Name: Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Aprenda a produzir implantes de células-tronco mesenquimais marcadas com Ferumoxides para reparo de defeitos cartilaginosos. Este método reprodutível utiliza ressonância magnética de 7T para visualização não invasiva das células implantadas.

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Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Artrite e Doenças da Pele músculo-esqueléticas, NIH RO1AR054458.

1. Rotulagem de hMSCs com Endorem <ol><li> As células são cultivadas a 80% confluência pelo menos 18 horas antes de rotulagem. </li><li> Durante este tempo, a mídia rotulagem é preparada adicionando Endorem à amostra com uma dose de 100 ug Fe / ml de soro livre de mídia. </li><li> Depois que as células são cultivadas de confluência, a cultura da mídia é aspirado e as células são lavadas com PBS 1x ou soro livre de mídia. </li><li> Em seguida, enxágüe a solução é aspirada e da mídia rotulagem previamente preparado é adicionado. As células são então incubados a 37 ° C, 5% de CO 2 para 4 horas. </li><li> Após a incubação de 4 horas, rotulagem mídia é aspirado e as células são lavadas com PBS e tripsinizados como de costume. </li><li> Uma vez tripsinizados, as células são lavadas 3x com PBS e centrifugado a 400rcf por 5 minutos. </li><li> Após esta etapa de lavagem, as células são ressuspendidas, contados, avaliadas quanto a viabilidade, e usado quando necessário para a experimentação. </li></ol> 2. Preparando Agarose <ol><li> Depois que as células foram marcadas é hora de preparar a solução de agarose. </li><li> Em uma escala bem, 80mg de agarose em pó são pesados ​​e adicionados 2 ml de PBS. </li><li> Esta solução é, então, suavemente sacudida e autoclavada. </li><li> Depois de aproximadamente 40 min, a solução de agarose líquido pode ser retirado da autoclave. O volume deve ser medido e ajustado em conformidade com PBS pré-aquecido. </li><li> Então a solução é resfriada a 42 ° C </li></ol> 3. Criando MASI <ol><li> Quando a solução de agarose atingiu a temperatura desejada, as células são contadas e centrifugado pela última vez em um tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Após a centrifugação, o sobrenadante é descartado e as células são misturadas com o DMEM para chegar a uma concentração de 30 x 10 6 células / ml. </li><li> Agora as células são misturadas com a 42 ° C agarose quente. </li><li> A ponta da pipeta frio pode causar agarose para solidificar no interior da ponta, portanto é aconselhável para pré-aquecer a ponta por pipetagem quente estéril PBS cima e para baixo </li><li> Agora, o mesmo volume de agarose como meios de comunicação é retomada e misturado com a célula-media suspensão, de modo que uma suspensão homogênea é criado. </li><li> Manter o tubo Eppendorf dentro de um banho de água pré-aquecida enquanto mistura de modo que a agarose não esfriar o suficiente para solidificar. </li><li> Quando a suspensão é homogênea, as células são implantadas no defeito. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1793/1793fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Coronal T2 SE (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) de uma amostra de patela com hMSCs implantado em defeitos da cartilagem.

<ol><li>Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+and+functional+maturation+of+bovine+mesenchymal+stem+cells+in+long-term+agarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Rahfoth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+allograft+chondrocytes+embedded+in+agarose+gel+into+cartilage+defects+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).</li>
<li>Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+hESCs+and+hMSCs+with+iron+oxide+nanoparticles+for+non-invasive+in+vivo+tracking+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

O protocolo descrito fornece uma maneira reproduzível para rotular MSCs com nanopartículas de óxido de ferro e implante essas MSCs rotulados em defeitos da cartilagem. Essa técnica permite não-invasivo representação de transplantes de células-tronco em defeitos da cartilagem com ressonância magnética, que permite uma detecção precoce de falha MASI. A luxação ou de efluxo das células marcadas pode ser diagnosticada com base em um desaparecimento do rótulo do site transplante em imagens de MR. Um diagnóstico precoce desse...

<table><tbody><tr><td>D-MEM Alto Teor de Glicose</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sem Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>25399-120</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td></td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td></td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxidas (Endorem)</td><td></td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Tipo VII</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9045</td><td>Diluir agarose em PBS até concentração final de 4%</td></tr></tbody></table>

implantação de ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

O campo da engenharia de tecidos integra os princípios da engenharia de biologia celular e medicina para a regeneração de células e tecidos específicos funcional. Matriz associada implantes de células-tronco (MASI) visam regenerar defeitos da cartilagem devido à artrite traumática ou lesões nas articulações. Células-tronco adultas mesenquimais (CTMs) têm a capacidade de se diferenciar em células da linhagem condrogênicos e têm mostrado resultados promissores para celular baseado em tecnologias de reparação da cartilagem articular. Autólogo MSCs pode ser isolado de uma variedade de tecidos, pode ser expandida em culturas de células, sem perder seu potencial de diferenciação, e demonstraram diferenciação condrogênicos in vitro e in vivo 1, 2. A fim de proporcionar a retenção local e viabilidade de MSCs transplantado em defeitos de cartilagem, um andaime é necessário, que também suporta a diferenciação e proliferação subsequente. A arquitetura da formação de tecido scaffold guias e permite a matriz extracelular, produzida pelas células-tronco, a se expandir. Investigações anteriores demonstraram que a 2% agarose andaime pode apoiar o desenvolvimento de cartilagem hialina estável e não induzir respostas imunes 3. Retenção a longo prazo de células-tronco transplantadas em MASI é fundamental para a regeneração da cartilagem. Rotulagem de CTMs com nanopartículas de óxido de ferro permite a longo prazo no rastreamento vivo com técnicas não invasivas RM 4. Esta apresentação vai demonstrar técnicas para a rotulagem MSCs com nanopartículas de óxido de ferro, a geração de células-agarose construções e implantação dessas construções em defeitos da cartilagem. As construções rotulado pode ser rastreado de forma não invasiva com MR-Imaging.

Objetivo da apresentação é mostrar um método altamente reprodutível para gerar matriz associada implantes de células-tronco em defeitos da cartilagem, que pode ser visualizado com ressonância magnética. As células estaminais são rotulados com FDA-approved Ferumoxides, misturado com agarose, implantado em defeitos da cartilagem e fotografada com um scanner MR 7T.

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

O campo da engenharia de tecidos integra os princípios da engenharia, da biologia celular e da medicina visando a regeneração de células específicas e...

O objetivo da apresentação é demonstrar um método fácil e replicável de produção de MASI com HMEs marcados por para-óxidos para o rastreamento de terapias baseadas em células-tronco. Com a marcação por imagem por RM, o meio é preparado, adicionado a um frasco T 75 e incubado por quatro horas. Em seguida, as células são tripsinizadas e lavadas.Três vezes após a lavagem, as células são ressuspendidas e o gel de agros é adicionado ao tubo. Agora, as células estão prontas para implantação em defeitos da cartilagem. Olá, eu sou Alex.Preciso da casca de re do laboratório de High Delta Blink, o Laboratório de Meios de Contraste do Departamento de Radiologia da Universidade da Califórnia em São Francisco. Sou Lydia Men. Também do Laboratório de Meios de Contraste.Hoje vamos mostrar um procedimento para marcar células-tronco mesenquimais com nanopartículas de óxido de ferro, gerando constructos de agregados celulares, e implantar esses constructos em defeitos de cartilagem. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para rastrear células-tronco mesenquimais de forma não invasiva por meio de imagem por ressonância magnética. Então, vamos começar.Para começar, as células são cultivadas até atingirem 80% de confluência, pelo menos 18 horas antes da marcação. Durante esse período, prepare o meio de marcação para que esteja pronto para uso quando as células atingirem confluência. Para isso, adicione end durum à amostra na dose de 100 microgramas de ferro por mililitro de meio livre de soro.Após as células atingirem confluência, aspire o meio de cultura e lave as células com PBS ou meio sem soro. Em seguida, aspire a solução de lavagem e adicione o meio de marcação preparado. Incube as células a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono, por quatro horas.Após a incubação de quatro horas, aspire o meio de marcação. Lave as células com PBS e, em seguida, com tripsina gelada. Uma vez tripsinizado, lave as células três vezes com PBS e centrifugue-as a 400 RCF durante cinco minutos.Após esta etapa de lavagem, ressuspenda as células, suspenda-as, conte-as, avalie sua viabilidade e, finalmente, utilize-as conforme necessário para os experimentos. Agora vamos ver como criar implantes de células-tronco associadas à matriz. Comece preparando uma solução de agarose fresca.Após o resfriamento dos agros a 42 graus Celsius, conte as células e centrifugue-as em um tubo einor de 1,5 mililitro. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e misture as células com o meio de Eagle modificado por dobe echo para atingir uma concentração de 30 vezes 10 elevado a seis células por mililitro antes de misturar as células com os agros aquecidos. Pré-aqueça a ponteira da pipeta pipetando PBS quente e estéril para cima e para baixo. Isso evitará que os agros solidifiquem dentro da ponteira.Em seguida, aspire o mesmo volume de aros que o meio e misture-o completamente com a suspensão de células no meio, tomando cuidado para não formar bolhas. Mantenha o tubo einor dentro de um banho-maria pré-aquecido durante a mistura, para que os agros não esfriem o suficiente a ponto de solidificar quando a suspensão estiver homogênea. As células são implantadas no defeito e agora estão prontas para a aquisição de imagens por RM.Agora mostraremos alguns resultados representativos, primeiro da nossa técnica de marcação e, em seguida, da nossa técnica de implantação. Após a marcação, as células nos frascos ainda apresentam a mesma aparência que as células não marcadas. Como esperado, a viabilidade das células marcadas não se altera, conforme demonstrado pelo teste de Caspase três.A combinação de células marcadas com agregados leva à perda de sinal nos implantes, conforme observado em imagens de ressonância magnética ponderadas em T2; células não marcadas não mostram qualquer sinal. Secções de construtos de agregados celulares apresentam coloração com azul da Prússia. Confirme o acúmulo intracelular de ferro.Acabamos de mostrar como rotular células-tronco mesenquimais com a nanopartícula de óxido de ferro endointerina. Como criar constructos de agarose com as células marcadas e como implantá-los em defeitos de cartilagem. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de pré-aquecer a ponteira da pipeta antes de adicionar o agarose quente à suspensão celular.Também é crucial que o Sr. Imaging evite a formação de quaisquer bolhas. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Para a avaliação de terapias com células-tronco é importante não invasiva track as células injetadas in vivo. Este vídeo irá mostrar-lhe como rotular as células-tronco mesenquimais e embrionárias com óxido de ferro agentes de contraste com base in vivo para posterior ressonância magnética in vivo.

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

As células-tronco perivascular (PSC) é um romance classe de células-tronco para a regeneração do tecido ósseo semelhante a células-tronco mesenquimais (MSCs). PSCs pode ser isolado por FACS (classificação de células activadas por fluorescência) a partir de tecido adiposo adquiridos durante procedimentos padrão lipoaspiração, então combinada com um andaime osteoindutora para alcançar a formação de...

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Nós descrevemos uma técnica para rotulagem e rastreamento de células-tronco com FDA-approved, óxido de ferro superparamagnético (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Esta técnica de imagem celular que utiliza a ressonância magnética (RM) para visualização, é facilmente acessível a longo prazo de monitoramento e diagnóstico de engraftments tronco bem ou mal sucedidas de células em pacientes.

Rotulagem células-tronco com Ferumoxytol, uma FDA-Approved nanopartículas de óxido de ferro

Uma técnica experimental para o tratamento de lesões condrais no joelho do coelho é descrito. O implante de condrócitos autólogos semeadas numa matriz é um método bem aceite para a remodelação e reparação de lesões da cartilagem articular que fornecem resultados satisfatórios a longo prazo. Matrix-assistida transplante de condrócitos autólogos (MACT) oferece um método padronizado e implante clinicamente estabelecida.

Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos para remodelação e reparação de lesões condrais em um modelo de coelho

Uma técnica experimental para o tratamento de defeitos osteocondrais na articulação do joelho do coelho é descrito. A implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para defeitos osteocondrais proporciona um desenvolvimento promissor no campo da engenharia de tecidos. A preparação de fibrina de...

Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

A cultura de células estromais mesenquimais humanas (hMSCs) com soro autólogo, reduz os riscos de rejeição por material de xenogénico e outros efeitos negativos. Também permite a recuperação de um subconjunto de células progenitoras mesodérmica, que pode fornecer as hMSCs frescos. Incorporação hMSCs em um coágulo de fibrina autóloga permite fácil manuseio e implantação cirúrgica eficaz.

Estromais mesenquimais cultura de células e Entrega em condições autólogas: Uma abordagem inteligente para aplicações ortopédicas

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Este protocolo descreve uma maneira eficiente para monitorar a persistência de célula e biodistribuição do adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) por fluorescência far-red rotulagem em um modelo de osteoartrite (KOA) de joelho do rato através de injeção intra-articular de (IA).

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

Apresentado aqui é um protocolo para a entrega e o seguimento não invasores da pilha de haste do mesenchymal (MSC) em um modelo do rato de ferimento de cérebro traumático. As nanopartículas superparamagnéticas do óxido de ferro são empregadas como uma ponta de prova da imagem latente da ressonância magnética (MRI) para a rotulagem de MSC e o seguimento in vivo não invasor após a entrega intranasal usando mri em tempo real.

Rastreamento de células-tronco mesenchymal rotuladas por óxido de ferro superparamagnético usando ressonância magnética após parto intranasal em um modelo de urina de urina de lesão cerebral traumática

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

Aqui, apresentamos um protocolo integrado para gerar lesões osteocondrais controladas nos joelhos de ovelha, a fim de estabelecer um modelo experimental adequado para estudos de regeneração óssea e cartilaginosa. O protocolo descreve um método para induzir um defeito osteocondral de espessura total no côndilo femoral, utilizando técnicas que minimizam os impactos no bem-estar animal e a variabilidade nos resultados.

Estabelecimento e Avaliação de um Modelo Ovino de Defeito Osteocondral de Espessura Total

Aprenda a produzir implantes de células-tronco mesenquimais marcadas com Ferumoxides para reparo de defeitos cartilaginosos. Este método reprodutível utiliza ressonância magnética de 7T para visualização não invasiva das células implantadas.

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

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