Name: Procedimento de transplante do epitélio mamário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda o procedimento de transplante do epitélio mamário em camundongos para estudar o desenvolvimento da glândula mamária. Este método demonstra a limpeza do tecido adiposo e o crescimento da árvore epitelial.

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1. Preparação do Epitélio Transplant Tecido do doador frescos ou congelados epitelial pode ser transplantado para a almofada limpa de gordura, mas a preparação prévia do epitélio do doador congelado é mais conveniente, com uma redução mínima na eficiência de transplante (&gt; 85% de eficiência). O protocolo para a preparação do epitélio do doador congelados é a seguinte: Antes de preparar epitélio transplante de doadores, preparar a mídia congelar por epitélio e alíquota sobre 1ml em criotubos. Isto pode ser armazenado a 4 ° C por até seis meses até ser necessário. Congelamento de mídia contém DMEM/F12 media tamponado com HEPES e NaHCO 3, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de dimetil sulfóxido (DMSO). Colheita epitélio mamário de um rato recentemente sacrificados feminino. <ol><li> Lavar o mouse com EtOH 70%. </li><li> Faça um corte médio-sagital através da parede do corpo que se estende do púbis ao esterno sem perfurar a membrana serosa da cavidade do corpo ventral. Faça um corte oblíquo da incisão inicial no púbis em direção à perna (Figura 1). </li><li> Descasque a parede do corpo longe da serosas para expor a 5 ª glândula mamária inguinal presos na fáscia sobre a parte inferior da parede do corpo. A melhor maneira de conseguir isto é agarrar as membranas serosas cuidado com a porção curvada de um par de fórceps curvos, tomando cuidado para não perfurar a cavidade do corpo ventral. Simultaneamente, segure a borda do corte do tegumento com uma pinça reta serrilhada e puxe a parede do corpo de distância da membrana serosa. </li><li> Identificar o linfonodo dentro da glândula mamária. Linfonodo está localizado na intersecção de três vasos sangüíneos proeminentes na glândula mamária e pode ser sentida como um nódulo denso dentro do bloco de gordura (Figura 2). Com a ponta de uma tesoura olho, o tecido adiposo em torno cortar o nó. Com um dedo frente no lado epidérmico da pele, aplicar uma pressão para aumentar a saída do nó da gordura abdominal e comprima-o com um par de pinças curvas. Descartar o nó de linfa. </li><li> , Mantendo as margens da pele, segure a almofada de gordura mamária com a borda curvada de um par de pinças curvas e, gradualmente, a almofada de gordura casca de distância da parede do corpo. Siga a direção da gordura abdominal para a superfície dorsal do rato como você remover toda a glândula mamária em uma única peça. </li><li> Coloque a glândula mamária em um bloco de plástico estéril de corte. Adicionar uma pequena quantidade de media, cerca de 200 mL, para a superfície da glândula para mantê-lo úmido. Picar a glândula em pedaços 1 milímetro com uma lâmina de barbear fresco. Divide a glândula picada em quatro partes e distribua entre quatro criotubos de mídia congelar com uma pinça. Coloque o criotubos em um "Mr. Frosty Nalgene freezer célula que tem 250ml de álcool isopropílico no compartimento exterior. Coloque no congelador Nalgene em um freezer -70 ° C por 24 horas. Loja frascos de fragmentos congelados em nitrogênio líquido mamário até ser necessário para transplante. Cada cryovial irá conter fragmentos das glândulas mamárias para transplante o suficiente para as almofadas limpas de gordura de 4-8 camundongos host. </li></ol> 2. Preparação das células de Transplante Nosso laboratório tem transplantado tipos de células diferentes, incluindo imortalizado mamárias linhagens de células epiteliais, mamárias linhagens de células tumorais ou células primárias de mama em um mouse pad limpo de gordura. O protocolo para a preparação de Comma-D células para transplante é a seguinte: <ol><li> Comma-D células são cultivadas em meios regulares MECL contendo DMEM: F12 suplementado com 2% soro de bovino adulto (ABS), mEGF, insulina, antibiótico / antimicótico (AB / AM). </li><li> Colheita Comma D-células quando as células são 85% -90% confluentes. </li><li> Centrifugar a suspensão de células em 1200rpm por 5 minutos para sedimentar as células. Ressuspender as células em novas mídias MECL e ajustar a concentração de células de 5 x 10 6 / ml. </li></ol> Para o transplante de células primárias de mama, a principal células epiteliais mamárias são isolados de rato 5 º glândulas mamárias através da dissociação mecânica e enzimática. Células são ressuspendidas em DMEM: F12 mídia e ajustado para a concentração desejada, geralmente 5 x 10 6 / ml. 3. Procedimento padrão para Limpar o Mouse Pad mamária Fat <ol><li> Anestesiar a três semanas do mouse host antigo. Selecione os ratos que são &lt;12 g para garantir que o crescimento ductal mamária não foi iniciada. Usamos 200mg/kg de peso corporal de 2,2,2 tribromoetanol. </li><li> Depois que o mouse está anestesiado, firmemente conter o mouse, lado ventral com os braços estendidos, em um estágio cirúrgico para que o abdômen é provocação. Antes da cirurgia, administrar analgésicos; ou bupivacaína (1mg/kg &lt;) ou buprenorfina (0.05mg/kg), por via subcutânea. </li><li> Segure a pele com uma pinça alguns milímetros acima da pélvis e levante-o do abdômen . Nip a pele com uma tesoura e fazer um corte médio-sagital através da parede do corpo que se estende do púbis ao esterno. Não furar as membranas serosas da cavidade do corpo ventral. Não faça sua incisão inicial muito perto da uretra de modo que grampos de sutura não irá interferir com a capacidade dos camundongos para urinar. </li><li> Da incisão inicial, fazer cortes oblíquos através da pele a partir de meados-line através da pelve para cada perna. </li><li> Use a área de curvas do fórceps curvas para agarrar o delicadamente membranas serosas. Use uma pinça para agarrar a margem de corte da pele e puxe a parede do corpo longe da serosas e expor a 5 ª glândula mamária inguinal localizado na fáscia sobre a parte inferior da parede do corpo. </li><li> Cauterizar o mamilo nó, e duas artérias que conduzem ao nó (Figura 2) </li><li> Separe as glândulas quarto e quinto. Cauterizar a margem da glândula quinta para evitar ingrowth da glândula 6 º. </li><li> Divide a almofada de gordura na glândula mamária por quarto cortando a almofada de gordura com uma tesoura apenas ventral (lado para o mamilo) do nó. Use pinças curvas para agarrar firme a porção ventral da gordura abdominal e puxe-o para longe da parede do corpo em uma só peça. Pressione a porção ventral da almofada de gordura entre dois slides e colocar em um prato de vidro coloração histologia contendo fixador de Carnoy. Este tecido será fixado e corado posteriormente com solução de carmim alum para verificar se as margens limpas (Figura 3). Limpe a fascia em torno da região da porção removida do bloco de gordura para remover todos os vestígios da glândula mamária com o fórceps curvos. </li></ol> 4. Procedimento "alternativa Sparing para Limpar a gordura abdominal Depois tornou-se um competente com o procedimento padrão para limpar o mouse pad mamárias de gordura, eles podem preferir tentar poupar o procedimento menos invasivo desenvolvido por Brill et al. (2008) 2. <ol><li> Prepare o mouse como para o procedimento padrão. </li><li> Segure o mamilo da glândula mamária inguinal quarto e cortar um círculo de circunferência de 3-5 mm em torno do mamilo com a ponta da tesoura. </li><li> Puxar o mamilo para fora do corpo para separar a parte cortada da pele e tirar a glândula mamária inguinal quarto para fora através do furo. </li><li> Identificar o nó. Use o cautério para cauterizar o nó ea glândula mamária 6 º pelo buraco. </li><li> Corte e retire a parte mais superficial da glândula mamária 5 º, antes do nó. O mamilo área circular de pele e parte do epitélio mamário de gordura contendo pad são removidos em uma única peça. </li></ol> 5. Tecido / Cell Transplantation <ol><li> Para fragmentos de epitélio transplante, degelo cryovial um do epitélio e transferir os restos epiteliais de uma placa de Petri contendo meio fresco para diluir o DMSO. Faça um pequeno furo ou no bolso no bloco limpo de gordura com a ponta tesoura para o novo epitélio. Coloque um pedaço um milímetro do epitélio do doador para o bolso com uma pinça agulha. Segure o bolso fechado com uma pinça como você retirar a pinça agulha de modo que o tecido permanece no local. </li><li> Para as células do transplante, injetar 50.000 células em 10 ml de mídia em cada almofada de gordura, utilizando uma seringa Hamilton 50μl com uma agulha de calibre 22s. </li></ol> 6. Fechamento / Revival of Mouse <ol><li> Organizar a pele para o fechamento. Segure margens opostas da pele, mantê-los juntos com uma pinça, levantá-los longe das membranas serosas da cavidade do corpo ventral e fechar com clips ferida. Normalmente, é necessário usar dois clips para fechar a incisão médio-sagital e um clip para cada incisão oblíqua para o procedimento padrão. Evitar a obstrução da uretra. Pode ser necessário para fechar as lacunas na pele, na intersecção das incisões médio-sagital e oblíqua com uma sutura. O procedimento poupador irá necessitar apenas de um clipe de feridas para cada lado. </li><li> . Posicione o mouse em sua gaiola e manter a gaiola sob uma lâmpada de aquecimento até que o mouse tem revivido. </li><li> Os grampos de sutura deve ser removida após 2 semanas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Demonstração do padrão de incisão. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Localização do nó de linfa, vasos sanguíneos, mamilo e epitélio endógena. Cauterize em locais indicados. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Montar Whole demonstra que o epitélio endógena é restrita à área dentro do círculo e, portanto, as margens são "claros". 7. Resultados representante _r.jpg "alt =" Figura 4 "/&gt; Figura 4. Whole montagem de almofada de gordura removida do mouse de 3 semanas de idade mostrando margens limpas. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Whole montagem de um rato de 10 semanas de idade mostrando almofada de gordura livre de epitélio mamário endógena. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Hematoxilina e eosina seção manchada de uma almofada limpa de gordura de um mouse de 10 semanas de idade. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Whole montagem de um rato de 10 semanas de idade mostrando árvore ductal mamário normal desenvolvido a partir do epitélio transplantado. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Hematoxilina e eosina seção manchada de ductos mamários desenvolvido a partir do epitélio transplantado. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Hematoxilina e eosina seção manchada de um tumor mamário desenvolvido a partir do epitélio transplantado.

<ol><li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li>
<li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li>
<li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li>
<li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li>
<li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li>
<li>Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females%3A+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li>
<li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB%2Fc-Trp53%2B%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li>
</ol>

Neste relatório, apresentamos dois métodos alternativos para limpar o mouse pad mamárias de gordura na preparação para transplantes mamárias epiteliais. O procedimento padrão tem sido em uso desde o seu desenvolvimento em 1959 por DeOme et al. 1 Enquanto mais invasivo, o método padrão é o método preferido para treinar o novato porque a estrutura e orientação da glândula mamária são facilmente visualizadas. No entanto, o procedimento poupador pode ser preferido pelo cirurgião mais experiente por causa...

procedimento de transplante do epitélio mamário

Mammary Epithelial Transplant Procedure

Este artigo descreve e compara o processo de apuramento de gordura pad desenvolvido pela DeOme KB et al. 1 e poupando o procedimento desenvolvido por Brill B et al. 2, seguido pelo procedimento de transplante mamárias epiteliais. O procedimento de transplante de mama é amplamente utilizado por biólogos mamárias porque ele tira vantagem do fato de que um maior desenvolvimento do epitélio mamário não ocorre até depois da puberdade. Menos 3 semanas de idade, o crescimento da árvore mamárias epiteliais se limita à vizinhança do mamilo ea almofada de gordura é em grande parte desprovida de epitélio mamário, mas por sete semanas de idade da árvore do epitélio ductal se estende por todo o bloco inteiro de gordura. Portanto, se esta pequena porção do bloco de gordura contendo epitélio, na região entre o mamilo eo nó de linfa, é removida a 3 semanas de idade, o epitélio endógena nunca vai preencher o pad mamárias gordura ea gordura abdominal é descrita como &quot;apagada &quot;. Neste momento, epitélio mamário de outra fonte pode ser transplantado no bloco limpo de gordura onde ela tem o potencial para estender mamário ductal árvores por todo o bloco de gordura. Este procedimento tem sido utilizado em muitos modelos experimentais, incluindo a análise do fenótipo de tumor no tecido mamário transgênicos epiteliais sem os efeitos de confusão do genótipo sobre todo o animal 3, na identificação de células-tronco mamário através do transplante de células em diluição limite de 4,5, determinando se nodules hyperplastic proceder para tumores mamários 6, e para avaliar o efeito da exposição a hormônios prévio sobre o comportamento do epitélio mamário 7,8. Três semanas os ratos são anestesiados anfitrião velho, limpo e contido em um estágio cirúrgico. Uma incisão médio-sagital é feita através da pele, mas não o peritônio, que se estende do púbis ao esterno. Cortes oblíquos são feitas através da pele da incisão médio-sagital do outro lado da pelve para cada perna. A pele é puxada para longe do peritônio para expor a glândula mamária inguinal 4. A gordura abdominal é limpo com a remoção do tecido adiposo anterior pad para o nó de linfa. Fragmentos de epitélio ou células epiteliais são transplantadas para o teclado limpo restantes gordura eo mouse está fechado.

Este artigo demonstra o procedimento desenvolvido por DeOme KB<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) eo procedimento poupando desenvolvido pela Brill B<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) para limpar o quarto bloco de gordura mamária inguinal de um rato púbere em preparação para o transplante de fragmentos mamários, células epiteliais mamárias, ou nas células mamárias tumor.

Procedimento de transplante do epitélio mamário

Este artigo descreve e compara o procedimento de exérese do coxim adiposo desenvolvido por DeOme KB et al.1 e o procedimento de preservação desenvolvido por Brill B et al.2, ...

Este vídeo demonstra os procedimentos para colher memória. Epitélio, limpe o coxim adiposo da memória e transplante epitélio exógeno para estudar o desenvolvimento da memória em camundongos de três semanas de idade; o crescimento da árvore epitelial da memória está confinado à vizinhança do mamilo, e o coxim adiposo é amplamente desprovido de epitélio da memória. À medida que o camundongo amadurece, a árvore epitelial cresce através do coxim adiposo.Na sétima semana de idade, a árvore ductal epitelial se estende por todo o coxim adiposo. Se a pequena porção do coxim adiposo contendo epitélio for removida na terceira semana de idade, o epitélio endógeno nunca colonizará o coxim adiposo e o coxim é descrito como limpo, permanecendo assim na maturidade. O epitélio ou células epiteliais doadoras transplantadas, no entanto, têm o potencial de estender árvores ductais por todo o hospedeiro limpo.Coxim adiposo. A histologia pode então ser utilizada para monitorar a progressão do desenvolvimento da memória em tecidos transplantados de animais transgênicos ou de teste. Olá, meu nome é Joseph Jerry, e estou no Departamento de Ciências Veterinárias e de Animais da Universidade de Massachusetts.Olá, meu nome é Karen Dunphy. Trabalho no Laboratório Jerry. Hoje vamos realizar um transplante de epitélio mamário.Utilizamos este procedimento para estudar a base molecular e celular da gênese de tumores de memória e um modelo para câncer de mama. Vamos começar. O primeiro passo do procedimento de transplante é colher o tecido epitelial de memória do camundongo doador.Inicie lavando um camundongo fêmea recém-eutanasiado com etanol 70%, sem perfurar as membranas das SRUs da cavidade corporal ventral. Faça um corte mediano sagital através da pele, estendendo-se do púbis até o esterno. Em seguida, faça um corte oblíquo a partir da incisão inicial no púbis em direção a cada pata traseira.Usando pin&ccedil;as curvas, segure as membranas das SRUs. Em seguida, usando pin&ccedil;as serrilhadas retas, segure a borda cortada da pele e retire cuidadosamente a parede do corpo das membranas das S cs.Para expor a quarta glândula inguinal associada à face inferior da parede corporal, localize o linfonodo dentro da glândula associada na interseção de três vasos sanguíneos proeminentes na glândula associada, podendo ser percebido como um nódulo denso dentro do tecido adiposo. Com a ponta de uma tesoura oftálmica, corte o tecido adiposo ao redor do linfonodo. Em seguida, com o indicador do lado epidérmico da pele, aplique pressão para elevar o nódulo para fora do tecido adiposo e remova-o com uma pinça.Com um par de pin&ccedil;as curvas, descarte o n&oacute;dulo linf&aacute;tico. Agora, mantendo as margens da pele firmes, segure o lobo adiposo com a borda curva de um par de pin&ccedil;as curvas e gradualmente desprenda o lobo da parede abdominal. Seguindo a dire&ccedil;&atilde;o do lobo em dire&ccedil;&atilde;o &agrave; superf&iacute;cie dorsal do camundongo, remova toda a gl&acirc;ndula em uma &uacute;nica pe&ccedil;a.Coloque a glândula salivar sobre um bloco de corte plástico estéril com uma pequena quantidade de meio, cerca de 200 microlitros sobre a superfície da glândula para mantê-la úmida. Em seguida, pique a glândula em pedaços de um milímetro com uma lâmina de barbear nova. Divida a glândula picada em quatro porções.Em seguida, utilizando pin&ccedil;as, distribua entre quatro tubos criog&ecirc;nicos contendo meio de congela&ccedil;&atilde;o. Coloque os tubos criog&ecirc;nicos em um congelador celular Nalgene com 250 mililitros de &aacute;lcool isoprop&iacute;lico no compartimento externo. Em seguida, coloque o congelador celular a menos 70 graus Celsius por 24 horas.Após 24 horas, transfira os frascos congelados de fragmentos de memória para nitrogênio líquido até o momento de serem necessários para o transplante. Cada frasco de criopreservação contém fragmentos suficientes de glândulas de memória para serem transplantados nos alvéolos livres de quatro a oito camundongos hospedeiros. Após verificar a profundidade da anestesia de um camundongo hospedeiro de três semanas por meio de uma pinça firme no dedo do pé, imobilize firmemente o camundongo com o lado ventral voltado para cima e as patas esticadas sobre uma plataforma cirúrgica, de modo que seu abdômen fique tenso.Analgésico pré-operatório, bupivacaína ou buprenorfina deve ser administrado por via subcutânea. Desinfete a área cirúrgica com álcool e uma solução iodada usando pinça. Segure a pele alguns milímetros acima da pelve e levante-a do abdômen.Corte cuidadosamente a pele, garantindo que a incisão inicial não fique muito próxima à uretra, onde a colocação de clipes cirúrgicos pode interferir na capacidade do camundongo de urinar. Em seguida, tomando cuidado para não perfurar as membranas das USR, faça um corte mediano sagital na pele, estendendo-se do púbis até o esterno.Agora, a partir do corte inicial, faça cortes oblíquos através da pele a partir da linha média, atravessando a pelve em direção a cada pata traseira. Usando pinças curvas, segure suavemente as membranas serosas da parede ventral do corpo. Em seguida, use pinças para tecidos para segurar a margem cortada da pele e puxe a parede do corpo para longe das membranas serosas.Para expor a quarta glândula inguinal mamária, identifique a quarta glândula mamária. Identifique a quinta glândula mamária, cauterize o nó do mamilo e duas artérias que levam ao nó. Separe a quarta e a quinta glândulas, em seguida cauterize a margem da quinta glândula.Em seguida, usando tesoura, corte transversalmente o coxim adiposo logo ventral ao nódulo para separar o coxim adiposo da quarta glândula mamária. Com pinça curva, segure firmemente a porção ventral do coxim adiposo e puxe-a para longe da parede abdominal. É recomendável prensar o tecido excisado entre duas lâminas identificadas e fixá-lo em fixador car noise.Posteriormente, o tecido pode ser corado, montado e avaliado quanto a margens livres. Usando pin&ccedil;as, remova todos os vest&iacute;gios da gl&acirc;ndula da mem&oacute;ria ao redor da regi&atilde;o da por&ccedil;&atilde;o removida do lobo adiposo. O animal est&aacute; agora pronto para transplante de tecido ou c&eacute;lulas.Tecido epitelial doador fresco ou congelado em nitrogênio líquido pode ser transplantado no alvolo adiposo esvaziado. Alternativamente, linhagens celulares epiteliais imortalizadas, linhagens celulares de tumor de memória ou células primárias podem ser transplantadas. Para detalhes sobre o preparo das células, consulte o protocolo escrito acompanhante para o transplante de fragmentos de epitélio. Preparado.Este vídeo começa descongelando um tubo criogênico de epitélio e transferindo os fragmentos para uma placa de Petri contendo meio fresco. Para diluir o DMSO com tesoura, faça um bolso no epitélio da almofada de gordura limpa do camundongo receptor. Em seguida, usando pinças de agulha, coloque um fragmento de um milímetro de epitélio doador dentro do bolso.Se necessário, segure o bolso fechado com pinça de tecido e retire a pinça da agulha para que o tecido permaneça no lugar. Segure as margens opostas da pele. Mantenha-as juntas com a pinça.Levante-os afastando das membranas serosas da cavidade corporal ventral e feche com clipes cirúrgicos. Use dois clipes para fechar a incisão mediana sagital e um clipe para cada incisão oblíqua. Evite obstruir a uretra, se necessário.Feche os espaços na pele no ponto de interseção das incisões mediano-sagital e oblíqua com um ponto cirúrgico. Coloque o camundongo em sua gaiola e mantenha a gaiola sob uma lâmpada de aquecimento até que o animal tenha se recuperado. Os clipes de ferida devem ser removidos após duas semanas.Os seguintes slides mostram imagens representativas do que se pode esperar encontrar na glândula de memória do hospedeiro após o esvaziamento do coxim alimentado e o transplante do epitélio; esta imagem mostra o epitélio de memória endógeno removido de um camundongo com três semanas de idade. No procedimento de esvaziamento da glândula, observe as margens nítidas na borda cortada. Uma montagem inteira como esta deve ser preparada após cada procedimento para avaliar a presença de margens livres. Esta imagem mostra o coxim adiposo clarificado do camundongo sete semanas após o procedimento de clareamento. Observe que todo o coxim adiposo está isento de memória, epitélio, hematina e asina. A coloração de um coxim adiposo clarificado sete semanas após o procedimento de clareamento também demonstra que a glândula está isenta de epitélio glandular.Um montagem inteira representativa de um coxim adiposo clarificado transplantado com epitélio memorizado doador de um camundongo de 10 semanas de idade é mostrada. Observe que o epitélio transplantado produziu árvores ductais epiteliais normais, hematina e asina. Coloração de um coxim adiposo clarificado e do epitélio memorizado.O transplante de epitélio na mesma idade revela a produção normal de ductos epiteliais a partir do epitélio exógeno. Aqui, hematina e asina, coloração de um coxim adiposo clarificado, mostram um transplante epitelial que se desenvolveu em um tumor mamário. Acabamos de mostrar como colher o epitélio mamário e realizar um transplante epitelial mamário.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de seccionar as conexões entre a quarta e a quinta glândula para cauterizar o nódulo e o mamilo, e remover todos os vestígios de epitélio endógeno. É necessário garantir que não haja nenhuma possibilidade de o epitélio endógeno crescer no leito adiposo esvaziado. Além disso, é aconselhável preparar um corte completo da porção removida da glândula mamária para verificar margens livres.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biology

Biologia

Neste relatório, nós demonstramos um sistema para isolar e cultura de células de doadores da glândula mamária do mouse, e ortotopicamente transplante dessas células em ratos para analisar estroma destinatário: interações epiteliais durante o desenvolvimento do tumor mamário.

Transplante mamária de células estromais e células de carcinoma em camundongos C57BL/6J

Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Não faltam modelos pré-clínicos que avaliam a terapia adjuvante visando metástases de câncer de mama. Para abordar isso, desenvolvemos um modelo murino de metástase de adenocarcinoma mamário pulmonar de novo , em que as terapias administradas na configuração adjuvante (ressecção pós-cirúrgica de tumores primários) podem ser avaliadas quanto à eficácia no impacto de metástases pulmonares previamente semeadas.

Procedimentos cirúrgicos e metodologia para um modelo de murina pré-clínica de De Novo Metástase do câncer mamário

Este protocolo descreve métodos para purificar, quantificar e caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exossomos de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas e para utilizá-las para transferir a capacidade de formação de glândula mamária para células epiteliais mamárias luminal. EVs / exosomas derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco podem transferir esta propriedade celular para células que ingerem EVs / exossos.

Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

Este trabalho demonstra uma nova abordagem para avaliar a proliferação, diferenciação e potencial de formação de vasos de células-tronco endoteliais vasculares (VESCs) através do transplante de almofada de gordura mamária, seguido de preparação de tecido total para a observação microscópica. Também é apresentada uma estratégia de rastreamento de linhagem para investigar o comportamento de VESC in vivo .

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

O objetivo deste protocolo é descrever uma nova abordagem de modelagem de câncer de mama baseada na injeção intraductal de adenovírus expressando CRE em glândulas mamárias de camundongo. Esta aproximação permite a manipulação Cell-Type-e órgão-específica de eventos oncogênico em uma maneira temporally controlada.

Modelagem de câncer de mama através de uma injeção intraductal de CRE-expressando Adenovirus na glândula mamária do mouse

Este artigo descreve um método de transplante para enxertar células epiteliais mamárias doadoras na almofada de gordura branca interscapular de animais receptores. Este método pode ser usado para examinar os efeitos do hospedeiro e/ou doador no desenvolvimento do epitélio mamário e elimina a necessidade de pré-compensação, estendendo assim a utilidade desta técnica.

Transplante de células epiteliais mamárias no Bloco de Gordura Branca Interscapular

Modelos de xenoenxerto derivados da paciente (PDX) e modelos transplantáveis de camundongos geneticamente modificados recapitulam fielmente a doença humana e são modelos preferidos para pesquisas básicas e translacionais sobre câncer de mama. Aqui, um método é descrito para transplantar ortotopicamente fragmentos de tumor de mama na almofada de gordura mamária para estudar biologia tumoral e avaliar a resposta medicamentosa.

Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

Apresentamos procedimentos cirúrgicos detalhados para mastectomia endoscópica bilateral poupadora de mamilos através de uma única incisão axilar com reconstrução mamária pré-peitoral imediata baseada em implante. Este procedimento é um método seguro e viável para pacientes com câncer de mama.

Mastectomia Endoscópica Bilateral Poupadora de Mamilos através de Incisão Axilar Única com Reconstrução Mamária Pré-peitoral Imediata

O presente estudo relata um protocolo mais fácil, que economiza tempo e é econômico para isolar e cultivar com eficiência células epiteliais mamárias humanas primárias (HMECs) a partir de pequenas quantidades de tecido mamário. Este protocolo é adequado para produzir rapidamente HMECs primários, tanto para aplicações laboratoriais quanto clínicas.

Isolamento e Cultura de Células Epiteliais Mamárias Humanas Primárias

Aprenda o procedimento de transplante do epitélio mamário em camundongos para estudar o desenvolvimento da glândula mamária. Este método demonstra a limpeza do tecido adiposo e o crescimento da árvore epitelial.

Procedimento de transplante do epitélio mamário

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