Estudando Pools vesículas Synaptic usando fotoconversão de Corantes Styryl

Este vídeo demonstra o procedimento para conversão de fotos do Styro Dye FM 1 43. Para estudar pools de vesículas sinápticas em drosophila melanogaster, primeiro as larvas de drosophila são dissecadas para expor os músculos ventrais que constituem a junção neuromuscular ou preparação da JNM. As preparações são incubadas em tampão contendo FM D mostrado aqui em membrana celular de marcação cinza.

Eles são então estimulados elétrica ou quimicamente para induzir a fusão física da membrana da vesícula internalizada a seguir. A exocitose estimulada será corada com FM D. O corante FM extracelular é então lavado, removendo-o da membrana plasmática, e o tecido é fixado sob iluminação contínua de alta intensidade. O corante é completamente branqueado e a cor preta aparece devido ao di amino Ben e precipitação.

Este precipitado pode então ser visualizado por transmissão em. Olá, sou Philippe o Paso do laboratório de Sylvia Olli no Instituto Europeu de Neurociência em Gaon, Alemanha. Hoje mostraremos um procedimento para conversão de fotos FM na junção neuromuscular inria.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a reciclagem vesical sináptica. Ok, então vamos começar Trabalhando sob um microscópio de dissecação. Comece prendendo uma larva de drosófila com o lado dorsal para cima em um prato revestido de guarda.

Cubra-o com solução salina de drosófila usando uma agulha de seringa e encontre a tesoura de dissecação seccionando o lado dorsal longitudinalmente. Em seguida, remova os órgãos internos. Em seguida, estique a preparação e, novamente, prenda-a no prato sigar.

Vários músculos ventrais podem então ser usados para proteger os corantes FM usados neste procedimento do branqueamento. Este procedimento deve ser realizado em condições de pouca luz. Cubra a preparação de drosófila comprimida com solução salina de drosófila contendo 90 milimolares de cloreto de potássio e 10 micromolares de FM.1 43 para estimular quimicamente os nervos.

Incubar durante um minuto à temperatura ambiente após a estimulação. Retire a solução estimulante e mergulhe o prato com a drosófila fixada. Preparação em um copo cheio de 100 mililitros de solução salina de drosófila duas vezes para remover a matriz extracelular FM 1 43 trabalhando sob uma capa de segurança química.

Fixe a preparação da junção neuromuscular em glutaraldeído a 2,5% em solução salina tamponada com fosfato ou PBS por 45 minutos em temperatura ambiente. Lave a preparação uma vez com PBS, remova-a da placa de charutos e mergulhe-a em cloreto de amônio a 100 milimolares por 15 minutos. Para extinguir os grupos aldeídos livres do fixador de aldeído glúteo restante.

Usando PBS normal, lave a solução de cloreto de amônio, coloque a preparação da junção neuromuscular em uma nova placa de charuto e mergulhe-a em 1,5 miligrama filtrado por mililitro. Diamina benzina ou DAB em PBS e incubar por 30 minutos a quatro graus Celsius. Posicione a amostra sob um microscópio fluorescente equipado com uma fonte de luz de lâmpada de mercúrio com um invólucro de lâmpada contendo um espelho traseiro usando uma objetiva seca de ampliação relativamente baixa.

Encontre a amostra. Em seguida, usando um cubo de filtro de fluorescência verde de excitação azul normal, coloque o sinal fluorescente em foco. As junções neuromusculares aparecem como pontos brilhantes nos músculos.

Em seguida, usando o mesmo conjunto de filtros de fluorescência, ilumine a amostra na intensidade máxima até que o FM D esteja completamente branqueado. Usando uma lente objetiva de 20x, 30 a 45 minutos devem ser suficientes. No entanto, o tempo para a conversão da foto varia de acordo com a intensidade da iluminação, a força, a penetração do DAB na preparação e a lente objetiva usada.

Após a iluminação, examine a amostra sob luz de transmissão. Se a conversão de fotos tiver ocorrido, um precipitado marrom escuro deve ser visto. Retorne ao escopo de dissecação e use uma tesoura para cortar o ponto da foto convertida da larva.

Retorne ao escopo de dissecação. Em seguida, use uma tesoura para cortar o ponto de conversão da foto das larvas. Agora coloque a amostra em um tubo de microfuga contendo PBS trabalhando sob uma capa de segurança química e usando equipamentos de segurança apropriados, incluindo luvas e proteção para os olhos.

Prepare 300 microlitros de tetróxido de ósmio a 1% por amostra. Agora coloque a amostra em um frasco de vidro com tampa de plástico e adicione a solução de tetróxido de ósmio preparada para fixar a preparação. Enquanto a amostra está a incubar, preparar soluções separadas contendo 30, 50, 70, 90, 95 e 100% de etanol.

Lave a amostra quatro a cinco vezes com PBS por cinco minutos cada. Após cada lavagem, use um PEs de plástico em sua pipeta para transferir a amostra para um novo frasco. Após a última lavagem, transferir a amostra para um balão de vidro limpo.

Em seguida, desidrate a amostra colocando-a na série de soluções de etanol. Comece incubando em um mililitro de etanol a 30%. Então, após cinco minutos, remova o etanol usando uma pipeta de pastagem e substitua-o por um mililitro de etanol a 50%.

Continue com a desidratação, incubando a preparação da junção neuromuscular nas soluções de 70, 90 e 95%. A amostra será então incubada em solução de etanol a 95% mais vezes do que incubada em etanol a 100% três vezes após a desidratação. Adicione dois mililitros de resina EIN um-para-um ao etanol e coloque a amostra em uma incubadora rotadora.

Duas a quatro horas à temperatura ambiente após rotação a 100% ein e colocar a amostra em um frasco aberto para permitir que o etanol restante evapore por quatro a seis horas. Despeje o EIN fresco em um molde. Adicione as preparações e incube a 60 graus Celsius por 36 horas.

Quando as preparações incorporadas ao EIN estiverem prontas, use um ultramicrótomo para preparar seções finas de 50 a 80 nanômetros usando uma faca de diamante. As amostras são cortadas em seções finas. As seções fluem no banho-maria da faca e podem ser posteriormente recolhidas em grades EM normais.

As preparações agora estão prontas para imagens usando procedimentos EM convencionais. Junções neuromusculares isoladas de Drosophila Melan gaster foram estimuladas usando membranas ricas em potássio e internalizadas. Foram corados usando FM 1 43 como mostrado aqui.

A fluorescência de um terminal nervoso pode ser observada usando um microscópio de epifluorescência convencional. Sob iluminação contínua, o corante é completamente branqueado e, quando a iluminação continua, uma cor preta aparece devido à precipitação de dino benzina. Este terminal nervoso contém vesículas sinápticas, mas nenhuma delas é fotoconvertida.

Isso pode ser causado por não ter iluminação suficiente ou má penetração de aminobenzina DIA no tecido. Por outro lado, muita iluminação resulta em um terminal escuro geral, onde nenhuma vesícula ou organela é distinguível com a quantidade apropriada de conversão de foto de iluminação pode ser vista. Esta micrografia mostra um bhuton sináptico no qual um conjunto de vesículas escuras é visto indicando a conversão de fotos FM.

Acabamos de mostrar como converter vesículas sinápticas rotuladas com matriz fem. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de sempre calibrar cuidadosamente os tempos de iluminação para a etapa de conversão. Então é isso.

Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.