Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

E Coli RP 4 37 são introduzidos em um dispositivo de quimiotaxia onde são expostos a concentrações espaciais definidas. As células de gradiente que entram na câmara encontram o ponto médio do gradiente de concentração. Dependendo se o sinal é percebido como um atrativo ou repelente, as bactérias se movem rapidamente para cima ou para baixo no gradiente de concentração.

Olá, sou Derek Engler, do Laboratório de Biotecnologia de Sistemas Moleculares e do Departamento de Engenharia Química da Texas a and m University. Hoje mostraremos um procedimento que investiga os impostos de quimioterapia bacteriana em um dispositivo microfluídico. Usamos esse procedimento em nossos laboratórios para estudar como a e coli RP 4 37 migra em gradiente de concentração de sulfato de níquel.

Então vamos começar. A camada fluídica e a camada de controle são feitas por moldagem de réplica de Polimetil SUBOXANE ou PDMS do mestre SU oito. Para iniciar este procedimento, misture o pré-polímero PDMS e o reticulador em uma proporção de peso de 10 para um.

Desgaseifique a mistura em um dessecador por uma hora até que as bolhas de ar sejam removidas. Quando a mistura PDMS estiver pronta, coloque o mestre SU oito em uma placa de Petri e despeje cuidadosamente a mistura em cima do mestre SU oito até a espessura desejada Calor. A placa de Petri contendo o PDMS e o molde mestre SU oito a 80 graus Celsius por duas horas para curar o PDMS.

Após duas horas, remova o mestre SSU oito coberto com PDMS curado da placa quente e retire o molde PDMS do mestre SU oito. A estrutura desejada será embutida no molde PDMS usando uma agulha de ponta romba de calibre 20 perfurar quatro furos no molde PDMS para tubulação para o gerador de gradiente, entrada de célula e saída de célula. Agora estamos prontos para montar o dispositivo PDMS para unir o dispositivo PDMS.

Primeiro, limpe uma lâmina de microscópio de vidro com isopropanol e experimente com um Airstream. Em seguida, exponha o molde PDMS e a lâmina de vidro ao plasma de oxigênio em um gravador de plasma por cerca de 30 segundos. Coloque o molde PDMS em contato com a lâmina de vidro Aqueça a lâmina em contato e o molde PDMS a 65 graus Celsius em uma placa quente por 15 minutos.

Para montar o dispositivo PDMS, use uma lâmina de barbear para cortar a tubulação em um ângulo de 45 graus no comprimento correto necessário, dependendo da configuração do microscópio. Em seguida, usando fórceps. Insira uma extremidade do tubo em um dos quatro orifícios perfurados no dispositivo.

Insira um cubo de agulha de calibre 30 sem corte na outra extremidade do tubo. Repita a inserção do tubo e do cubo da agulha para todos os orifícios restantes. Carregue um mililitro de taxas de quimioterapia, tampão ou CB em uma seringa de três mililitros.

Ter o cuidado de retirar o ar da seringa. Adicione CB ao cubo da agulha de saída usando uma pipeta e bata no cubo da agulha para remover quaisquer bolhas de ar. Empurre um pouco de CB para fora da ponta da seringa de três mililitros e conecte a seringa ao cubo da agulha sem reter o ar.

Empurre o CB através do dispositivo até que todos os cubos de agulha restantes estejam cheios de cb. Isso deve remover a maioria das bolhas de ar. Em seguida, encha duas seringas de 500 microlitros com CB contendo as concentrações apropriadas do efetor de quimioterapia que está sendo testado.

Elimine a formação de bolhas de ar empurrando uma pequena gota do conteúdo da seringa e tocando as gotas do líquido no cubo da agulha e conectando a seringa para preparar bactérias altamente móveis. Para o experimento de quimiotaxia, cultive uma cultura noturna de e coli RP 4 37 com uma expressão GFP, plasmídeo em caldo tripton ou TB a 32 graus Celsius com agitação no dia seguinte. Utilizar a cultura durante a noite para inocular uma cultura de 20 ml de TB num erlenmeyer de 250 ml até uma densidade óptica de 600 nanómetros de cerca de 0,05.

Cultive a cultura a 32 graus Celsius com agitação quando as células estiverem em um OD 600 de cerca de 0,35 a 0,45. Colha-os por centrifugação de baixa velocidade resus suspender células a um OD 600 de cerca de 0,35 em CB contendo o efetor de quimioterapia na concentração esperada no meio do canal. Finalmente, adicione células mortas marcadas com RFP em nenhum D 600 de cerca de 0,35 ao GFP que expressa células vivas.

Essas células mortas serão um controle interno para garantir que qualquer migração não seja devido a efeitos de fluxo. A suspensão celular está agora pronta para ser carregada no dispositivo microfluídico para o experimento de quimiotaxia. Para iniciar o experimento de quimiotaxia, remova um pouco do CB do refil do cubo da agulha de entrada da célula com a suspensão da célula.

Encha suavemente uma seringa de 50 microlitros com as células ressuspensas. Faça isso lentamente, pois os flagelos podem ser cortados, o que reduzirá a motilidade. Conecte a seringa de 50 microlitros ao cubo da agulha de entrada, conforme mostrado anteriormente, empurrando uma pequena gota do conteúdo da seringa e tocando a gota no líquido no cubo da agulha e conectando a seringa, posicione o dispositivo no stage de um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera de alta velocidade para aquisição de imagem.

Coloque as duas seringas de entrada na bomba da seringa e inicie o fluxo de forma que o gradiente seja formado e as células fluam através do tubo. Assim que as células entrarem na câmara de impostos de quimioterapia, espere cerca de 20 minutos para que o sistema se estabilize. Antes da imagem, colete imagens de fluorescência verde e vermelha morta em diferentes locais ao longo do comprimento da câmara.

Normalmente, coletamos 100 imagens em cada local em intervalos de três segundos. As imagens de fluorescência adquiridas podem ser analisadas usando qualquer programa de análise de imagem disponível comercialmente, como Image J ou metamorfo, ou usando códigos simples escritos em matlab. Neste exemplo, usaremos códigos MATLAB.

Comece removendo os pixels de fundo da imagem por meio dessa intensidade de pixel de limite definida e remova todos os pixels com intensidade menor que o limite. Isso minimiza o ruído. Na análise, use a posição das células mortas para determinar o centro da imagem.

Isso representa a posição em que as células entraram na câmara de quimiotaxia e onde seriam detectadas na ausência de qualquer migração. Em seguida, localize as células vivas na imagem, divida a imagem em canais e determine o número de células vivas em cada canal. Em nosso trabalho anterior, a câmara de impostos de quimioterapia de 10 a 50 micrômetros de largura foi dividida em 64 canais, cada um com cerca de 16 micrômetros de largura.

Depois de repetir essas etapas para todas as imagens, algumas das contagens totais de células para cada canal em todas as imagens. Isso fornece a contagem total de células detectada em cada canal durante o experimento. Calcule os impostos de quimioterapia, coeficiente de partição ou CPC, que representa a direção da migração.

Ao executar as etapas a seguir, atribua um multiplicador de mais um e menos um a cada célula localizada nos lados de alta concentração ou direita e baixa concentração ou esquerdo das células mortas, respectivamente. Some todos os valores multiplicados e normalize para o número total de células detectadas. Calcule os impostos de quimioterapia, coeficiente de migração ou CMC, que pesa a migração das células pela distância percorrida.

Uma célula que se move para o canal de posição de concentração mais alta 64 recebe um fator de ponderação de mais um, enquanto uma que se move até a metade do lado de concentração mais alta recebe um fator de peso de mais 0,5 e uma célula. Mover-se para a posição de baixa concentração mais distante é ponderado por menos um. Algumas de todas as contagens de células ponderadas e normalizadas para o número de células para gerar o CMC.

Este gráfico mostra um gradiente ou perfil de concentração linear formado no dispositivo microfluídico usando isotiocianato de fluoresceína. A formação de um gradiente de concentração é demonstrada nesta figura usando corantes de cor azul e amarelo. A entrada da célula era CA para que não houvesse fluxo através dela, e pode-se ver que uma gama de cores entre azul e amarelo é formada.

Aqui estão imagens pseudocoloridas de um experimento de quimiotaxia representativo no qual a E coli RP 4 37 foi exposta a um gradiente de zero a 100 aspartato L micromolar ou sulfato de níquel micromolar de zero a 225 no dispositivo. A migração de bactérias verdes vivas para o aspartato ou para longe do níquel foi fotografada a cada 2,5 segundos por 30 minutos. As bactérias mortas mostradas em vermelho serviram como controle para os efeitos do fluxo no dispositivo.

A distribuição espacial de RP 4 37 no dispositivo microfluídico na ausência de um gradiente é mostrada neste gráfico em comparação com sua resposta a um gradiente de aspartato e um gradiente de sulfato de níquel. Acabamos de mostrar como monitorar os impostos de quimioterapia de e coli RP 4 37 em um gradiente de sulfato de níquel. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de minimizar o vórtice das células para que uma subpopulação de alta motilidade possa ser usada.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.