Name: Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-22T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprenda a isolar e enriquecer células-tronco mesenquimais de ratos usando separação magnética e citometria de fluxo. Este método permite obter colônias únicas para estudos de biologia celular.

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O trabalho foi suportado em parte pelo National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439 e R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0.941.055), ea Fundação MSU.

1. Isolamento de CTMs Rat Células-tronco mesenquimais foram isoladas 6-8 semanas de ratos Sprague-Dawley, sexo feminino, como descrito anteriormente 1, 2. MSCs isoladas podem aderir à superfície de plástico e facilmente expandir durante a cultura in vitro. <ol><li> O animal foi colocado em uma câmara de anestesia e anestesiados por cerca de cinco minutos. Durante a anestesia, observe a taxa de respiração, piscando e atividade motora. Remover o animal da câmara, imediatamente após parar a atividade motora ea taxa de piscar se tornou freqüente. </li><li> Lay o animal para baixo em uma estação de operação e matar o animal por deslocamento cervical. Cortar o fémur ea tíbia de membros de volta, retire a pele e os músculos. </li><li> Coloque os fêmures dissecados ea tíbia em 70% isopropanol por alguns segundos e transferência para 1X D-PBS. </li><li> Em um armário de biossegurança, o fémur ea tíbia foram transferidos para um prato de 10 centímetros contendo DMEM. Cada osso foi então realizada com pinças e as duas extremidades foram cortadas aberto com uma tesoura. Coloque uma agulha 22G a uma seringa de 3 ml e preenchê-lo com DMEM e então dê descarga da medula em um tubo de 50ml, inserindo a agulha de uma extremidade aberta do osso. Repetir 2 a 3 vezes para cada osso. Quando todas as abóboras foram obtidos, ressuspender as células e passar a suspensão de células através de um filtro de células 70μm para remover os escombros dos ossos e agregados sangue. </li><li> Spin down células em 200g, 4 ° C por 5 minutos e retire o sobrenadante por aspiração. Ressuspender as células em 25ml médio MSC (DMEM contendo 10% FBS e 1% Pen-Strep). 10ml de suspensão celular foi semeado em cada placa de cultura 10 centímetros para um total de dois pratos. Manter os pratos da cultura em 37 ° C e 5% incubadora de CO 2 para 1 a 2 semanas. Meio foi trocado a cada 2 a 3 dias. </li></ol> 2. Enriquecimento de Rat MSCs Uma série de proteínas de superfície foram utilizados para enriquecer MSCs, incluindo CD54, CD90, CD73, CD105 e CD271 3-5. Em nosso estudo, usamos CD54 e CD90 como marcadores para enriquecer MSCs por separação de células magnéticas. <ol><li> Quando as células atingiram cerca de 80% confluência, aspirar o médio e adicione 4 ~ 5 ml de tripsina-EDTA para cada prato. Coloque os pratos de volta para a incubadora e incubar por cerca de 5 minutos para permitir que o desapego celular. Uma vez que as células foram destacadas, adicionar igual quantidade de meio de cultura para inativar a tripsina. Coletar suspensão de células em um tubo de 15ml e células spin down em 200g, 4 ° C por 5 minutos. </li><li> Os próximos passos descrevem como enriquecer MSCs por dois marcadores de superfície CD54 e CD90 de acordo com o manual para separação de células usando BD IMagnet. Pellet celular foi ressuspenso em tampão de coloração de células (3% de calor FBS inativada em 1X D-PBS) a 20 milhões de células / ml. Anticorpos CD54 biotinilado (0.25μg por milhão de células) e de anticorpos CD90 biotinilado (0.15μg por milhão de células) foi adicionado e misturado levemente com a suspensão de células. Após a incubação em gelo por 15 minutos, células marcadas foram lavados com um volume acima de 1X tampão Imag BD. As células marcadas foram girados para baixo em 200g, 4 ° C por 5 minutos. </li><li> Vortex da BD partículas Imag estreptavidina bem, junta-partículas 40μl para cada 10 milhões de células. Mix da partícula com as células marcadas bem e incubar as células em 6 ~ 12 ° C por 30 minutos. Isto permite que as partículas de estreptavidina para vincular ao biotinilado anti-CD54 e anti-CD90, que é ligado às proteínas de superfície CD54 e CD90, respectivamente. </li><li> Durante o tempo de incubação, rotular um tubo de ensaio de fundo redondo para coletar a fração positiva. Após a incubação, reduzir o volume de rotulagem para 20 milhões de células / ml com tampão 1X Imag BD e transferência de células marcadas para o tubo de coleta fração positiva. Coloque o tubo a fração positiva para o IMagnet BD e deixe ficar durante 6 minutos, em seguida, remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro com tubo a fração positiva ainda na IMagnet BD. </li><li> Retire o tubo fração positiva do IMagnet BD e colocá-lo no gelo. Adicionar 1 ml gelada 1X tampão BD Imag e células ressuspender pela mistura suave. Colocar o tubo de volta para o IMagnet BD e deixá-lo ficar para 2 a 4 minutos. Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro novo. Repita a lavagem como descrito em 2.5 mais uma vez. </li><li> Remova o tubo do IMagnet BD e células ressuspender em meio de cultura, uma semente 75 centímetros 2 recipiente para manter as células e um prato de 10 centímetros de citometria de fluxo. </li></ol> 3. Verificação de Expressão marcador de superfície por citometria de fluxo Citometria de fluxo foi realizada para verificar as células obtivemos expressar CD54 e CD90. O HSC marcador CD45 foi usada para confirmar que as CTMs foram esgotados de HSCs. <ol><li> Quando as células se tornam confluentes ~ 80%, trypsinize células com tripsina-EDTA e recolher as células em um tubo de 15ml. Centrifugar a 200 g, 4 ° C por 5 minutos para coletar as células. </li><li> Aspirar o sobrenadante e foih com células 1X D-PBS uma vez. Ressuspender as células em tampão de coloração celular (1X D-PBS contendo 2% de SFB e azida sódica 0,05%) para uma concentração final de 5 ~ 10 milhões de células / ml e manter as células no gelo. Alíquota de 100μl suspensão de células em seis tubos rotulados (1 apenas as células; 2. Isotipo IgG2a controle;.. 3 para controlo do isotipo IgG1, 4 CD45; 5. CD54;.. 6 CD90). </li><li> Adicionar controles isotipo e anticorpos primários em concentrações apropriadas (IgG2a e IgG1: 20μl por milhão de células, CD45: 0.5μg por milhão de células, CD54: 0.25μg por milhão de células, CD90: 0.15μg por milhão de células) e incubar a 4 ° C para 30 minutos. </li><li> Lavar as células com 1X D-PBS duas vezes e, em seguida, as células ressuspender em tampão 100μl de células coloração. Adicionar SA-PE (estreptavidina-ficoeritrina, use 0.15μg por milhão de células) e incubar a 4 ° C por 30 minutos no escuro. </li><li> Lave as células marcadas com 1X D-PBS duas vezes. Ressuspender as células em tampão 400μl de células de coloração e transferir para um tubo falcon para análise de citometria de fluxo. </li></ol> 4. Separação da colônia Único Derivado MSCs MSCs é uma população heterogênea composta por diferentes subpopulações de células com formato diferente, a taxa de crescimento, bem como capacidade de diferenciação 6. No entanto, todas as sub-populações de expressar os marcadores MSC conhecida e, portanto, não é viável a utilização de marcadores para separar estas subpopulações. Por isso, aplicou-se cilindros de clonagem para separar os diferentes subpopulações, que são colônias formadas por células individuais. <ol><li> Células placa em cerca de 50 ~ 100 células por prato de 10cm. Incubar a 37 ° C e 5% incubadora de CO 2 para 1 a 2 semanas. Durante este período, examine colônias bem isoladas com um microscópio invertido. Uma vez que as colônias tenham atingido o tamanho suficientemente grande (melhor mais de 100 células em cada colônia), marca as colônias com uma sharpie no fundo do prato. Quando escolher a colônia a ser marcado, certifique-se que não há colônias vizinhas perto o escolhido. </li><li> Aspirar médio e lave o prato uma vez com 1X D-PBS. Pegue um cilindro clonagem estéril com uma pinça estéril e delicadamente colocá-lo em torno da colônia marcada. Repita este procedimento até todas as colônias marcado tem um cilindro colocado sobre clonagem. As colônias escolhidas devem ser longe uns dos outros, tais que cada cilindro clonagem contém apenas uma colônia. </li><li> Adicionar 100μl de tripsina-EDTA para cada cilindro de clonagem e colocar o prato de volta para a incubadora de ~ 5 minutos. Após 5 minutos, verifique as células ao microscópio para ver se eles estão de arredondamento para cima. Quando as células têm levantado, adicionar igual quantidade de meio de cultura para inativar a tripsina. Misture a suspensão celular com uma micropipeta 200μl e transferir a suspensão celular a um prato 60 milímetros contendo 3ml meio de cultura pré-aquecido. Rotular os pratos corretamente e colocá-los de volta para a incubadora. Controle de alterações morfológicas sobre os próximos dias. </li></ol> 5. Resultados representante De acordo com o protocolo descrito na parte de rato isolamento MSCs, plástico MSCs aderente deve ser visível no dia seguinte após o plaqueamento. Como as células continuam a proliferar as células confluentes deve se parecer com as células mostrado na Figura 1A. Quando as células atingem a 80% confluência (Figura 1B), subcultura pode ser realizada. Durante a subcultura, tripsina-EDTA foi usado para separar as células e células levantou são pequenos e redondos, como mostrado na Figura 1C. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Imagens de contraste de fase de rato MSCs. (A) Confluent MSCs. A maioria das células são fusiformes ou estrela-like. (B) MSCs cerca de 80% confluência. (C) células Lifted após tripsinização são pequenas e redondas. Uma vez que as CTMs são enriquecidos por separação de células magnética, análise de citometria de fluxo é realizada para verificar as expressões marcador de superfície. Se o enriquecimento é bom, as células devem mostrar coloração positiva contra os marcadores CD54 e CD90 MSC, mas negativa contra o marcador CD45 HSC (Figura 2). Isotipo IgG2a e IgG1 controles são utilizados como controles negativos. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análise de citometria de fluxo de MSCs de marcadores de superfície. MSCs foram marcadas com anticorpos contra IgG2a (isotipo controle 1), IgG1 (isotipo controle 2), CD45, CD54 e CD90. MSCs expressa CD54 e CD90, mas não CD45. Quando as células são semeadas em densidade adequada clonal, as colônias devem subir a partir de células individuais. Figura 3A representa uma colônia formada por uma única célula. Cilindros de clonagem pode ser usado para separar as colônias e células derivadas das colônias podem ser cultivadas separadamente. Figura 3B e 3C representa células derivadas de duas colônias individual. A colônia de células derivadas de um eixo como são (Figura 3B), enquanto que as células derivadas de colônia dois são redondos (Figura 3C). <pclass src="/files/ftp_upload/1852/1852fig3.jpg" alt="Figura 3"></pclass> Figura 3. Formação de colônias e colônia de CTMs-single células derivadas. MSCs cultivadas em clonal densidade de colônias individuais formulário. Estas colônias podem ser separados por cilindros de clonagem e células de diferentes colônias podem ser cultivadas separadamente. (A) Uma colônia representativa formada por MSCs quando plaqueadas na densidade clonal. (B) Spindle-como células derivadas de uma colônia. (C) células Rodada derivada de outra colônia.

<ol><li>de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+glial+glutamate+transporters+in+adult+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells.</a> J Neurochem. 91, 155-166 (2004).</li>
<li>Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dexamethasone+withdrawal+on+osteoblastic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells.</a> J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).</li>
<li>Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells%3A+from+basic+biology+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.</a> Gene Ther. 15, 109-116 (2008).</li>
<li>Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krause+Plasticity+of+marrow-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Krause Plasticity of marrow-derived stem cells.</a> Blood. 102, 3483-3493 (2003).</li>
<li>Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+rapidly+self-renewing+and+multipotential+adult+stem+cells+in+colonies+of+human+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).</li>
</ol>

Este protocolo descreve como isolar e enriquecer MSCs. Um método para separar as células-colônia única derivada é também incorporada. Há várias etapas que são importantes para uma separação de enriquecimento, isolamento e colônia de sucesso. Ao fazer o isolamento de células de rato, recomenda-se filtro através de um filtro de célula ou uma malha de nylon estéril de tamanho similar para se livrar dos coágulos de sangue e restos de ossos. Após o plaqueamento das células durante a noite, muitas células mortas estará flutua...

<table><tbody><tr><td>1X D-PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Filtro celular</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Estrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Ímã BD</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a de camundongo biotinilada</td><td>BD Biosciences</td><td>555572</td><td></td></tr><tr><td>IgG1 de camundongo biotinilada</td><td>BD Biosciences</td><td>555747</td><td></td></tr><tr><td>CD54 de rato anti-biotina</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL054B</td><td></td></tr><tr><td>CD90 de rato anti-biotina</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL005B</td><td></td></tr><tr><td>CD45 de rato anti-biotina</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL001B</td><td></td></tr><tr><td>Tampão BD Imag</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Partículas de estreptavidina</td><td>BD Biosciences</td><td>557812</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>F0040</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de clonagem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2059</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e enriquecimento de células-tronco mesenquimais rat (msc) e separação de-colônia Único derivado mscs

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs são uma população de células-tronco adultas, que é uma fonte promissora para aplicações terapêuticas. Estas células podem ser isoladas a partir da medula óssea e podem ser facilmente separadas as células-tronco hematopoéticas (HSCs), devido à sua adesão plástico. Este protocolo descreve como isolar as CTMs do fémur ea tíbia de ratos. As células foram isoladas enriquecido contra dois marcadores de superfície CD54 e CD90 MSCs por separação de células magnéticas. Expressão de marcadores de superfície CD54 e CD90 foram então confirmadas por análise de citometria de fluxo. HSC marcador CD45 também foi incluído para verificar se as CTMs foram classificadas esgotado de HSCs. MSCs são naturalmente bastante heterogênea. Existem subpopulações de células que têm formas diferentes de proliferação, diferenciação e habilidades. Estas subpopulações todos expressam os marcadores conhecidos MSCs e nenhum marcador único ainda não foi identificado para o sub-populações diferentes. Portanto, uma abordagem alternativa para separar as diferentes subpopulações está usando cilindros de clonagem para separar as colônias de células derivadas única. As células derivadas de colônias de um único podem ser cultivadas e avaliados separadamente.

Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.

Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

As MSCs são uma população de células-tronco adultas que representa uma fonte promissora para aplicações terapêuticas. Estas células podem ser isoladas da medula óssea e...

Células-tronco mesenquimais, abreviadas como CSMs, são isoladas de uma rata fêmea de brinquedo de pano com idade entre seis e oito semanas e cultivadas em uma placa de Petri de 10 centímetros até atingirem cerca de 80% de confluência. Para enriquecer as CSMs, as células são marcadas com anticorpos primários conjugados à biotina, seguidos por microesferas magnéticas conjugadas à estreptavidina. As células marcadas são então separadas em duas frações, a fração negativa e a fração positiva, por meio de separação magnética ativada de células.Posteriormente, a análise por citometria de fluxo é utilizada para confirmar a expressão dos marcadores de superfície. Por fim, cilindros de clonagem são usados para obter MSCs derivadas de colônia única. Olá, sou Lee do laboratório de Christina Chang do Departamento de Engenharia Química e Ciência dos Materiais da Universidade Estadual de Michigan.Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento e enriquecimento de células-tronco quiméricas, bem como para a obtenção de células derivadas de colônia única. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os comportamentos de proliferação e diferenciação de células-tronco vermelhas. Então, vamos começar.Células-tronco mesenquimais ou CSMs serão isoladas de uma rata fêmea Sprague-Dawley com seis a oito semanas de idade. Para iniciar este procedimento, remova os fêmures e tíbias das patas traseiras do animal eutanasiado. Retire a pele e os músculos, coloque os fêmures e tíbias dissecados em isopropanol 70% por alguns segundos e, em seguida, transfira-os para um X-D-P-B-S.Os seguintes passos devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica. Primeiro, transfira o fêmur e a tíbia para uma placa de 10 centímetros contendo DMEM. Em seguida, enquanto segura cada osso com pinças, corte as duas extremidades com tesoura.Acople uma agulha de calibre 22 a uma seringa de três mililitros e preencha-a com DMEM. Insira a agulha em uma das extremidades abertas do osso e lave a medula para um tubo de 50 mililitros. Repita duas a três vezes para cada osso, até que toda a medula tenha sido obtida.Resuspenda as células, depois passe a suspensão celular por uma peneira de células de 70 micrômetros para remover detritos ósseos e agregados sanguíneos. Centrifugue as células a 200 ×g a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Após remover o sobrenatante por aspiração, ressuspenda as células em 25 mililitros de meio para semeadura de CMM.10 mililitros de suspensão celular em cada um de dois pratos de cultura de 10 centímetros. Incubar os pratos de cultura em uma estufa com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma a duas semanas. Assim que os MSCs de rato previamente isolados atingirem uma confluência de aproximadamente 80%, aspirar o meio e adicionar quatro a cinco mililitros de tripsina EDTA a cada prato.Retorne as placas ao incubador e incube por cerca de cinco minutos. Para permitir a dessanexação celular, adicione uma quantidade igual de meio de cultura para inativar a tripsina. Colete as suspensões celulares em um tubo de 15 mililitros e centrifugue as células a 200 ×g, a 4 °C, por cinco minutos.Agora demonstraremos o enriquecimento de MSCs por meio de dois marcadores de superfície, CD54 e CD90. Utilizando o ímã de separação celular BD I da BD Biosciences, comece ressuspendendo o pellet celular no tampão de marcação celular a 20 milhões de células por mililitro.Em seguida, adicione o anticorpo biotinilado CD54 e o anticorpo biotinilado CD90 à suspensão celular e, após incubação no gelo por 15 minutos, misture suavemente. Lave as células marcadas com um volume em excesso de tampão BD IMAG 1X. Centrifugue as células marcadas a 200 ×g e 4 °C durante cinco minutos. Prepare as partículas de estreptavidina BD IMAG agitando-as vigorosamente em vórtex e, em seguida, adicione 40 microlitros de partículas para cada 10 milhões de células.Misture bem as partículas com as células marcadas e incube as células a seis a 12 graus Celsius por 30 minutos. Durante esse período de incubação, rotule um tubo de ensaio cônico para coletar a fração positiva. Ao final da incubação, ajuste o volume de marcação para 20 milhões de células por mililitro.Com um tampão Expedia I mag. Transfira as células marcadas para o tubo de coleta da fração positiva. Coloque o tubo da fração positiva no ímã BDI e deixe por seis minutos.Em seguida, com o tubo da fração positiva ainda no ímã BDI, remova o sobrenatante com uma pipeta de vidro Pasteur. A seguir, retire o tubo da fração positiva do ímã BDI e coloque-o no gelo. Adicione um mililitro de tampão BDI mag 1X gelado e ressuspenda as células com mistura suave.Coloque o tubo novamente no ímã BDI e deixe-o por dois a quatro minutos. Remova o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur nova. Repita a lavagem conforme descrito anteriormente.Mais uma vez. Por fim, remova o sobrenadante com uma nova pipeta de vidro Pasteur. Em seguida, retire o tubo do ímã BDI reus.Suspenda as células em um mililitro de meio de cultura e transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros contendo 25 mililitros de meio semente. Um frasco quadrado de 175 centímetros quadrados para manutenção das células e uma placa de 10 centímetros para citometria de fluxo.Para iniciar o procedimento de separação de MSCs derivadas de colônia única, plaque as células em aproximadamente 50 a 100 células por placa de 10 centímetros e incube em estufa a 37 °C e 5% de dióxido de carbono por um a duas semanas. Durante esse período de uma a duas semanas, examine colônias bem isoladas com um microscópio invertido. Assim que as colônias atingirem um tamanho suficiente, com mais de 100 células em cada colônia, marque-as com uma caneta permanente na parte inferior da placa.Ao escolher uma colônia para ser marcada, certifique-se de que não haja colônias próximas nas proximidades. Aspire o meio e lave a placa uma vez com X-D-P-B-S usando pinças. Pegue um cilindro de clonagem estéril e coloque-o suavemente ao redor da colônia marcada.Repita isso até que cada colônia marcada tenha um cilindro de clonagem posicionado sobre ela. Adicione 100 microlitros de tripsina EDTA a cada cilindro de clonagem e retorne a placa ao incubador. Após cinco minutos, verifique as células ao microscópio para observar se estão se arredondando.Quando as células se destacarem, adicione uma quantidade igual de meio de cultura para inativar a tripsina. Misture a suspensão celular com uma micropipeta de 200 microlitros e transfira a suspensão celular para uma placa de 60 milímetros contendo três mililitros de meio de cultura pré-aquecido. Rotule as placas e devolva-as ao incubador Bader, após o isolamento em plástico aderente.As CMMs devem ser visíveis no dia seguinte após o plaqueamento. À medida que as células continuam a proliferar, as células confluentes devem apresentar-se semelhantes às células mostradas nesta imagem de contraste de fase, nas quais a maioria possui aspecto fusiforme ou estrelado; o cultivo é apropriado quando as células atingem cerca de 80% de confluência.Após a tripsinização, as células destacadas devem parecer arredondadas e flutuando no meio. Uma vez que as MSCs são enriquecidas por triagem celular magnética, a citometria de fluxo é realizada para verificar as expressões dos marcadores de superfície. Se o enriquecimento for bom, as células devem apresentar coloração positiva para os marcadores de MSCs, CD54 e CD90, mas negativa para o marcador de HSC CD45; controles isotípicos IgG2a e IgG1 são utilizados como controles negativos.Quando as células são semeadas em uma densidade clonal adequada, colônias devem surgir a partir de células individuais, conforme mostrado neste exemplo. Cilindros de clonagem podem então ser usados para separar as colônias, e as células derivadas dessas colônias podem ser cultivadas separadamente. Nestes dois exemplos, as células derivadas de uma colônia são alongadas, enquanto as células derivadas de outra colônia são arredondadas.Portanto, mostramos a você como isolar e enriquecer células-tronco comuns e aleatórias, bem como como obter células derivadas de colônia única. Durante este procedimento, é importante lembrar-se de remover os coágulos sanguíneos e os detritos ósseos durante a isolamento. Utilize a quantidade ideal de anticorpo durante o enriquecimento e marque cuidadosamente as colônias bem isoladas durante a separação das colônias.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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Este artigo apresenta um método que combina a adesão total da medula óssea e a classificação da citometria de fluxo para isolar, cultivar, classificar e identificar células-tronco mesenquimais de medula óssea a partir de mandíbulas de ratos.

Isolamento e Cultivo de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea Mandibular em Ratos

Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser uma fonte potencial de MSCs que se diferenciam em células produtoras de insulina (IPCs). Neste protocolo, fornecemos passos detalhados para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs epidímicas de ratos, seguidos de um protocolo simples e curto para a geração de IPCs a partir dos mesmos Ad-MSCs de ratos.

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo de rato para diferenciação em células produtoras de insulina

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula têm funções significativas em diversas diferenciações, auto-renovação e modulação imunológica. Eles surgiram como um reservatório crucial de células precursoras em terapia genética, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um método único para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula em ratos.

Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato

O presente protocolo descreve um método econômico para purificar, expandir e caracterizar células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) altamente homogêneas de camundongos. Essa abordagem facilita a aquisição de grandes quantidades de BMSCs com alto potencial de proliferação e diferenciação, apoiando modelos de camundongos e avançando na pesquisa pré-clínica.

Purificação, expansão e fenotipagem baseada em citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais da medula óssea derivadas de camundongos

Aprenda a isolar e enriquecer células-tronco mesenquimais de ratos usando separação magnética e citometria de fluxo. Este método permite obter colônias únicas para estudos de biologia celular.

Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

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