie o fluxo de modo que o gradiente seja formado e as células fluam através da tubulação. Assim que as células entrarem na câmara de quimiotaxia, aguarde cerca de 20 minutos para que o sistema se estabilize. Antes da aquisição de imagens, colete imagens de fluorescência verde (vivas) e vermelha (mortas) em tempo real em diferentes posições ao longo do comprimento da câmara.Tipicamente, coletamos 100 imagens em cada localização com intervalos de três segundos. As imagens de fluorescência adquiridas podem ser analisadas usando qualquer programa de análise de imagens disponível comercialmente, como Image J ou Metamorph, ou utilizando códigos simples escritos em MATLAB. Neste exemplo, usaremos códigos em MATLAB.Inicie removendo os pixels de fundo na imagem por meio desse valor definido de intensidade de pixel, e elimine todos os pixels que possuem intensidade inferior ao limiar. Isso minimiza o ruído. Na análise, utilize a posição das células mortas para determinar o centro da imagem.Esta é a posição onde as células entraram na câmara de quimiotaxia e onde seriam detectadas na ausência de qualquer migração. Em seguida, localize as células vivas na imagem, divida a imagem em canais e determine o número de células vivas em cada canal. Em nosso trabalho anterior, a câmara de quimiotaxia com largura de 10 a 50 micrômetros foi dividida em 64 canais, cada um com cerca de 16 micrômetros de largura.Após repetir essas etapas para todas as imagens, some as contagens totais de células para cada canal em todas as imagens. Isso fornece a contagem total de células detectadas em cada canal ao longo da duração do experimento. Calcule o quimiotax, coeficiente de partição ou CPC, que representa a direção da migração.Ao executar os seguintes passos, atribua um multiplicador de mais um e menos um a cada célula localizada nos lados de alta concentração ou direito e de baixa concentração ou esquerdo das células mortas, respectivamente. Some todos os valores multiplicados e normalize pelo número total de células detectadas. Calcule a quimiotaxia, o coeficiente de migração ou CMC, que pondera a migração das células pela distância percorrida.Uma célula que se move para o canal da posição de maior concentração, 64, recebe um fator de ponderação de mais um, enquanto uma célula que se desloca até a metade do lado de maior concentração recebe um fator de ponderação de mais 0,5. Uma célula que se move para a posição de menor concentração mais distante é ponderada com menos um. A soma de todas as contagens ponderadas de células é normalizada pelo número de células para gerar o CMC.Este gráfico mostra um gradiente de concentração linear ou perfil formado no dispositivo microfluídico utilizando isotiocianato de fluoresceína. A formação de um gradiente de concentração é demonstrada nesta figura usando corantes azul e amarelo. A entrada celular foi CA para que não houvesse fluxo através dela, e pode-se observar que uma faixa de cores entre azul e amarelo é formada.Aqui estão imagens em pseudocores de um experimento representativo de quimiotaxia no qual E. coli RP437 foi exposta a um gradiente de zero a 100 micromolares de L-aspartato ou de zero a 225 micromolares de sulfato de níquel no dispositivo. A migração de bactérias verdes vivas em direção ao L-aspartato ou afastando-se do níquel foi registrada a cada 2,5 segundos durante 30 minutos. Bactérias mortas, mostradas em vermelho, serviram como controle para os efeitos de fluxo no dispositivo.A distribuição espacial do RP 4 37 no dispositivo microfluídico na ausência de um gradiente é mostrada neste gráfico, em comparação com sua resposta a um gradiente de aspartato e a um gradiente de sulfato de níquel. Acabamos de mostrar como monitorar as quimiotaxes do E. coli RP 4 37 em um gradiente de sulfato de níquel. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de minimizar a agitação turbilhonar das células para que uma subpopulação altamente móvel possa ser utilizada.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biology

Biologia

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Fonte: Scheidweiler, D., et al. Combinando dispositivos fluídicos com microscopia e citometria de fluxo para estudar o transporte microbiano em meios porosos em escalas espaciais. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra o uso de um dispositivo microfluídico para quantificar a motilidade bacteriana por meio de uma matriz porosa composta por pilares dispostos aleatoriamente. Bactérias marcadas com fluorescência são introduzidas no dispositivo, imagens por microscopia enquanto se movem pela...

Avaliando a Motilidade Bacteriana Usando um Dispositivo Microfluídico

Este vídeo demonstra o ensaio de quimiotaxia de neutrófilos usando um método all-on-chip. O método permite o isolamento direto de neutrófilos do sangue total por seleção imunomagnética negativa seguida de ensaio de quimiotaxia em um chip microfluídico.

Um método baseado em chip microfluídico para análise rápida de quimiotaxia de neutrófilos usando sangue total

Este protocolo detalha um ensaio concebido para medir a quimiotaxia de neutrófilos humanos a partir de uma gota de sangue total com reprodutibilidade robusta. Esta abordagem evita a necessidade de separação de neutrófilos e requer apenas alguns minutos de ensaio tempo de preparação. O chip de microfluídica permite a medida repetida de quimiotaxia de neutrófilos ao longo do tempo em crianças ou pequenos mamíferos, onde o volume da amostra é limitado.

Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

Este artigo fornece o método detalhado de realização de um teste rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando o isolamento de neutrófilos no chip do sangue total e o teste de quimiotaxia em um único microfluídico.

Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

Migração de células coletivas em desenvolvimento, cicatrização de feridas e metástase oncológica é muitas vezes guiada pelos gradientes de fatores de crescimento ou moléculas de sinalização. Descrito aqui é um sistema experimental que combina microscopia de tração com um sistema microfluídico e uma demonstração de como quantificar a mecânica da migração coletiva gradiente bioquímico.

Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

É apresentado um protocolo para a geração de paisagens químicas dinâmicas por fotolise dentro de configurações microfluidas e milfluidas. Essa metodologia é adequada para estudar diversos processos biológicos, incluindo o comportamento motil, a absorção de nutrientes ou adaptação a produtos químicos de microrganismos, tanto no nível celular quanto populacional.

Gerando paisagens químicas controladas e dinâmicas para estudar comportamento microbiano

Apresentado aqui está o protocolo para um ensaio in situ chemotaxis, um dispositivo microfluido recentemente desenvolvido que permite estudos de comportamento microbiano diretamente no ambiente.

In Situ Chemotaxis Assay para examinar o comportamento microbiano em ecossistemas aquáticos

Aqui, descrevemos o uso de placas de gradiente indutor para avaliar a motilidade bacteriana, ao mesmo tempo em que obstruindo múltiplas respostas de concentração.

Quantificando a motilidade de enxame de superfície bacteriana em placas de gradiente indutor

Aprenda a quantificar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável usando um dispositivo microfluídico com E. coli RP 4 37. Este método permite estudar o movimento direcionado de bactérias em resposta a estímulos químicos.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

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