Name: Recuperação de oócitos de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a recuperar oócitos e embriões de fêmeas de Peromyscus usando microinjeção no infundíbulo. Este método padronizado permite estudos de expressão gênica e pesquisa transgênica em biologia reprodutiva.

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Gostaria de agradecer a Mike Dewey do Centro de Ações Peromyscus Genéticos para a sua ajuda, paciência e conhecimento.

Embrião / oócito de recuperação <ol><li> Pelo menos duas horas antes da recuperação de embriões / óvulos, KSOM é colocado na 37 º C incubadora de CO 2 e FHM devem ser descongeladas de -20 °. Um prato de vidro contendo três poços rasos côncava é usada para casa de gotas KSOM na incubadora. Para evitar a desidratação, o KSOM e prato são colocados em um recipiente com tampa que tem água no fundo. Este aparelho evita a evaporação, sem o uso de óleo mineral. </li><li> As tubas uterinas de uma fêmea a ovular são colocados na mídia FHM. Para garantir a orientação e um infindibulum intacto, uma pequena seção do ovário é cortado juntamente com a seção de oviduto e pequenas do útero. A agulha de calibre blunt 30 é utilizado para expulsar embriões / óvulos do oviduto, inserindo a agulha com no infindibulum. O infindibulum deve ser usado para recuperar os embriões já que a tubulação oviduto é pequena demais para uma agulha para passar. No caso em que o infindibulum é destruído, o oviduto deve ser cortado aberto ou embriões espremido. </li><li> Embriões / óvulos são encontrados na mídia FHM, concentrando-se o microscópio sobre a gotículas de gordura que têm afundado até o fundo da placa de Petri. Embrião / óvulo isolamento pode ser obtida em 20x, pois isso proporciona uma maior área de visualização de alta ampliação. Embrião / ovócitos parece rodada gotículas de gordura que tem um anel claro em torno dele. Pipetar à boca, usando um copo puxado capilar, é usado para mover os embriões / óvulos para KSOM para incubação e de manipulação posterior. </li></ol> Procedimento para a recuperação de oócitos Preparação <ol><li> Descongelar FHM e preparar KSOM. </li><li> Poucas horas antes, KSOM colocados no recipiente de recuperação de ovo e coloque na caixa de ponta com água no fundo, coloque na incubadora de CO 2. </li><li> Traga gaiolas para o laboratório e matar as fêmeas colheita. </li><li> Cortar o oviduto tendo o cuidado de cortar algumas do ovário e alguns do útero para garantir que você não cortou parte do oviduto. </li><li> Lugar na mídia FHM em placa de Petri pequena. </li><li> Despeje mais um par de pratos FHM media Petri a ser utilizada para a descarga. </li></ol> Flushing <ol><li> Use uma agulha de lavagem (30 gauge blunt) conectada a uma agulha de 1ml, com fim em espiral. </li><li> Tome um oviduto em um tempo e usando agulha, inserir no infundíbulo encontrado perto da parte do ovário esquerdo anexado. Se o infundíbulo é destruído e não pode ser usado, em seguida, tomar duas pinças e segure uma extremidade do oviduto. Com a pinça outro, aperte delicadamente, como um tubo de creme dental, para ejetar qualquer do embrião. Nota: Isto irá criar uma grande quantidade de sujeira na placa de Petri, como um monte de tecido virá com ele, assim que você pode querer usar uma placa de Petri diferente depois. </li><li> Para ver os embriões, o foco do microscópio em pedaços de gordura e procure por &quot;pedaço de gordura&quot; círculo redondo com clara em torno dele. Nota: Os embriões têm a mesma aparência que a gordura, por isso pode ser difícil de encontrar. Os embriões vão para o fundo, assim que olhar lá. </li><li> Fazer esfregaços vaginais de fêmeas destinatário. Nesta fase, devem ser pseudopregnant. </li></ol>

Neste artigo, demonstramos a recuperação de ovócitos de ovulação induzida (superovuladas) Peromyscus. O uso de superovulação (em oposição ao ciclo estral natural) é comum, devido ao número muito maior resultante. No entanto, o cuidado deve ser tomado na interpretação dos resultados utilizando oócitos tais / embriões, já que ambos os hormônios usados ​​para induzir a ovulação e cultura podem ter efeitos. Quando estral foi confirmado, as fêmeas são euthenized e tubas uterinas recuperados, juntamente com uma pequena porção de ovário. A...

<table><tbody><tr><td>Agulha de lavagem</td><td>Ferramenta</td><td>Zephyrtronics</td><td>ZT5-130-L</td><td>30 G cega</td></tr><tr><td>Pinceta (2)</td><td>Ferramenta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Peromyscus</td><td>Animal</td><td>Peromyscus Genetic Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Ferramenta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Meio tamponado com HEPES FHM</td><td>Reagente</td><td>Specialty Media</td><td>MR-025-d</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura embrionária KSOM (5x 10 mL)</td><td>Reagente</td><td>Specialty Media</td><td>MR-020P-5F</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta bucal</td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td><td>Puxada de capilares de vidro e conectada a tubo de borracha</td></tr><tr><td>Placa de contenção de ovócitos</td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td><td>Recipiente de vidro com reentrâncias côncavas</td></tr></tbody></table>

recuperação de oócitos de camundongos

Retrieval of Mouse Oocytes

Até o momento, poucos estudos têm relatado manipulações sucesso da embriogênese Peromyscus ou biologia reprodutiva. Juntamente com o Peromyscus genética de Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), estamos caracterizando as diferenças importantes necessários para desenvolver este sistema. A meta principal tem sido a de otimizar oócito / recuperação embrionária precoce.

Este protocolo ilustra a técnica para extrair óvulos ou embriões em estágio inicial fertilizado do oviduto de camundongos. A capacidade de identificar o infindibulum e inserir uma agulha na extremidade sem corte, é essencial a correta execução do procedimento.

Recuperação de oócitos de camundongos

Até o momento, apenas alguns estudos relataram manipulações bem-sucedidas da embriogênese ou da biologia reprodutiva de Peromyscus. Juntamente com o Peromyscus ...

Meu nome é Amanda dli. Sou do laboratório do Dr. Paul Verana na Universidade da Califórnia em Irvine. Hoje vou mostrar a vocês o procedimento para a coleta de ovócitos.Isso implica isolar o videx a partir da fêmea. Uma vez que os ovex forem isolados, injetaremos o meio FHM através do videx, e então os cytes deverão sair do útero. Após essa etapa, isolaremos os cytes no meio e utilizaremos isso para experimentos futuros.O que você talvez queira usar este procedimento para, além de isolar cito, é isolar embriões em pontos temporais específicos. Uma razão pela qual você talvez queira ver este procedimento no formato de vídeo é porque as diferentes partes do oviduto podem ser muito difíceis de reconhecer. Neste vídeo, estarei indicando o infundíbulo, onde você injetará o meio FHM.As ferramentas de dissecação que você utilizará são dois pares de pinças finas e um par de tesoura afiada. Os ductos ovarianos retirados da fêmea serão colocados em meio FHM, que está em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros. Os ovos serão recuperados usando uma agulha de ponta romba de 30 milímetros acoplada a uma seringa de um mililitro, e o uc será estabilizado com uma pinça fina.O FHM é um meio de manutenção utilizado para colher os cítos. O KSOM é o meio utilizado para permitir o crescimento dos cítos dentro do incubador, caso sejam fertilizados. Assim que os óvulos e embriões forem recuperados do oviduto, usaremos uma pipeta de transferência de vidro, puxada a partir de um tubo capilar, acoplada a um tubo e pipetada com a boca para transferir os materiais para um meio de manutenção.Um recipiente de vidro côncavo é usado para acomodar embriões e ovos. Eles podem ser colocados em cada círculo côncavo de modo que fiquem em um local definido, o que facilita sua localização. Este recipiente é colocado nesta cuba para que possa ser introduzido em uma incubadora de CO₂ sem o uso de óleo.Na parte superior do meio FHM ou KSOM, dependendo do meio, coloca-se água na base, fecha-se a torneira e o líquido permanece no lugar. O etanol a 70% é usado para garantir que os pelos não interfiram. Faremos uma pequena incisão na região abdominal e uma incisão na cavidade abdominal.Vamos ampliar uma incisão para expor a região abdominal. Uma vez feito isso para expor o útero, moveremos os intestinos, a propósito, e então o útero está bem abaixo. O útero tem formato de Y e eles giram amplamente, levando parte do útero.Quando é cortado, o oviduto parece espaguete. Vou tentar retirar uma parte do oviduto. Vou coletar o UCT e parte dos ovários, que está envolta em gordura.O outro lado será removido neste momento. Novamente, vamos pegar o ovário ou o útero. Segure o útero aqui e corte abaixo do nosso ponto de fixação. Os ductos deferentes são encontrados neste ponto.Vou levar uma parte do ovário OV conosco. Em seguida, isso será colocado no meio de cultura. O útero ainda está contraindo.O útero é composto por músculo liso, portanto, mesmo estando destacado do corpo, os neurônios ainda estão disparando. O útero é mostrado aqui. Embora o ducto OV pareça espaguete e o ovário esteja acima dele, o ducto OV na verdade não está ligado ao ovário.Embora tenhamos mostrado apenas uma parte do ovário neste momento, minha mão dominante é a direita, com a qual seguro a agulha romba de calibre 30. Utilizo-a como uma pinça para isolar o in fibula. Uma vez isolado, injetarei a agulha romba no in fibula e introduzirei um líquido, que fluirá para fora do útero.A minha mão esquerda segura uma pinça fina. Esta é usada para isolar a fibula e manter tudo no lugar. A amídula é uma estrutura em forma de trombeta isolada aqui.A ponta da minha agulha está na fíbula, atravessando a camada de tecido. Ok. Para garantir que isolei todos os embriões e ovos, gosto de comprimir o útero como se fosse um tubo de pasta de dente. Uma vez focado nos coxins de gordura, procure por gotículas de gordura que pareçam perfeitamente simétricas.Há um bem agora à esquerda daquela gordura longa. Esse é um único ovo. Então, o que vou fazer é usar a boca da pipeta, pegar o ovo e colocá-lo em mais meio de manutenção, para que possamos isolar os próprios ovos.Hoje eu mostrei a você como isolar cítulas do trato reprodutivo feminino. Além disso, mostrei as diferentes estruturas da tuba uterina. Em particular, o infundíbulo, que é a única estrutura na qual você pode injetar o meio FHM.Com uma agulha de 30 graus. Com esta técnica, isolei células e quaisquer embriões que tenham estado presentes na via reprodutiva feminina. Posso utilizar estes para estudos de expressão gênica ou trabalhos transgênicos.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Este vídeo descreve o isolamento de oócitos antrais de ovários de camundongos recém-colhidos. Esses oócitos antrais podem ser usados para caracterização adicional e estudos de desenvolvimento.

Isolamento de oócitos antrais de camundongos: um método para isolar oócitos antrais de ovários de camundongos recém-colhidos

Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Aqui apresentamos um protocolo para a caracterização de oócitos antrais de rato com base na organização nucleolar.

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo.

Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar o impacto físico do citoesqueleto na forma nuclear e nas organelas sem membrana interna no sistema oócito de camundongos. A estrutura pode ser adaptada para uso em outros tipos de células e contextos.

Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

Este protocolo descreve procedimentos para maturação in vitro de oócitos de camundongo, fertilização in vitro e subsequente cultura embrionária até o estágio de blastocisto.

Maturação in vitro, fertilização e cultura de embriões pré-implantacionais em ovocitos de camundongos

Este filme eo protocolo são destinados a ajudar o aprendizado de transferência nuclear.

Transferência nuclear em oócitos de camundongos

Aprenda a recuperar oócitos e embriões de fêmeas de Peromyscus usando microinjeção no infundíbulo. Este método padronizado permite estudos de expressão gênica e pesquisa transgênica em biologia reprodutiva.

Recuperação de oócitos de camundongos

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