Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs
22 de março de 2010
Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.
Células-tronco mesenquimais, abreviadas como CSMs, são isoladas de uma rata fêmea de oito semanas de idade e cultivadas em uma placa de Petri de 10 centímetros até atingirem cerca de 80% de confluência. Para enriquecer as CSMs, as células são marcadas com anticorpos primários conjugados à biotina, seguidos por microesferas magnéticas conjugadas à estreptavidina. As células marcadas são então separadas em duas frações, a fração negativa e a fração positiva, por meio de separação magnética ativada de células.
Posteriormente, a análise por citometria de fluxo é utilizada para confirmar a expressão dos marcadores de superfície. Por fim, cilindros de clonagem são usados para obter MSCs derivadas de colônia única. Olá, sou Lee do laboratório de Christina Chang do Departamento de Engenharia Química e Ciência dos Materiais da Universidade Estadual de Michigan.
Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento e enriquecimento de células-tronco quiméricas, bem como para a obtenção de células derivadas de colônia única. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os comportamentos de proliferação e diferenciação de células-tronco vermelhas. Então, vamos começar.
Células-tronco mesenquimais ou CSMs serão isoladas de uma rata fêmea Spra Dolly com seis a oito semanas de idade. Para iniciar este procedimento, remova os fêmures e tíbias dos membros posteriores do animal eutanasiado. Retire a pele e os músculos, coloque os fêmures e tíbias dissecados em isopropanol 70% por alguns segundos e, em seguida, transfira-os para um X-D-P-B-S.
Os seguintes passos devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica. Primeiro, transfira o fêmur e a tíbia para uma placa de 10 centímetros contendo DMEM. Em seguida, enquanto segura cada osso com pinças, corte as duas extremidades com tesoura.
Acople uma agulha de calibre 22 a uma seringa de três mililitros e preencha-a com DMEM. Insira a agulha em uma das extremidades abertas do osso e lave a medula para um tubo de 50 mililitros. Repita duas a três vezes para cada osso, até que toda a medula tenha sido obtida.
Resuspenda as células, em seguida, passe a suspensão celular por um filtro celular de 70 micrômetros para remover detritos ósseos e agregados sanguíneos. Centrifugue as células a 200 ×g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Após a remoção do sobrenadante por aspiração, ressuspenda as células em 25 mililitros de meio para sementeira de CMM.
10 mililitros de suspensão celular em cada um de dois pratos de cultura de 10 centímetros. Incubar os pratos de cultura em uma estufa com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma a duas semanas. Assim que os MSCs de rato previamente isolados atingirem uma confluência de cerca de 80%, aspirar o meio e adicionar quatro a cinco mililitros de tripsina EDTA a cada prato.
Retorne as placas ao incubador e incube por cerca de cinco minutos. Para permitir a dessanexação celular, adicione uma quantidade igual de meio de cultura para inativar a tripsina. Colete as suspensões celulares em um tubo de 15 mililitros e centrifugue as células a 200 ×g, a 4 °C, por cinco minutos.
Agora demonstraremos o enriquecimento de MSCs por dois marcadores de superfície, CD 54 e CD 90. Utilizando o ímã de separação celular BD I da BD Biosciences, comece ressuspendendo o pellet celular no tampão de marcação celular a 20 milhões de células por mililitro.
Em seguida, adicione o anticorpo biotinilado CD54 e o anticorpo biotinilado CD90 à suspensão celular e, após incubação no gelo por 15 minutos, misture suavemente. Lave as células marcadas com um volume em excesso de tampão BD IMAG 1X. Centrifugue as células marcadas a 200 ×g e 4 °C durante cinco minutos. Prepare as partículas de estreptavidina BD IMAG agitando-as vigorosamente em vórtex e, em seguida, adicione 40 microlitros de partículas para cada 10 milhões de células.
Misture bem as partículas com as células marcadas e incube as células a seis a 12 graus Celsius por 30 minutos. Durante esse período de incubação, rotule um tubo de ensaio cônico para coletar a fração positiva. Ao final da incubação, ajuste o volume de marcação para 20 milhões de células por mililitro.
Com um tampão Expedia I mag. Transfira as células marcadas para o tubo de coleta da fração positiva. Coloque o tubo da fração positiva no ímã BDI e deixe por seis minutos.
Em seguida, com o tubo da fração positiva ainda no ímã BDI, remova o sobrenatante com uma pipeta de vidro tipo Pasteur. A seguir, remova o tubo da fração positiva do ímã BDI e coloque-o no gelo. Adicione um mililitro de tampão XBDI mag gelado e ressuspenda as células com mistura suave.
Coloque o tubo de volta no ímã BDI e deixe-o repousar por dois a quatro minutos. Remova o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur nova. Repita a lavagem conforme descrito anteriormente.
Mais uma vez. Por fim, remova o sobrenadante com uma nova pipeta de vidro Pasteur. Em seguida, retire o tubo do ímã BDI reus.
Suspenda as células em um mililitro de meio de cultura e transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros contendo 25 mililitros de semente de meio. Um frasco quadrado de 175 centímetros quadrados para manutenção das células e uma placa de 10 centímetros para citometria de fluxo.
Para iniciar o procedimento de separação de MSCs derivadas de colônia única, plaque as células em aproximadamente 50 a 100 células por placa de 10 centímetros e incube em uma estufa a 37 °C e 5% de dióxido de carbono por um a duas semanas. Durante esse período de uma a duas semanas, examine colônias bem isoladas com um microscópio invertido. Assim que as colônias atingirem um tamanho suficiente, com mais de 100 células em cada colônia, marque-as com uma caneta permanente na parte inferior da placa.
Ao escolher uma colônia para ser marcada, certifique-se de que não haja colônias vizinhas próximas. Aspire o meio e lave a placa uma vez com X-D-P-B-S usando pinças. Pegue um cilindro de clonagem estéril e coloque-o suavemente ao redor da colônia marcada.
Repita isso até que cada colônia marcada tenha um cilindro de clonagem posicionado sobre ela. Adicione 100 microlitros de tripsina EDTA a cada cilindro de clonagem e retorne a placa ao incubador. Após cinco minutos, verifique as células ao microscópio para observar se estão se arredondando.
Quando as células se destacarem, adicione uma quantidade igual de meio de cultura para inativar a tripsina. Misture a suspensão celular com uma micropipeta de 200 microlitros e transfira a suspensão celular para um recipiente de 60 milímetros contendo três mililitros de meio de cultura pré-aquecido. Rotule os recipientes e devolva-os ao incubador Bader, após o isolamento em plástico aderente.
As CMMs devem ser visíveis no dia seguinte após a semeadura. Conforme as células continuam a proliferar, as células confluentes devem apresentar-se semelhantes às células mostradas nesta imagem de contraste de fase, nas quais a maioria tem aspecto fusiforme ou estrelado. O cultivo é apropriado quando as células atingem cerca de 80% de confluência.
Após a tripsinização, as células destacadas devem parecer arredondadas e flutuando no meio. Uma vez que as MSCs são enriquecidas por triagem celular magnética, a citometria de fluxo é realizada para verificar as expressões dos marcadores de superfície. Se o enriquecimento for bom, as células devem mostrar coloração positiva contra os marcadores de MSCs, CD54 e CD90, mas negativa contra o marcador de HSC CD45; controles isotípicos IgG2a e IgG1 são utilizados como controles negativos.
Quando as células são semeadas em uma densidade clonal adequada, colônias devem surgir a partir de células individuais, conforme mostrado neste exemplo. Cilindros de clonagem podem então ser usados para separar as colônias, e as células derivadas dessas colônias podem ser cultivadas separadamente. Nestes dois exemplos, as células derivadas de uma colônia são alongadas, enquanto as células derivadas de outra colônia são arredondadas.
Portanto, mostramos a você como isolar e enriquecer células-tronco comuns e aleatórias, bem como como obter células derivadas de colônia única. Durante este procedimento, é importante lembrar-se de remover os coágulos sanguíneos e os detritos ósseos durante a isolamento. Utilize a quantidade ideal de anticorpo durante o enriquecimento e marque cuidadosamente as colônias bem isoladas durante a separação das colônias.
É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este estudo foca-se no isolamento e enriquecimento de células-tronco mesenquimais (MSCs) de fêmures e tíbias de ratos. As células são separadas utilizando triagem magnética de células e confirmadas quanto à expressão de marcadores de superfície por meio de citometria de fluxo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Técnicas de Classificação de Células
- Citometria de Fluxo
Contexto
- As células-tronco mesenquimais (MSCs) têm aplicações potenciais na medicina regenerativa.
- O isolamento e o enriquecimento de MSCs são essenciais para seu uso eficaz na pesquisa.
- A separação celular magnética é uma técnica amplamente utilizada para o enriquecimento celular.
- A citometria de fluxo permite a análise de marcadores de superfície celular.
Objetivo do Estudo
- Isolar MSCs de tecidos ósseos de rato.
- Enriquecer as células isoladas utilizando métodos de separação magnética.
- Confirmar a identidade das MSCs por meio de análise de marcadores superficiais.
Métodos Utilizados
- Isolamento de CMMs de fêmures e tíbias de ratos.
- Enriquecimento de CMMs utilizando anticorpos conjugados à biotina e microesferas magnéticas.
- Separacão das células em frações positivas e negativas por meio de triagem celular ativada por campo magnético.
- Análise por citometria de fluxo para confirmar a expressão de marcadores de superfície.
- Cultivo das células em densidade clonal para formação de colônias individuais.
- Uso de cilindros de clonagem para separar as colônias.
Resultados Principais
- Isolamento e enriquecimento bem-sucedidos de CMMs a partir de tecidos ósseos de rato.
- Confirmação da expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo.
- Estabelecimento de CMMs derivadas de colônia única para estudos posteriores.
Conclusões
- Os métodos empregados isolam e enriquecem efetivamente as CMM.
- A citometria de fluxo é uma técnica confiável para confirmar a identidade celular.
- As CMM derivadas de colônia única podem ser utilizadas em diversas aplicações na pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e o enriquecimento de células-tronco mesenquimais (MSCs) da medula óssea de ratos permitem a validação precoce de alvos na pesquisa de medicina regenerativa. O protocolo contribui para a redução de riscos mecanicistas ao isolar subpopulações homogêneas por meio de separação magnética e separação clonal, melhorando a confiabilidade preditiva em aplicações posteriores. Este fluxo de trabalho posiciona a caracterização de MSCs como uma etapa reprodutível em pipelines de descoberta pré-clínica para o desenvolvimento de terapias celulares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da heterogeneidade das CMM ao isolar subpopulações derivadas de colônias individuais para avaliação funcional.
- Valor Operacional: Oferece um método padronizado para enriquecer CMMs utilizando os marcadores superficiais CD54 e CD90, reduzindo a variabilidade em modelos experimentais.
- Valor Preditivo: Apoia a confirmação de alvos ao validar a identidade das CMMs por citometria de fluxo e esgotamento de CHS (CD45 negativo), fortalecendo triagens baseadas em hipóteses.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera populações purificadas de CMM adequadas para padronização de ensaios e triagem reprodutível de compostos.
- Valor Operacional: A separação magnética produz resultados escalonáveis e quantitativos, compatíveis com fluxos de trabalho de alto rendimento.
- Prontidão para Ensaios: Cilindros de clonagem permitem a separação de variantes fenotípicos para avaliação paralela de características de proliferação e diferenciação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: As MSCs derivadas de colônias únicas fornecem sistemas relevantes para avaliar o potencial de diferenciação linhagem-específica.
- Redução Mecanística de Riscos: Subpopulações isogênicas reduzem o ruído em avaliações pré-clínicas de eficácia e segurança.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a priorização de clones de MSCs com multipotência desejada para desenvolvimento adicional.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se a fluxos de trabalho de descoberta precoce, apoiando a progressão desde o isolamento de CMM até a identificação de compostos líderes por meio da caracterização clonal e validação funcional.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses sobre subpopulações de CMM ao eliminar a contaminação hematopoética e enriquecer células CD54/CD90+.
- Triagem: Produz culturas padronizadas de CMM aderentes, prontas para triagem de bibliotecas de compostos e ensaios de resposta à dose.
- Análises: A citometria de fluxo fornece dados quantitativos de expressão de marcadores, permitindo comparação objetiva entre populações enriquecidas e não tratadas.
- Pesquisa Translacional: A expansão clonal apoia estudos de alinhamento de biomarcadores ao associar fenótipo de superfície com desempenho funcional.
- Reutilização Empresarial: O protocolo estabelece uma plataforma reutilizável de preparação de CMM aplicável a múltiplos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar subpopulações definidas de CMM com fenótipos superficiais validados.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de separação magnética e isolamento clonal.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao fornecer dados quantitativos de enriquecimento de CMM no início da descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a alocação de recursos ajustada ao risco com base na potência clonal e na capacidade de diferenciação.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco, separação magnética de células e citometria de fluxo.
- Depende do acesso ao sistema BD IMag, anticorpos biotinilados e cilindros de clonagem.
- Necessita padronização entre equipes para enriquecimento consistente de CMM e densidade de plaqueamento clonal.
- A adaptação a outras espécies ou fontes de tecido pode exigir otimização da digestão enzimática e dos painéis de anticorpos.
- As limitações práticas incluem a persistência da heterogeneidade das CMM apesar do enriquecimento e a variabilidade na eficiência de formação de colônias.
