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Uma preparação de epitélio olfativo é montada em um prato e colocada em uma corrente de ar umidificado. Sob um microscópio de dissecação, um eletrodo de referência é conectado eletricamente ao tecido por meio de uma solução tampão. Um eletrodo de registro é colocado na superfície do epitélio olfatório.

O epitélio olfatório é estimulado por sopros de odor controlados por computador administrados em uma corrente de ar umidificado, que transporta os odores para o epitélio olfatório. Os sinais EOG são transmitidos através de um amplificador e digitalizador para o computador de gravação. Olá, sou Catherine Ciar, do Laboratório de Higiene XO do Departamento de Biologia da Universidade Johns Hopkins.

Hoje mostraremos um procedimento para registrar o grama eletroolf facto de camundongos. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar as respostas dos neurônios sensoriais olfativos aos odores. Então vamos começar.

O aparelho de registro consiste em um eletrodo de registro, eletrodo de referência, tubo de fornecimento de ar, estágio de amostra e microscópio de dissecação, todos ancorados em uma mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday. Os manipuladores Microm são usados para a colocação dos eletrodos no tubo de fornecimento de ar. Uma corrente de ar contínua é borbulhada através de água destilada para adicionar umidade antes de passar pelo tubo de fornecimento de ar e sobre a amostra.

Uma placa de cultura de 60 milímetros cheia de sardinha para adaptação de seis a oito milímetros é usada como superfície de montagem para a amostra. Um poço e um canal são escavados fora da guarda no prato de montagem. Fornecer um meio de conectar eletricamente o eletrodo de referência à amostra por meio de solução de campainha modificada.

Os eletrodos de gravação e referência são conectados a um amplificador. Os sinais do amplificador são enviados para um digitalizador e depois para um computador. O software gráfico XI é usado para controlar o protocolo de estimulação, registrar o sinal e analisar as respostas.

Um osciloscópio é conectado após o amplificador para monitoramento em tempo real do potencial elétrico durante a colocação do eletrodo de gravação. E durante as gravações EOG. A entrega dos estímulos odoríferos é controlada por um pico spritzer, que é conectado ao mesmo computador usado para aquisição de sinal pouco antes de fornecer um estímulo odorante.

A saída do pico spritzer é conectada a um frasco de odor contendo odorante líquido. A garrafa é então conectada ao tubo de fornecimento de ar. Agora vamos ver como preparar eletrodos para registrar experimentos.

O eletrodo de gravação é um fio de cloreto de prata em um capilar de vidro puxado preenchido com solução de ringer modificada. O eletrodo de referência é um fio de prata cloreto. Comece a preparação de ambos os eletrodos instalando um fio de prata no suporte do eletrodo.

Para o eletrodo de registro, um a dois centímetros de fio devem sobressair da extremidade do suporte do eletrodo. Mais fio pode ser deixado para o eletrodo de referência. Para adicionar o revestimento de cloreto de prata, posicione o fio em cloreto de sódio 0.1 molar e conecte o suporte do eletrodo ao terminal positivo de uma fonte de alimentação CC de 1.5 a nove volts.

O terminal negativo da fonte de alimentação deve ser conectado eletricamente à solução de cloreto de sódio 0.1 molar. Deixe o cloreto em reação prosseguir por 10 minutos para equalizar qualquer carga estática entre o registro e o eletrodo de referência. Toque brevemente os eletrodos antes de instalá-los no aparelho de gravação.

Em seguida, puxe um capilar de vidro usando um micro extrator de pipeta. A abertura na ponta do capilar deve ter cerca de cinco a 10 mícrons de diâmetro. Use um lápis de diamante para marcar e quebrar a extremidade romba do capilar de forma que fique cerca de dois centímetros mais longo que o fio de prata.

Use uma tocha de butano para polir a ponta cortada, agora derreta 0,5% agros em solução de campainha modificada. Use uma pipeta de transferência para puxar uma pequena quantidade de solução agro derretida para a ponta do eletrodo usando uma seringa que foi aquecida e puxada para ter uma extremidade longa e fina. Encha o capilar puxado cerca de metade do caminho.

Com a solução de campainha modificada, agite suavemente o capilar para desalojar quaisquer bolhas de ar. Armazene o eletrodo cheio no frasco de armazenamento com uma pequena quantidade de solução de campainha modificada no fundo até que esteja pronto para ser usado. Assim que uma amostra de tecido estiver preparada e pronta para gravação, instale um capilar preenchido sobre o fio do eletrodo de gravação com os eletrodos prontos.

Vejamos um experimento de gravação para começar a preparar o tecido para gravação. Remova a pele que cobre o crânio de um rato sacrificado e junte a cabeça ao longo da montagem da linha média, metade da cabeça com o lado medial para cima no prato de montagem. Remova cuidadosamente o septo para expor os cornetos.

Coloque o prato com o lenço de papel montado no palco de gravação. Alinhe a platina de modo que o local de gravação nos cornetos fique centralizado sob o microscópio. Agora ligue o tanque de ar para fornecer ar umidificado a cerca de 600 mililitros por minuto para a superfície do corneto.

Posicione o tubo de fornecimento de ar de forma que fique a aproximadamente 10 milímetros de distância do local de gravação. Defina o amplificador para o modo DC, pois a amplificação AC induzirá artefatos no sinal EOG. Adquira com um filtro passa-baixa de um kilohertz e ganho de 100 x.

Agora monte os eletrodos de gravação e referência nos micromanipuladores. Abaixe o eletrodo de referência no poço do prato de montagem e cubra-o com solução de campainha modificada de forma que seja conectado eletricamente ao tecido. Abaixe cuidadosamente o eletrodo de registro na superfície do corneto dois B ou três.

O eletrodo mal deve tocar a superfície do epitélio olfatório. Quando o eletrodo entra em contato com o epitélio, uma linha de base reta aparecerá no osciloscópio. Agora, conecte um frasco de odor à porta lateral do tubo de fornecimento de ar no computador.

Inicie um protocolo de estimulação. A taxa de amostragem para aquisição de dados deve ser de dois kilohertz ou mais. O software acionará um pulso de odor e começará a gravar.

Um protocolo de estimulação típico pode ter uma duração de 100 milissegundos, pulso único emparelhado, pulsos de 100 milissegundos separados por um intervalo de um segundo ou um pulso sustentado de dez segundos. Para minimizar a adaptação, aguarde de um a cinco minutos entre os protocolos após a administração de altas concentrações de odor. O odor residual pode permanecer no tubo, lave o tubo de ar com etanol 95% e seque antes de continuar com amostras adicionais de tecido.

O software de enxerto Axo fornece ferramentas para medir os principais parâmetros do sinal EOG. Tais parâmetros incluem a amplitude de resposta, latência, tempo até o pico e constantes de tempo de terminação. Vários parâmetros do EOG são particularmente úteis para comparação de respostas normalizadas entre camundongos, incluindo a amplitude de resposta, o tempo de aumento da latência, o tempo até o pico e a constante de tempo de terminação.

Aqui são mostrados OGs de um camundongo em resposta à estimulação com concentrações crescentes de acetato de amila líquido. A linha preta na parte superior indica o tempo e a duração da estimulação do odorante. Aqui vemos uma relação de resposta à dose em média de cinco barras de erro de camundongos com intervalos de confiança de 95%.

Um declínio na amplitude de pico é frequentemente observado em concentrações de odor muito altas. Um exemplo de um EOG em resposta a uma estimulação de pulso emparelhado é mostrado: um único pulso curto de odorante provoca adaptação com duração de vários segundos. Aqui é mostrado um EOG em resposta a 10 segundos de estimulação sustentada de odorantes.

O EOG mostra dessensibilização durante a apresentação contínua de odorantes. Acabamos de mostrar como registrar o fator grama do eletrodo de camundongos. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de colocar o eletrodo apenas na superfície do epitélio e não penetrar no eletrodo abaixo da superfície.

Sempre grave do mesmo lado da cabeça e evite modificações na configuração para minimizar a variação, mantenha o tecido úmido, mas sem coletar gotículas de líquido, colocar o tecido sob o ar umidificado imediatamente após a dissecção manterá o tecido no melhor estado para gravação. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.