Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

Olá, meu nome é Jay Harkins. Sou cientista pesquisador na Protein Discovery. Hoje demonstrarei o quão fácil é usar o novo sistema de fracionamento livre de gel 8, 100 para obter fracionamento baseado em peso molecular com alta recuperação.

Usando o sistema livre de gel, você pode carregar até um miligrama de proteína total por canal e fracionar de forma reprodutível até oito amostras em cerca de 90 minutos. Assim, o sistema inclui um instrumento, cartucho descartável e todos os tampões necessários para realizar o experimento. Vamos começar.

Inicie este procedimento preparando e rotulando até oito tubos de 500 microlitros cada. Adicione até um miligrama da amostra de proteína em um volume de até 112 microlitros. A quantidade de proteína na amostra depende da complexidade da amostra.

Para amostras mais complexas, como o homogenato tecidual utilizado nesta demonstração, 150 a 200 microgramas por canal gerarão os melhores resultados. Em seguida, adicione 30 microlitros de tampão amostral cinco x, fornecido no kit do cartucho livre de gel. A cada amostra proteica, adicione oito microlitros de DTT um molar.

Em seguida, ajuste cada amostra com água até um volume final de 150 microlitros. Em seguida, aqueça os frascos por cinco minutos a 95 graus Celsius para desnaturar a amostra. Deixe as amostras aquecidas esfriarem até a temperatura ambiente enquanto as amostras esfriam.

Retire o cartucho livre de gel 8, 100 da embalagem de folha de alumínio. Remova e descarte o selante da placa. Remova o tampão de armazenamento dos compartimentos do cartucho utilizando uma pipeta.

Se todas as oito câmaras da cartela forem utilizadas, inverta a cartela para drenar o tampão de armazenamento dos compartimentos. Em seguida, oito mililitros de tampão de corrida livre de gel são adicionados a cada um dos reservatórios anódicos. Seis mililitros são adicionados a cada um dos reservatórios catódicos, e 100 microlitros são pipetados para dentro de cada uma das câmaras de coleta.

Usando um pipetador multicanal de 100 a 200 microlitros, remova e descarte qualquer tampão que tenha escoado do reservatório do cátodo para a câmara de carregamento da amostra e, imediatamente, carregue as amostras nas câmaras de carregamento. Após o carregamento das amostras, coloque o cartucho na estação de fracionamento gel free 8, 100. Em seguida, abaixe as matrizes de eletrodos e feche a tampa utilizando a interface gráfica de usuário de fácil programação na tela sensível ao toque do instrumento; vá até a lista de métodos pré-programados disponíveis.

Selecione o método apropriado pressionando o botão de método. Pressione o botão de recuperação e insira o número do método pré-programado desejado usando o teclado na tela; pressione ok. Em seguida, pressione o botão aplicar.

O método que foi aplicado aparecerá na parte inferior da tela principal. Cada um dos métodos pré-programados consiste em tensões definidas e pausas baseadas em tempo, projetados para separar proteínas dentro de uma faixa específica de pesos moleculares. Após a seleção do método apropriado, pressione o botão de canal na tela principal.

Em seguida, selecione os canais que serão utilizados na execução. Para selecionar todos os oito canais, pressione selecionar tudo. Depois, pressione concluído.

Para retornar à tela principal, certifique-se de que a tampa de segurança está fechada e de que a luz indicadora está verde na parte inferior da tela. Agora, pressione iniciar para começar o experimento. Enquanto o sistema estiver em funcionamento, os círculos mostrados na caixa no lado esquerdo da tela representam o status de cada canal. Um círculo verde indica que o canal está ativo.

As tensões e correntes aplicadas são exibidas à direita dos círculos de status do canal. O sistema automático 8, 100 sem gel pausará automaticamente para a coleta de frações no intervalo especificado no método. Quando o instrumento for pausado para coletar frações, uma caixa de texto aparecerá notificando que ocorreu uma pausa e os círculos de status ficarão amarelos.

Dentro da cartela, uma voltagem constante é aplicada entre os reservatórios do ânodo e do cátodo. Sob esse potencial, a mistura de proteínas é impulsionada eletroforéticamente a partir da câmara de carregamento e entra no gel moldado com precisão. As proteínas do gel primeiro se empilham dentro de uma faixa nítida no gel de concentração e depois são separadas com base em seus respectivos pesos moleculares no gel de separação.

À medida que as proteínas eluem do gel, elas são retidas e concentradas na fase líquida. Na câmara de coleta, livre de gel. Em seguida, o instrumento é pausado.

Com base em intervalos de tempo e frações previamente selecionados, são coletadas frações utilizando uma pipeta. Em seguida, o potencial é aplicado novamente para isolar e aprisionar a segunda fração de peso molecular de interesse. Esse processo é então repetido até que todas as frações desejadas tenham sido coletadas.

Cada cartucho contém oito canais eletroforéticos independentes, permitindo que o usuário utilize quantos canais forem necessários e reserve os canais não utilizados para uso posterior. Para remover as frações, abra a tampa do instrumento e, em seguida, utilize a pipeta de canais embutida. Transfira os 150 microlitros de líquido de cada câmara de coleta para tubos de coleta ou uma placa de múltiplos poços.

Uma vez removidas as frações, lave a câmara de coleta duas vezes com tampão de eletroforese sem gel, adicionando 100 microlitros por canal e pipetando para cima e para baixo duas vezes. Após a lavagem, adicione novamente 100 microlitros de tampão de eletroforese sem gel às câmaras de coleta. Feche a tampa e pressione o botão de retomar.

O gel livre 8, 100 funcionará até o próximo intervalo de tempo. O tempo total restante no experimento é exibido no lado direito da tela. Pressione o botão acima da caixa que mostra o tempo para alternar entre tempo restante, tempo decorrido e tempo para pausa.

Uma vez que todas as frações tenham sido coletadas, elas podem ser imediatamente utilizadas para preparações downstream adicionais, como focagem isoelétrica ou eletroforese em gel, ou para análise por cromatografia líquida, espectrometria de massa ou afinidade imunológica. Nesta demonstração, oito amostras proteicas, cada uma com 200 microgramas, foram particionadas em 12 frações, perfazendo um total de 96 frações. Para visualizar os resultados da fracionamento, uma alíquota de cada uma das 12 frações provenientes da amostra de homogeneizado de fígado bovino foi submetida à eletroforese em gel padrão 1D e corada pela prata.

Como mostrado nesta figura, a amostra proteica foi fracionada em 12 frações distintas que abrangem a faixa de peso molecular de 3,5 quilodaltons a 150 quilodaltons. O gel apresentado aqui destaca a capacidade do sistema gel free 8, 100 de fracionar uma grande quantidade de proteína em frações distintas de peso molecular. Esta é uma ferramenta extremamente poderosa para proteômica top-down e bottom-up utilizando espectrometria de massas, bem como para experimentos de afinidade imunológica nos quais é necessária uma única fração purificada de proteína intacta com peso molecular definido.

Foi um prazer mostrar a você como é fácil usar o sistema de fracionamento sem gel 8, 100 para particionar de forma reprodutível sua amostra em frações discretas de peso molecular e obter alta recuperação na fase líquida. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.