Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris

O protocolo a seguir descreve a expressão proteica utilizando o opus de levedura metilotrófica. São apresentados o preparo de células de levedura eletrocompetentes e a transformação do vetor contendo o gene de interesse em PPAs, seguidos da etapa de purificação de DNA de levedura para verificar a integração adequada do seu gene de interesse no genoma da levedura. Ao final, realizaremos a expressão da proteína recombinante.

Olá, sou Maria do laboratório de Steven Hallam do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Sou Marcus, também do Helm Lab. Hoje vamos mostrar um procedimento para expressar proteínas recombinantes no levedo TRO PQ.Past stories.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar proteínas de microrganismos não catalogados, dos quais o DNA ambiental foi extraído, arquivado e bibliotecado metaatomicamente. Então, vamos começar. A expressão de proteínas recombinantes na levedura metilotrófica Pichia pastoris requer a clonagem do seu gene de interesse em quadro de leitura em um vetor do tipo PPA.

No nosso experimento, utilizamos o vetor PPIC Z alpha A. Este vetor contém o promotor AO X um para expressão regulada de forma rigorosa induzida por metanol do gene de interesse, o sinal secretor do fator alfa para secreção da proteína recombinante, zaas e um gene de resistência para seleção em ambas as bactérias E. coli e Pichia pastoris, além de um peptídeo na extremidade C-terminal contendo um epítopo acêmico e uma etiqueta de poli-histidina para detecção e purificação da proteína recombinante. Antes da transformação, linearize o vetor contendo o seu gene de interesse por digestão com enzima de restrição. Utilizamos a enzima PME um, mas outros sítios de restrição são possíveis, desde que a sua inserção não contenha aquele sítio de restrição.

Para obter quantidade suficiente de DNA vetorial linearizado, monte três a quatro reações de digestão com restrição de 50 microlitros em tubos separados; após a digestão, combine todas as soluções e concentre seu construto. Utilizando uma unidade de filtro centrífugo AmCon e uma unidade de filtro centrífugo MicroCon, serão necessários cinco a 20 microgramas de DNA linearizado em cinco a 10 microlitros de água estéril para a transformação em PPA dous. Para preparar PPA dous eletrocompetente, plaque as células em placa A-Y-P-D-S sem SN quatro dias antes da transformação prevista, e cultive a 30 graus Celsius por um a dois dias ou até a formação de colônias isoladas dois dias antes da transformação.

Cultive cinco mililitros do PPA ou cepa em meio YPD em um tubo Falcon de 50 mililitros a 30 graus Celsius durante a noite. Coloque o tubo Falcon em um frasco para fixá-lo no agitador um dia antes da transformação. Use 0,25 mililitros da cultura noturna para inocular 500 mililitros de meio YPD fresco em um frasco de dois litros.

Cultive novamente durante a noite em agitador a 30 graus Celsius até atingir uma DO 600 de 1,3 a 1,5. No dia da transformação, tenha em mãos gelo, água estéril fria e sorbitol a um molar. Centrifugue as células a 1500 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, suspendemos o pellet em 500 mililitros de água estéril, fria e com gelo. Dependendo da capacidade dos tubos de centrífuga, pode ser necessário dividir o volume em dois tubos separados ou realizar múltiplas centrifugações. Centrifugue as células novamente e re-suspenda o pellet em 250 mililitros de água estéril, fria e com gelo.

Dependendo da capacidade dos tubos de centrífuga, é possível combinar os pellets celulares separados em um único tubo. Ao ressuspender o pellet após a centrífuga, desta vez ressuspenda completamente as células. Em 20 mililitros de sorbitol gelado a um molar, transfira as células ressuspensas para um tubo falcon de 50 mililitros e realize a centrifugação.

Após uma centrifugação final, ressuspenda o pellet em um mililitro de sorbitol a uma molaridade de um, gelado, até um volume final de aproximadamente 1,5 mililitro. Armazene as células ressuspendidas em tubos de microcentrífuga em gelo ou a quatro graus Celsius até que sejam utilizadas para transformação. Antes da transformação do construto linearizado concentrado em células PPA stor, prepare os seguintes reagentes e dispositivos.

Encha um tubo de microcentrífuga com um mililitro de sorbitol um molar e coloque-o no gelo. Coloque uma eletroporação de 0,2 centímetro no gelo.

Rotule um tubo de vidro estéril de 15 mililitros e tenha à mão uma pipeta de vidro estéril. Transfira 80 microlitros das células eletrocompetentes previamente preparadas para o vete de eletroporação de ponto dois centímetros gelado.

Adicione a solução de DNA plasmidial às células e misture movendo a ponta do pipetador de um lado para o outro. No vete de eletroporação. Incube o vete com as células em gelo por cinco minutos.

Em seguida, limpe a parte externa do vete com o tecido e aplique um pulso elétrico às células de acordo com os parâmetros para levedura brotante, conforme sugerido pelo fabricante do seu dispositivo específico de eletroporação. Um gene Pulser da BioRad é utilizado nesta demonstração com as seguintes condições: tensão de carregamento de 1500 volts, capacitância de 25 microfarads e resistência de 200 ohms imediatamente após o pulso.

Adicione um mililitro de sorbitol gelado e um molar ao vet. Transfira o conteúdo do vet para um tubo estéril de 15 mililitros utilizando uma pipeta de vidro estéril. Incube o tubo a 30 graus Celsius sem agitação por 1,5 hora.

Após 1,5 hora, as células eletroporadas estão prontas para serem semeadas. Adicione de cinco a dez esferas de vidro esterilizadas a cada uma das quatro placas YPTS rotuladas contendo 100 microgramas por mililitro de Zain. Espalhe 250 microlitros da eletroporação.

Agite suavemente em cada placa e movimente a placa horizontalmente para distribuir as células uniformemente. Deixe as placas secarem por 15 minutos e, em seguida, remova as esferas da agro invertendo as placas. Envolva as placas em plástico preto para evitar a degradação do Zain sensível à luz e incube as placas de cabeça para baixo por dois a três dias a 30 graus Celsius até a formação de colônias, após o surgimento das colônias.

Escolha 12 colônias. Purifique-as por esgotamento, repicando os clones em placas de YPDS frescas contendo 100 microgramas por mililitro de zeína. Para preparar as células PPA para expressão proteica, escolha uma única colônia das colônias purificadas de Pichia e inócula em 25 mililitros de meio VMGY em um frasco estéril de 250 mililitros, cultivando a 30 graus Celsius em um incubador com agitação até que a cultura atinja uma OD 600 entre dois e seis.

Quando as células atingirem a OD 600 apropriada, prepare um estoque glicerinado das células para armazenamento. Transfira 800 microlitros da cultura celular para um tubo criogênico de dois mililitros e adicione 200 microlitros de glicerol esterilizado. Armazene o estoque glicerinado a menos 80 graus Celsius.

Além disso, transfira 1,5 mililitros da cultura celular para um tubo de microcentrífuga. Recolha as células por centrifugação a 1300 ×g durante um minuto à temperatura ambiente. Armazene o pellet a quatro graus Celsius.

Essas células serão usadas para purificação de DNA de levedura a fim de analisar a Pichia Irans após PCR com primers específicos para o inserto em um gel groose para confirmar que o gene de interesse foi integrado ao genoma da Pichia. Transfira o restante da cultura de 25 mililitros para um tubo Falcon de 50 mililitros e recolha as células por centrifugação a 3000 Gs durante cinco minutos à temperatura ambiente. Decante o sobrenadante e coloque o tubo de cabeça para baixo sobre um papel absorvente para remover qualquer meio residual, lavando o pellet celular resus. Suspenda-o por vortex ou pipetando para cima e para baixo em 20 mililitros de meio BMMY e centrifugue.

Novamente após a decantação, ressuspenda o pellet celular em BMMY com agitação por vortex ou pipetagem para cima e para baixo até atingir uma DO 600 de 1,0. Meio para induzir a expressão. Transfira a cultura para um frasco erlenmeyer de um litro com chapas defletoras e cubra o frasco com um bafômetro de 200 mililitros.

Recomendamos fortemente o uso de frascos com barbatanas, pois eles introduzem mais oxigênio no cultivo. Para expressão proteica eficiente durante a indução com metanol, incube o frasco no incubador para continuar o crescimento a 30 graus Celsius. É importante que a temperatura não ultrapasse 30 graus Celsius, caso a temperatura do seu incubador varie.

Regule a temperatura em 28 graus Celsius. Adicione metanol puro esterilizado até uma concentração final de 0,5% de metanol a cada 24 horas para manter a indução em pontos de tempo específicos após o início da expressão, transfira um mililitro da cultura para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue a 1300 Gs durante 2,5 minutos. À temperatura ambiente, transfira o sobrenadante para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro separado.

Armazene o sobrenadante e os pellets celulares a menos 80 graus Celsius até a análise posterior. As amostras de diferentes pontos temporais serão analisadas para estabelecer o período ótimo de expressão proteica após a indução. Agora apresentamos alguns resultados representativos da expressão bem-sucedida de proteínas recombinantes utilizando o PIA Pastis como sistema hospedeiro.

Esta imagem de blot ocidental mostra quatro proteínas expressas após 24 horas de expressão. O anticorpo utilizado para o blot imunológico foi o anticorpo HRP acêmico. A segunda linha é um controle negativo e recebeu sobrenadante de células que não expressam a proteína recombinante, pois foram transformadas com o vetor original.

Acabamos de mostrar como expressar proteínas recombinantes utilizando o hospedeiro eucariótico PQ.Plus. Ao realizar este procedimento, é importante que seu construto seja sequenciado para confirmar que seu gene de interesse está clonado e em quadro de leitura, e que todos os seus meios e reagentes estejam prontos antes de iniciar. Também é fundamental preparar uma quantidade suficiente de plasmídeo linearizado para obter um alto número de transformantes antes da expressão proteica por indução com metanol. Certifique-se de lavar bem suas células para remover quaisquer vestígios remanescentes de glicerol que possam inibir a expressão da sua proteína.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com os experimentos.