Name: Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a fertilização de oócitos Xenopus pelo método de transferência do host. Este procedimento envolve isolamento, maturação com progesterona e transferência cirúrgica para estudos de biologia do desenvolvimento.

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Os autores gostariam de agradecer os membros do laboratório de Houston para a leitura crítica do manuscrito. Pesquisa é apoiada pelo National Institutes of Health (GM083999) concedido a DWH

1. Remoção cirúrgica do tecido do ovário <ol class="lalpha"><li> Prepare um novo lote de meio de cultura de oócitos (OCM; Materials), entre 400-800 mL, dependendo do tamanho do experimento. Ajustar o pH a 7,6-7,8, até que o vermelho de fenol tem uma cor vermelho escuro (seis ou mais pequenas gotas de 5N NaOH). Derramar uma pequena quantidade para verificar o pH em um tubo separado desde o eletrodo de pH pode contaminar os meios de comunicação. OCM deve ser armazenado a 18 ° C e utilizada dentro de uma semana. </li><li> Selecione 3-5 fêmeas e um lugar em ~ 2L solução anestésica buffered (Materiais). Tentamos evitar o uso de rãs que foram alimentadas no dia ou antes da cirurgia. Enquanto o sapo é sucumbir ao anestésico, desinfetar a área cirúrgica com EtOH 70% e preparar os instrumentos cirúrgicos. </li><li> Esterilizar os instrumentos cirúrgicos por 20 segundos de imersão em um esterilizador quente talão a 250 ° C. Os seguintes instrumentos devem estar na mão: lidar com bisturi (# 3) e lâmina (# 10 ou 11), vários pares de fórceps Dumont, íris Bonn tesouras (curvo ou reto), Halsey ou Olsen-Hegar porta-agulha micro, e suturas. Coloque instrumentos esterilizados em uma placa de Petri estéril ou no interior da embalagem de sutura para manter estéril. Segure a agulha no suporte da agulha na orientação desejada antes de começar. Nós preferimos titulares Olsen-Hegar agulha desde a alça contém lâminas da tesoura, que pode ser usado para cortar suturas sem instrumentos de comutação. </li><li> Após 10 minutos, verificar se um plano cirúrgico de anestesia foi alcançado. Rãs anestesiados vai parar de se mover e não responder a uma pitada dedo do pé ou sendo entregues. Anestesia deve durar 15 minutos, que é tempo mais que suficiente para realizar as operações. Don traje cirúrgico adequado. Isso pode incluir luvas limpas (não-látex), jalecos de laboratório, e máscaras cirúrgicas, dependendo da preferência pessoal e diretrizes de atendimento institucional animal. </li><li> Nota sobre a técnica asséptica: secreções da pele da rã contém peptídeos antimicrobianos, que geralmente reduzir a incidência de contaminação durante a cirurgia, apesar de uma técnica asséptica deve ser seguido, tanto quanto possível. Campos cirúrgicos podem ser usados, mas não pode ser exigido por IACUCs institucional e não pode fornecer muito benefício. Geralmente &quot;técnica de ponta&quot; utilizado, onde as mãos se tocam as pontas estéril do material de sutura instrumentos, ou local da incisão. Instrumentos podem ser reesterilizado (no esterilizador bead) após a incisão da pele, e uma área estéril deve ser mantido na bancada para a colocação de instrumentos (como uma placa de Petri ou pacote de sutura). Requisitos institucionais podem diferir significativamente, então por favor, seguir as orientações suas instituições &quot;e receber instruções apropriadas antes de cirurgias desempenho. </li><li> Remova o sapo de anestésico local e em decúbito dorsal em uma cirurgia úmido wipe. Nota. A pele podem ser limpos por lavagem de iodo povidine diluído (1:20) ou clorexidina (0,75%). No entanto, evite comercial esfrega cirúrgico, sabonetes e 70% de álcool isopropílico, que podem danificar a delicada pele de anfíbios. </li><li> Usando uma tesoura pequena bisturi ou íris, fazer uma (1-1,5 cm) pequena incisão na pele na parte inferior do abdômen, lateral à linha média. Incisões posteriores sobre o sapo mesma deve ser realizada em lados alternados, bem espaçadas umas das outras. Incisões podem ser feitas em paralelo ou perpendicular à linha média. </li><li> Fazer incisões na pele e músculo abdominal em duas etapas. Depois de cortar a pele, levante a camada muscular e ao redor fascia de cor branca com uma pinça e fazer a incisão no músculo levantadas. Use uma tesoura e corte reto para baixo, tentar fazer um corte rápido para expor a cavidade do corpo deixando bordas da ferida limpa. Se apenas a fascia é cortado, ele será recolhido e vai fazer sutura mais difícil. Levantar o músculo irá ajudar a evitar inadvertidamente ferir qualquer dos órgãos internos. Além disso, tentar evitar o corte através de qualquer corações linfáticos ou vasos sangüíneos visíveis dentro das camadas musculares. Estender o comprimento com a tesoura da incisão, para que o ovário pode ser facilmente puxado através. </li><li> Ovário devem ser claramente visíveis uma vez que a incisão é feita. Para adquirir o ovário, segure com uma pinça e exteriorizar o tecido do ovário. A quantidade desejada de tecido é removido e cortado fora no nível da parede do corpo. Não encha o tecido de volta para dentro da cavidade celomática, como isso poderia ser uma fonte de infecção ou outras complicações. </li><li> Imediatamente observar um pequeno pedaço de ovário sob um microscópio de dissecação e um oócitos defolliculate alguns para testar sua qualidade. Eles devem ser firmes e de tamanho uniforme e coloração. Se eles são aceitáveis, retire a quantidade desejada de tecido de ovário e sutura da incisão. Suficiente para encher uma placa de Petri 90 milímetros é geralmente suficiente para a maioria dos experimentos. Se os ovócitos são de qualidade questionável, sutura o sapo e repita com uma mulher diferente. </li><li> Fechar a incisão com sutura da fascia muscular e camada de primeira. Insira o n<html> eedle alguns milímetros lateralmente à incisão, certificando-se de passagem através da camada de fáscia também. Suturas apenas através do músculo pode rasgar o tecido e se soltar. Use uma pinça para ajudar a inserir a agulha de baixo para cima no lado oposto da incisão. Liberação e re-entender a agulha de fora do corpo e puxe o fio através de até vários centímetros, mais ou menos da cauda permanece, tomando cuidado para não puxá-lo todo o caminho. </li><li> Fechar a ferida com um padrão simples interrompido de sutura. Usamos um empate instrumento básico para fazer nós quadrados cirurgião (nós reef). Ciclo final longo da sutura em torno do suporte da agulha, segure a cauda e puxe-o através do loop para você e aperte. Laço e puxe através de novo, desta vez puxe o suporte da agulha para longe de você. Um lance terceiro pode ser usado para aumentar a segurança (na mesma direção que o primeiro). Guarnição da sutura, deixando cauda curta e fazer outra sutura no músculo alguns milímetros de distância. Dois pontos são suficientes para pequenas suturas, três para os maiores. Repita o procedimento para a camada de pele. Demonstrações em vídeo de técnica de sutura básicas estão disponíveis no YouTube - procurar por &quot;tie instrumento&quot;, há muito poucos para escolher, embora a técnica básica é a mesma. </li><li> Enxaguar a fêmea com água deionizada e colocá-la em um balde cheio de recuperação cool (18 ° C) de água. Enquanto no laboratório, os sapos são mantidos em água de torneira tratada com Amquel para remover cloraminas. A cada poucos minutos, levante cuidadosamente o sapo da água e olhar para engolir ou olhos esbugalhados movimentos, indicativo de recuperação da anestesia. </li><li> Nota: A cirurgia de sobrevivência não é estritamente necessário para a obtenção de tecido do ovário, embora as fêmeas continuarão a produzir ovócitos depois de um bom número de operações. Realizar a cirurgia de sobrevivência também vai reduzir o número de animais utilizados. Certifique-se de seguir as diretrizes da unidade de cuidados dos animais nos métodos de sobrevivência vertebrados cirurgia, cuidados pós-operatório e monitoramento e para o número de cirurgias permitido em um indivíduo. </li></ol> 2. Cultura e Oócitos Defolliculating <ol class="lalpha"><li> Logo após a cirurgia terminar, subdividir o ovário em pedaços pequenos (~ 2 cm 2) e armazenar em OCM fresca, usando 5-6 peças por 90 prato mm. Lóbulos individuais de ovário são cortados, achatada e corte em pedaços quadrados. Estes são lavados no OCM limpo e colocado em pratos de cultura. Achatamento e dividindo-se o ovário irá prolongar a sua vida na cultura e fazer defolliculation mais fácil. </li><li> Mover um lobo a um pequeno prato de OCM e manualmente defolliculate 300-500 oócitos. Ovócitos transferência usando um estéril, pipeta-fogo polido. Nós descobrimos que o uso da variedade de algodão-ligado é essencial para minimizar a contaminação das culturas. Armazenar os ovócitos a 18 ° C em 8 mL OCM (em pratos médio (Falcon 1007)) em grupos de 100-150. Com a prática, você deve ser capaz de defolliculate ovócitos o suficiente em 1-2 horas. Oócitos Collagenased não são adequados para transferência de host, uma vez que não são ser fertilizado. </li><li> Defolliculating método. Nós defolliculate usando relojoeiros &#39;fórceps (Dumont # 4s ou 5s #, Ferramentas Ciência Fine), seguindo os métodos básicos descritos no Smith et al., (1991). Usando um par de fórceps (em sua mão dominante), segure a theca camada de tecido conjuntivo em torno de um totalmente crescido oócito VI palco perto de onde o folículo está ligado ao ovário (o talo). Com o outro par de fórceps, segure o ovário adjacente ao primeiro par. Levemente rasgar a camada folículo, puxando todo o ovócito. Suavemente provocar o ovócito fora do tecido. Oócitos com sucesso defolliculated são floppier de oócitos simplesmente puxado para fora sem remover a camada de folículo e será desprovida de vasos sanguíneos visíveis. </li><li> Nota: É essencial para manter a pressão muito leve na ponta da pinça, apenas o suficiente para as pontas para atender. Agarrando com muita força é um comum entre os iniciantes e resultará no oócito a ser afastada com o folículo intacto. Manter um bom par de fórceps exclusivamente para defolliculating. As pontas devem atender de forma precisa e deve ser um pouco mais direto do que uma pinça para a tomada de explantes de embriões Xenopus (Figura 1). </li><li> Rotineiramente teste madura sobre 20 com progesterona e abortar o experimento se a taxa de maturação é pobre (&lt;50% após 6-7 horas à temperatura ambiente). </li><li> Neste ponto, os oócitos podem ser manipuladas e cultivadas como desejado, como microinjeção de oligo, morfolino ou mRNA. Procedimentos de injeção variam de acordo com laboratório, por isso não vamos descrever aqueles aqui. Oócitos podem ser mantidos até uma semana na OCM, mas geralmente a saúde declina por isso é melhor usá-los para transferência no prazo de 96 horas de isolamento. </li><li> Tenha em mente que apenas cinco a seis grupos (incluindo um controle) pode ser transferido para uma única fêmea, devido a limitações de corantes vitais, de modo plano seus experimentos em conformidade. </li></ol>&quot;Maturação&gt; 3. Oócitos e Estimulação de Mulheres Anfitrião Prospective <ol class="lalpha"><li> Se realizar um resgate de esgotamento oligo, injetar o seu mRNA (geralmente 5-30 pg de RNA) ~ 24-48 horas após a oligo. Os oligos terá degradadas por esta altura e não deve afetar o RNA injetado. </li><li> Na noite antes de realizar a transferência, adicionar 16 mL de solução de progesterona de trabalho (1mM em EtOH) para ovócitos em 8 mL OCM em pratos médio (concentração de progesterona final é ~ 2 mM). Incubar 10-12 horas a 18 ° C para permitir a maturação de oócitos. </li><li> Injetar 3-5 fêmeas com 1000 unidades por sapo de hCG para induzir a postura de ovos. Nossos experimentos parecem funcionar melhor se maturação de oócitos e injeção de hCG são feitas na mesma época, cerca de 12 horas antes da implantação no hospedeiro (eg, 22:00 AM -10). Deixe fêmeas em RT ou 18 ° C durante a noite. </li></ol> 4. Preparação e coloração Dye Vital de Oócitos <ol class="lalpha"><li> Na manhã da transferência, permitir ~ 45-60 &#39;para configurar e executar o procedimento. Neste ponto, oócitos maduros podem ser congelados para posterior análise da eficácia do knockdown mRNA ou a expressão da proteína. Além disso, verifique se os ovócitos não foram infectadas e que não havia uma boa taxa de maturação (&gt; 50%). Oócitos infectados não vai fertilizar. Descongelar corantes vitais (Materiais) e giram em velocidade máxima por 5 min. </li><li> Cores diferentes grupos experimentais, adicionando 80 mL do corante vital apropriado (s) para os pratos de oócitos e incubar com balanço de 15 &#39;. Durante este tempo, selecione uma fêmea hospedeira e começam a anestesia. Escolha um sapo que está lentamente a postura dos ovos normalmente ou que produz ovos abundante com espremendo leve. Ovos do hospedeiro deve ser de boa qualidade. Evite as fêmeas que estão colocando fios de ovos ou ovos esmagadas. </li><li> Transferir os ovos coloridos para um prato grande de OCM fresco, redemoinho brevemente para lavar e retirá-las antes da transferência. </li><li> Prepare uma pipeta Pasteur estéril com furo apenas larga o suficiente para acomodar um oócito (~ 1,5 mm) para uso em transplante de oócitos. Pontuação da pipeta com um lápis de diamante e quebrar limpa. Fogo polonês até que as bordas são lisas, tomando cuidado para não derreter a abertura fechada. </li></ol> 5. Realizar o transplante de oócitos <ol class="lalpha"><li> Transplante de oócitos usa os mesmos procedimentos cirúrgicos, como descrito na Parte I, embora em vez de remover ovário, óvulos manipulados são introduzidos na cavidade do corpo com uma pipeta. Idealmente, o processo de transferência deve ser realizada o mais rapidamente possível eo tamanho da incisão deve ser mantido o menor possível. </li><li> Anesthesize a fêmea hospedeira e elaboração de instrumentos cirúrgicos, como descrito na Parte I. Fazer e incisão, tal como descrito na Parte I. A incisão pode ser menor, mas precisa ser grande o suficiente para caber o furo da pipeta de transferência (Figura 2A). </li><li> Transplantar os oócitos, segure e elevar um retalho de fáscia muscular e com uma pinça e introduzir os oócitos experimental utilizando a pipeta Pasteur preparou acima. Redemoinho o prato de oócitos para coletá-los para o centro e sugar o máximo possível. Permitir que os ovócitos para resolver na extremidade da pipeta para evitar o excesso de líquido a ser introduzido e insira a ponta da pipeta na incisão e, lentamente, os oócitos permitir a gotejar para dentro da cavidade do corpo (Figura 2B). Repita até que todos os oócitos foram transferidos. Não solte a camada muscular a qualquer momento, até que começaram a sutura, ou os oócitos vai derramar da incisão. </li><li> Uma vez que os oócitos foram transferidos, segure ambos os lados da incisão com uma pinça e reuni-los, permitindo que os ovócitos para se adaptar à cavidade do corpo. Começar a sutura como descrito, tendo o cuidado de manter a tensão ascendente sobre o músculo e fáscia até o primeiro nó é amarrado (Figura 2C). Isto irá manter os oócitos de ser expulso e vai permitir que as bordas da incisão para curar uniformemente. Adicionar outro de sutura na camada muscular / fascia e sutura da pele. </li><li> Enxaguar a fêmea com água deionizada e colocá-la em um balde cheio de recuperação de resfriados (18 ° C) água Amquel-tratada. Monitorar sua recuperação da anestesia como acima. Ela deveria começar a botar ovos normalmente após a operação. </li><li> Obtenção de testículos de um sapo macho usando os procedimentos normais. Armazenar os testículos na OCM ou L15 até que seja necessário. Nós preferimos testículo fresco quando fertilização experimentos de transferência. </li></ol> 6. Fertilização de recuperação de oócitos e in vitro <ol class="lalpha"><li> Cílios peritoneal irá conduzir os ovos transferidos (e normal ovos coelomic do host) para as aberturas dos ovidutos na anterior da cavidade do corpo. Ovos coloridos podem ser recuperados início 2-3 horas após a transferência apertando normal. Os ovos podem ser obtidas a cada meia hora ou até a fêmea pára de postura. </li><li> Fertilize em uma spesuspensão rm (em ~ 4 mL 1x MMR) por 4 minutos. Flood e enxaguar bastante com 0,1 x MMR. Os ovos devem ativar normalmente e vai começar a decompor ~ 1,5-2 horas após a fertilização. Ovos transferidos, muitas vezes, unir um pouco mais tarde do que ovos do hospedeiro. </li><li> Retire as peles geléia com cisteína como embriões normais e classificar em pratos separados. Isto pode ser feito em qualquer fase, dependendo das necessidades do experimento. É normalmente mais fácil identificar as várias cores ao redor do palco de 4 células e mais difícil durante o final de estágios blástula. Cultura os ovos com uma densidade baixa (&lt;50 por prato médio) em 0,1 x MMR limpo. A partir deste ponto, os embriões podem ser tratados e manipulados normalmente. </li><li> Devolver os sapos à facilidade de animais e acompanhar de complicações ao longo dos próximos dias. </li><li> Método de fertilização suplente; postura em tampão de sal de alta <ol class="lroman"><li> Após o sapo se recuperou da anestesia, colocá-la em ~ 1L de alta-sal MMR (1.2x). Permitir que a fêmea põe ovos no buffer por cerca de 4-6 horas. Squeeze ovos restantes para fora, drenagem MMR 1.2x e classificar ovos coloridos em prato limpo, remova todo o líquido possível. </li><li> Lavar exaustivamente com MMR 0.3x e fertilizar no volume mínimo de suspensão MMR / esperma 0.3x até que os ovos activate (10 minutos). Cobrir com 0,1 x MMR e da cultura como acima. Esta opção é útil se os ovos são necessárias muitas no mesmo estágio ou se expressão manual de ovos danifica os ovócitos. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade de Iowa IACUC Comitê.

A transferência bem sucedida irá resultar na fertilização e clivagem normal de&gt; 50% dos oócitos (Figura 3). Geralmente entre 30-60% dos oócitos transferidos sobreviverá após os estágios nêurula. Nós normalmente transferência 75-150 oócitos por grupo experimental, que vai produzir embriões suficientes para vários tipos de análise (in situ, RT-PCR), bem como visualizar o fenótipo. Implantação de ovócitos substancialmente mais não parece aumentar significativamente o rendimento. Além disso, pelo menos 30 oócitos por gru...

Soluções e receitas: OCM (meio de cultura de oócitos; modificado a partir Wylie et al, 1996). <table border="0"><tbody><tr><td> 70% L-15 Leibovitz de médio (contendo L-Glutamina) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml de albumina bovina sérica (BSA; V fração) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x penicilina-estreptomicina </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajuste para 7,6-7,8 pH com NaOH 5N </td></tr><tr><td colspan="2"> Fazer nova loja, semanal a 18 ° C. </td></tr></tbody></table> MMR 10X (solução modificada de Marc Ringer;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> HEPES 150 mM </td></tr><tr><td> ajustar o pH 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Solução anestésica <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-aminobenzóico Ethyl Ester (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bicarbonato de sódio 0,7 g / L </td></tr><tr><td colspan="2"> Dissolver em água tratada Amquel- </td></tr><tr><td colspan="2"> Faça fresco semanal </td></tr></tbody></table> Stocks de progesterona <table border="0"><tbody><tr><td> Progesterona 10 mM (Sigma P-0130) em etanol 100% </td></tr><tr><td> Diluir a 1 mM em etanol 100% para um estoque 500x solução / trabalho </td></tr><tr><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr></tbody></table> Corantes vitais (modificado de Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Azul: 0,1% Nilo Azul A </td><td> (Aldrich 121.479-5G), </td></tr><tr><td> Vermelho: 0,25% Vermelho Neutro </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Brown: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Verde (80 mL + 80 azul castanho mL), </td></tr><tr><td colspan="2"> Malva (80 vermelho azul + 80 mL mL). </td></tr><tr><td colspan="2"> A cor sexta, Orange (80 mL vermelho + 80 mL marrom), também pode ser usado, mas é muitas vezes difícil de distinguir de castanho. </td></tr></tbody></table> Estoques de azul, vermelho e marrom são compostos em água deionizada em tubos de 50 ml, incubadas por 20 minutos com balanço e fiado em uma centrífuga clínica. Os sobrenadantes são aliquotado em tubos de microcentrífuga e armazenadas a -20 ° C.

fertilização de oócitos xenopus utilizando o método de transferência do host

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Estudar a contribuição de moléculas herdada da mãe para o desenvolvimento inicial dos vertebrados é frequentemente prejudicada pelo tempo e despesa necessária para gerar animais mutantes efeito materno. Além disso, muitas das técnicas para superexpressão ou inibir a função do gene em organismos como Xenopus e zebrafish não suficientemente alvo crítico materna vias de sinalização, tais como sinalização Wnt. Em Xenopus, manipulando a função do gene em oócitos cultivados e, posteriormente, fecundá-los pode amenizar esses problemas até certo ponto. Ovócitos são manualmente defolliculated de tecido de ovário doador, injetado ou tratados de cultura como desejado, e então estimulados com progesterona para induzir a maturação. Em seguida, os oócitos são introduzidos na cavidade do corpo de um sapo anfitrião ovulando feminino, quando então eles serão translocados através do oviduto do hospedeiro e adquirir modificações e casacos de geléia necessário para a fertilização. Os embriões resultantes podem então ser aumentado para o estágio desejado e analisadas para os efeitos de quaisquer perturbações experimental. Este método de transferência de anfitrião tem sido altamente eficaz em descobrir mecanismos básicos do desenvolvimento inicial e permite uma ampla gama de possibilidades experimentais não disponíveis em qualquer outro organismo vertebrado modelo.

Procedimento para fertilizar<em&gt; Oócitos Xenopus</em&gt; Pelo método de transferência de host.

Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

Estudar a contribuição de moléculas herdadas matematicamente para o desenvolvimento precoce de vertebrados é frequentemente dificultado pelo tempo e custo necessários para...

O objetivo geral deste procedimento é obter embriões em desenvolvimento derivados de sítios OO que foram manipulados em cultura. Isso é realizado primeiramente isolando sítios doadores de uma fêmea e manipulando-os conforme desejado em cultura. O segundo passo do procedimento consiste em estimular essas cítas a amadurecer usando progesterona e injetar fêmeas hospedeiras em potencial com gonadotrofina para estimular a postura de ovos.O terceiro passo do procedimento é corar os cítos do doador com corantes vitais e preparar uma fêmea para atuar como hospedeira. O passo final do procedimento é transferir cirurgicamente os cítos do doador para a cavidade corporal da hospedeira e, algumas horas depois, recuperar e fertilizar os óvulos transferidos. Em última análise, embriões com divisão normal derivados dos cítos do doador manipulados experimentalmente.Células podem ser obtidas e analisadas da mesma forma que embriões normais. Olá, sou Doug Houston, da Universidade de Iowa. Hoje estamos no curso Xap de Cold Spring Harbor para mostrar como realizar o procedimento de transferência para o hospedeiro.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os papéis dos produtos gênicos maternos e determinar suas funções no desenvolvimento inicial do embrião. Então, vamos começar. Antes de iniciar a cirurgia, certifique-se de que a área cirúrgica está desinfetada e de que o meio fresco e os instrumentos estéreis estão prontos.Segure uma agulha de sutura com o porta-agulhas na orientação desejada. Coloque uma rã fêmea anestesiada em decúbito dorsal sobre uma gaze cirúrgica úmida. Usando pequenas tesouras de íris, faça uma incisão de um centímetro na pele na parte inferior do abdômen, lateral à linha média.Não corte o músculo abdominal. Use uma pinça para levantar a camada muscular e a fáscia de cor branca ao redor. Use a tesoura de íris para fazer um único corte rápido diretamente através do músculo.Estenda a incisão até um centímetro, expondo o ovário. Use uma pinça para segurar o ovário e puxar um lobo. Use tesoura para cortar o lobo ao nível da parede corporal.Coloque o tecido em uma placa de 90 milímetros contendo meio de cultura de ovócitos ou MCO e avalie imediatamente a qualidade do ovário sob um microscópio estereoscópico. Alguns citos podem ser defoliados com pinça. Se os citos estiverem firmes e com tamanho e coloração uniformes, remova a quantidade desejada de tecido ovariano da rã e coloque em uma placa de Petri de 90 milímetros contendo MCO.Fechamento da incisão. Insira a agulha alguns milímetros laterais à incisão, certificando-se de que ela atravesse tanto o músculo quanto a fáscia. Utilize pinça para manipular a agulha, tomando cuidado para não puxar completamente a extremidade do fio cirúrgico através do tecido.Fechamento da ferida com pontos simples interrompidos e nós quadrados de cirurgião. A técnica é descrita em detalhes no texto acompanhante. Repita a sutura na camada da pele.Lave a fêmea com água desionizada e coloque-a em um balde de recuperação cheio de água fria. Imediatamente após a conclusão da cirurgia, use tesoura para subdividir o ovário. Corte os lóbulos individuais, aplane-os e corte em pedaços quadrados de dois centímetros.Lave com meio limpo e use pin&ccedil;as. Transfira cinco a seis peda&ccedil;os para um novo &iacute;gneo de 90 mil&iacute;metros contendo OCM para isolar c&eacute;lulas individuais. Comece transferindo um dos peda&ccedil;os para um pequeno &iacute;gneo contendo meio e leve ao microsc&oacute;pio estereosc&oacute;pico.Use pin&ccedil;as de relojoeiro para remover manualmente tr&ecirc;s a 500 ov&oacute;citos. Segure a camada de tecido conjuntivo que envolve um ov&oacute;cito em est&aacute;gio seis completamente desenvolvido pr&oacute;ximo ao estoque com um segundo par de pin&ccedil;as. Segure o ov&aacute;rio adjacente ao ov&oacute;cito com o primeiro par de pin&ccedil;as.Puxe suavemente sobre o ovócito para romper a camada folicular. Retire cuidadosamente o ovócito do tecido com sucesso. Ovócitos desfolliculados não apresentam vasos sanguíneos visíveis e são mais moles do que ovócitos com folículos intactos.Utilize uma pipeta com ponta de vidro polida a fogo e tampão de algodão para transferir grupos de 100 a 150 células para placas de cultura de 60 milímetros contendo oito mililitros de OCM. Armazene os ovócitos nas placas a 18 graus Celsius. Os ovócitos podem agora ser microinjetados conforme desejado com oligonucleotídeos antissenso ou RNAs mensageiros, de acordo com diversos protocolos, e então cultivados em OCM em uma incubadora a 18 graus Celsius.Utilize ovócitos para transferência dentro de 96 horas após o isolamento, realizado na noite anterior à realização da transferência. Incube os ovócitos necessários com progesterona para maturação, adicionando 16 microlitros de progesterona a um milimolar ao meio contendo os ovócitos, para uma concentração final de dois micromolares. Incube por 10 a 12 horas a 18 graus Celsius na mesma noite; injete três a cinco fêmeas com 1000 unidades de gonadotrofina coriônica humana por rã para induzir a postura de ovos.Deixe as fêmeas em temperatura ambiente ou a 18 graus Celsius durante a noite na manhã da transferência. Verifique ao microscópio estereoscópico para garantir que os cítos cultivados tenham passado por maturação. Remova os corantes vitais e centrifugue a mais de 10.000 Gs por cinco minutos.Para reduzir o fundo proveniente de detritos, adicione 80 microlitros do corante vital apropriado a cada grupo experimental de ovócitos. Incube em temperatura ambiente por 15 minutos em um agitador. Transfira os ovos corados para uma placa de 90 milímetros com o cm fresco e agite brevemente para lavá-los.Prepare um pipeta para usar na transferência dos citos. Use um lápis de diamante para marcar um ponto no seu pipeta cerca de dois centímetros abaixo da parte cônica e quebre-o limpidamente. Isso deve criar um pipeta com um orifício de 1,5 milímetro, apenas grande o suficiente para acomodar um oócito fogo.Polida a ponta até que as bordas fiquem lisas, sem fechar a ponta. Transplante de ovócito. A cirurgia deve ser realizada o mais rapidamente possível.Faça uma incisão como antes em uma fêmea anestesiada que esteja produzindo ovos de boa qualidade. Este corte deve ter o comprimento mínimo necessário para acomodar apenas o diâmetro interno da transferência. Pipete menos de um centímetro.Agite suavemente o recipiente com ovócitos experimentais para reuní-los no centro do recipiente. Use a pipeta de pasteur preparada para aspirar o maior número possível. Deixe os ovócitos sedimentarem na extremidade da pipeta para minimizar a quantidade de líquido transferida para o sapo.Use uma pin&ccedil;a para segurar e elevar uma aba de m&uacute;sculo e f&aacute;scia. Insira a ponta da pipeta na incis&atilde;o e permita lentamente que os citos escorram para a cavidade corporal. Repita o processo at&eacute; que todos os ov&oacute;citos tenham sido transferidos.Não solte a camada muscular para evitar que os ovócitos escapem pelo corte. Use uma pinça para segurar ambos os lados da incisão e aproximá-los, permitindo que os cítos se acomodem na cavidade corporal. Inicie a sutura da camada muscular e da fáscia como antes, tomando cuidado para manter a tensão para cima até que o primeiro nó seja amarrado.Suture a pele. Enxágue a rã com água desionizada e permita que ela se recupere como antes. A rã deve começar a pôr ovos normalmente após a operação, iniciando duas a três horas após a cirurgia.Recupere os ovos por espremedura normal a cada meia hora até a fêmea parar de pôr, colocando-os em um recipiente com ovos coletados. Adicione quatro mililitros de uma suspensão de espermatozoides recém-coletados em um XMMR e incube à temperatura ambiente por quatro minutos. Encha com líquido e lave os ovos extensivamente com água à temperatura ambiente.Ponha um XMMR incubado em temperatura ambiente para permitir a ativação e clivagem. Utilize cisteína em qualquer momento para remover os códigos de gelatina. Os embriões transferidos podem então ser separados em placas diferentes conforme a cor e cultivados como embriões normais.Tipicamente, mais de dois terços dos ovos transferidos irão ativar em minutos após a fertilização, mostrando uma contração cortical acentuada no polo animal. Na maioria dos experimentos, mais da metade dos ovos transferidos sofrerá clivagem normal na primeira divisão. Às vezes, a clivagem será atrasada cerca de 20 minutos em relação aos ovos hospedeiros em nossas mãos.De 30 a 60% dos embriões transferidos prosseguem normalmente até a gastrulação e sobreviverão além do estágio neural. Os embriões transferidos manterão a cor do corante vital por muitos dias de desenvolvimento. Embriões derivados de células-controle não injetadas aparecerão normais, conforme esperado.Por outro lado, embriões derivados de ovócitos injetados com beta catenina e oligonucleotídeos antissenso, por exemplo, terão uma aparência centralizada. Acabamos de mostrar como obter embriões de citozóides manipulados em cultura.Ao realizar este procedimento, é importante começar com ovócitos doadores saudáveis e totalmente desenvolvidos e utilizar fêmeas hospedeiras com óvulos de alta qualidade. Além disso, o sucesso do método tende a se correlacionar com a velocidade com que você isola os ovócitos e realiza as cirurgias. Portanto, pode ser necessário algum treinamento antes de obter resultados consistentes.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

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Aprenda a fertilização de oócitos Xenopus pelo método de transferência do host. Este procedimento envolve isolamento, maturação com progesterona e transferência cirúrgica para estudos de biologia do desenvolvimento.

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