Recuperação de oócitos de camundongos

Meu nome é Amanda dli. Sou do laboratório do Dr. Paul Verana na Universidade da Califórnia em Irvine. Hoje vou mostrar a vocês o procedimento para a coleta de ovócitos.

Isso implica isolar o videx a partir da fêmea. Uma vez que os ovex forem isolados, injetaremos o meio FHM através do videx, e então os cytes deverão sair do útero. Após essa etapa, isolaremos os cytes no meio e utilizaremos isso para experimentos futuros.

O que você talvez queira usar este procedimento para, além de isolar cito, é isolar embriões em pontos temporais específicos. Uma razão pela qual você talvez queira ver este procedimento no formato de vídeo é porque as diferentes partes do oviduto podem ser muito difíceis de reconhecer. Neste vídeo, estarei indicando o infundíbulo, onde você injetará o meio FHM.

As ferramentas de dissecação que você utilizará são dois pares de pinças finas e um par de tesoura afiada. Os ductos ovarianos retirados da fêmea serão colocados em meio FHM, que está em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros. Os ovos serão recuperados usando uma agulha de ponta romba de 30 milímetros acoplada a uma seringa de um mililitro, e o uc será estabilizado com uma pinça fina.

O FHM é um meio de manutenção utilizado para colher os cítos. O KSOM é o meio utilizado para permitir o crescimento dos cítos dentro do incubador, caso sejam fertilizados. Assim que os óvulos e embriões forem recuperados do oviduto, usaremos uma pipeta de transferência de vidro, puxada a partir de um tubo capilar, acoplada a um tubo e pipetada com a boca para transferir os materiais para um meio de manutenção.

Um recipiente de vidro côncavo é usado para acomodar embriões e ovos. Eles podem ser colocados em cada círculo côncavo de modo que fiquem em um local definido, o que facilita sua localização. Este recipiente é colocado nesta cuba para que possa ser introduzido em uma incubadora de CO₂ sem o uso de óleo.

Na parte superior do meio FHM ou KSOM, dependendo do meio, coloca-se água na base, fecha-se a torneira e o líquido permanece no lugar. O etanol a 70% é usado para garantir que os pelos não interfiram. Faremos uma pequena incisão na região abdominal e uma incisão na cavidade abdominal.

Vamos ampliar uma incisão para expor a região abdominal. Uma vez feito isso para expor o útero, moveremos os intestinos, a propósito, e então o útero está bem abaixo. O útero tem formato de Y e eles giram amplamente, levando parte do útero.

Quando é cortado, o oviduto parece espaguete. Vou tentar retirar uma parte do oviduto. Vou coletar o UCT e parte dos ovários, que está envolta em gordura.

O outro lado será removido neste momento. Novamente, vamos pegar o ovário ou o útero. Segure o útero aqui e corte abaixo do nosso ponto de fixação. Os ductos deferentes são encontrados neste ponto.

Vou levar uma parte do ovário OV conosco. Em seguida, isso será colocado no meio de cultura. O útero ainda está contraindo.

O útero é composto por músculo liso, portanto, mesmo estando destacado do corpo, os neurônios ainda estão disparando. O útero é mostrado aqui. Embora o ducto OV pareça espaguete e o ovário esteja acima dele, o ducto OV na verdade não está ligado ao ovário.

Embora tenhamos mostrado apenas uma parte do ovário neste momento, minha mão dominante é a direita, com a qual seguro a agulha romba de calibre 30. Utilizo-a como uma pinça para isolar o in fibula. Uma vez isolado, injetarei a agulha romba no in fibula e introduzirei um líquido, que fluirá para fora do útero.

A minha mão esquerda segura uma pinça fina. Esta é usada para isolar a fibula e manter tudo no lugar. A amídula é uma estrutura em forma de trombeta isolada aqui.

A ponta da minha agulha está na fíbula, atravessando a camada de tecido. Ok. Para garantir que isolei todos os embriões e ovos, gosto de comprimir o útero como se fosse um tubo de pasta de dente. Uma vez focado nos coxins de gordura, procure por gotículas de gordura que pareçam perfeitamente simétricas.

Há um bem agora à esquerda daquela gordura longa. Esse é um único ovo. Então, o que vou fazer é usar a boca da pipeta, pegar o ovo e colocá-lo em mais meio de manutenção, para que possamos isolar os próprios ovos.

Hoje eu mostrei a você como isolar cítulas do trato reprodutivo feminino. Além disso, mostrei as diferentes estruturas da tuba uterina. Em particular, o infundíbulo, que é a única estrutura na qual você pode injetar o meio FHM.

Com uma agulha de 30 graus. Com esta técnica, isolei células e quaisquer embriões que tenham estado presentes na via reprodutiva feminina. Posso utilizar estes para estudos de expressão gênica ou trabalhos transgênicos.