Estudando Pools vesículas Synaptic usando fotoconversão de Corantes Styryl

Este vídeo demonstra o procedimento para a conversão fotográfica do corante Styro Dye FM 1 43. Para estudar os compartimentos de vesículas sinápticas em drosophila melanogaster, primeiramente larvas de drosophila são dissecadas para expor os músculos ventrais, que constituem a junção neuromuscular ou preparação NMJ. As preparações são incubadas em tampão contendo FM D, mostrado aqui em cinza, marcando a membrana celular.

Em seguida, são estimuladas eletricamente ou quimicamente para induzir a fusão física da membrana do vesículo internalizado posteriormente. A exocitose estimulada será corada com FM D. O corante extracelular FM é então removido por lavagem, eliminando-o da membrana plasmática, e o tecido é fixado sob iluminação contínua de alta intensidade. O corante é completamente descorado e a cor preta aparece devido à precipitação de di amino Ben.

Esse precipitado pode então ser visualizado por microscopia eletrônica de transmissão. Olá, sou Philippe o Paso do laboratório de Sylvia Olli no Instituto Europeu de Neurociência em Gaon, Alemanha. Hoje vamos mostrar um procedimento para conversão fotoquímica de FM na junção neuromuscular.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a reciclagem de vesículas sinápticas. Pronto, vamos começar. Trabalhando sob um microscópio estereoscópico, comece fixando uma larva de drosófila com o lado dorsal voltado para cima em um recipiente revestido com sonda de prata.

Cubra com salina de drosófila usando uma agulha de seringa e, com uma tesoura de dissecação, corte longitudinalmente o lado dorsal. Em seguida, remova os órgãos internos. Depois, estique o preparado e, novamente, fixe-o no prato de Petri.

Vários músculos ventrais podem então ser utilizados para proteger os corantes FM usados neste procedimento contra descoloração. Este procedimento deve ser realizado em condições de pouca luminosidade. Cubra a preparação de drosófila fixada com salina de drosófila contendo 90 milimolares de cloreto de potássio e 10 micromolares de FM.1 43 die para estimular quimicamente os nervos.

Incubar por um minuto à temperatura ambiente após a estimulação. Remover a solução estimulante e submergir o prato com a drosófila fixada. Preparar em um béquer contendo 100 mililitros de solução salina para drosófila duas vezes para remover o corante FM 1 43 extracelular, trabalhando sob uma cabine de segurança química.

Fixe a preparação da junção neuromuscular em glutaraldeído 2,5% em solução salina tamponada com fosfato ou PBS por 45 minutos à temperatura ambiente. Lave a preparação uma vez com PBS, depois remova-a do recipiente tipo charuto e submerja-a em cloreto de amônio 100 milimolar por 15 minutos. Para neutralizar os grupos aldeído livres do fixador de glutaraldeído remanescente.

Usando PBS normal, lave a solução de cloreto de amônio, coloque a preparação da junção neuromuscular em um novo recipiente tipo charuto e submerja-a em diamina benzidina (DAB) filtrada a 1,5 miligrama por mililitro em PBS e incube por 30 minutos a quatro graus Celsius. Posicione a amostra sob um microscópio fluorescente equipado com uma fonte de luz de lâmpada de mercúrio, cujo alojamento contenha um espelho traseiro, utilizando uma objetiva seca de ampliação relativamente baixa.

Localize a amostra. Em seguida, utilizando um cubo de filtro padrão com excitação azul e fluorescência verde, coloque o sinal fluorescente em foco. As junções neuromusculares aparecem como pontos brilhantes nos músculos.

Em seguida, utilizando o mesmo conjunto de filtros de fluorescência, ilumine a amostra na intensidade máxima até que o FM D esteja completamente clareado. Utilizando uma objetiva de 20 x, de 30 a 45 minutos devem ser suficientes. No entanto, o tempo de fotoconversão varia conforme a intensidade da iluminação, a profundidade de penetração do DAB na preparação e a objetiva utilizada.

Após a iluminação, examine a amostra em luz de transmissão. Se a fotoconversão tiver ocorrido, deve-se observar um precipitado marrom-escuro. Retorne ao microscópio de dissecação e, em seguida, use tesoura para cortar o local fotoconvertido da larva.

Retorne ao microscópio de dissecação. Em seguida, use uma tesoura para cortar o local fotoconvertido da larva. Agora, coloque a amostra em um tubo microcêntrifuga contendo PBS, trabalhando sob uma capela de segurança química e usando equipamentos de segurança apropriados, incluindo luvas e proteção ocular.

Prepare 300 microlitros de tetróxido de ósmio a 1% por amostra. Coloque agora a amostra em um frasco de vidro com tampa plástica e adicione a solução de tetróxido de ósmio preparada para pós-fixar a preparação. Enquanto a amostra está em incubação, prepare soluções separadas contendo etanol a 30, 50, 70, 90, 95 e 100%.

Lave a amostra quatro a cinco vezes com PBS durante cinco minutos cada. Após cada lavagem, use um PE plástico em sua pipeta para transferir a amostra para um novo frasco. Após a última lavagem, transfira a amostra para um frasco de vidro limpo.

Em seguida, desidrate a amostra colocando-a em uma série de soluções de etanol. Comece incubando em um mililitro de etanol a 30%. Depois de cinco minutos, remova o etanol usando uma pipeta de Pasteur e substitua por um mililitro de etanol a 50%.

Prossiga com a desidratação, incubando a preparação da junção neuromuscular nas soluções de 70, 90 e, em seguida, 95%. A amostra será então incubada em solução de etanol a 95% por mais vezes do que em etanol a 100%, sendo este último usado três vezes após a desidratação. Adicione dois mililitros de resina EIN na proporção um para um ao etanol e coloque a amostra em um rotador para incubação.

De duas a quatro horas à temperatura ambiente após rotação a 100%ein e coloque a amostra em um frasco aberto para permitir que o etanol remanescente evapore por quatro a seis horas. Despeje EIN fresco em um molde. Adicione os preparados e incube a 60 graus Celsius por 36 horas.

Quando os preparos embutidos de EIN estiverem prontos, utilize um ultramicrótomo para preparar cortes finos de 50 a 80 nanômetros com uma lâmina de diamante. As amostras são cortadas em seções finas. As seções flutuam na cuba de água da lâmina e podem ser posteriormente coletadas em grades normais de microscopia eletrônica.

Os preparos estão agora prontos para serem analisados por meio de procedimentos convencionais de microscopia eletrônica. Junções neuromusculares isoladas de Drosophila melanogaster foram estimuladas usando potássio elevado e membranas internalizadas foram coradas utilizando FM 1-43, conforme mostrado aqui.

A fluorescência de um terminal nervoso pode ser observada usando um microscópio convencional de fluorescência em epifluorescência. Sob iluminação contínua, o corante é completamente descorado e, quando a iluminação prossegue, aparece uma cor preta devido à precipitação de dinobenzina. Este terminal nervoso contém vesículas sinápticas, mas nenhuma delas foi fotoconvertida.

Isso pode ser causado pela falta de iluminação suficiente ou pela fraca penetração de DIA amino benzina no tecido. Por outro lado, uma iluminação excessiva resulta em um terminal geralmente escuro, no qual nenhuma vesícula ou organela é distinguível; com a quantidade apropriada de iluminação, a fotoconversão pode ser observada. Esta micrografia mostra um botão sináptico no qual um grupo de vesículas escuras é visível, indicando a fotoconversão de FM.

Acabamos de mostrar como fot converter vesículas sinápticas marcadas com fem die. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de calibrar sempre cuidadosamente os tempos de iluminação para a etapa de conversão. É isso aí.

Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.