Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

O objetivo geral deste procedimento é obter embriões em desenvolvimento derivados de sítios OO que foram manipulados em cultura. Isso é realizado primeiramente isolando sítios doadores de uma fêmea e manipulando-os conforme desejado em cultura. O segundo passo do procedimento é estimular esses citos a amadurecer usando progesterona e injetar fêmeas hospedeiras potenciais com gonadotrofina para estimular a postura de ovos.

O terceiro passo do procedimento é corar os cítios doadoras com corantes vitais e preparar uma fêmea para atuar como hospedeira. O passo final do procedimento é transferir cirurgicamente os cítios doadores para a cavidade corporal da hospedeira e, algumas horas depois, recuperar e fertilizar os óvulos transferidos. Em última análise, embriões normalmente em divisão derivados dos doadores manipulados experimentalmente.

Células podem ser obtidas e analisadas da mesma forma que embriões normais. Olá, sou Doug Houston, da Universidade de Iowa. Hoje estamos no curso Xap de Cold Spring Harbor para mostrar como realizar o procedimento de transferência para o hospedeiro.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os papéis dos produtos gênicos maternos e determinar suas funções no desenvolvimento inicial de zap. Vamos começar. Antes de iniciar a cirurgia, certifique-se de que a área cirúrgica está desinfetada e de que os meios frescos e os instrumentos estéreis estão prontos.

Segure uma agulha de sutura com o porta-agulhas na orientação desejada. Coloque uma rã fêmea anestesiada em decúbito dorsal sobre uma toalha cirúrgica úmida. Usando pequenas tesouras de íris, faça uma incisão de um centímetro na pele na parte inferior do abdômen, lateral à linha média.

Não corte o músculo abdominal. Use uma pinça para levantar a camada muscular e a fáscia de cor branca ao redor. Use a tesoura de íris para fazer um único corte rápido diretamente através do músculo.

Estenda a incisão até um centímetro, expondo o ovário. Use uma pinça para segurar o ovário e puxar um lobo. Use tesoura para cortar o lobo ao nível da parede corporal.

Coloque o tecido em uma placa de 90 milímetros contendo meio de cultura de ovócitos ou MCO e avalie imediatamente a qualidade do ovário sob um microscópio estereoscópico. Alguns ovócitos podem ser desfolhados com pinça. Se os ovócitos estiverem firmes e com tamanho e coloração uniformes, remova a quantidade desejada de tecido ovariano da rã e coloque em uma placa de Petri de 90 milímetros contendo MCO.

Fechamento da incisão. Insira a agulha alguns milímetros laterais à incisão, certificando-se de que ela atravesse tanto o músculo quanto a fáscia. Use pinça para manipular a agulha, tomando cuidado para não puxar completamente o final do fio cirúrgico através do tecido.

Fechamento da ferida com pontos simples interrompidos e nós quadrados de cirurgião. A técnica é descrita em detalhes no texto acompanhante. Repita o suturamento com a camada da pele.

Lave a fêmea com água desionizada e coloque-a em um balde de recuperação cheio com água fria. Imediatamente após concluir a cirurgia, use tesoura para subdividir o ovário. Corte os lóbulos individuais, aplainá-los e cortá-los em pedaços quadrados de dois centímetros.

Lave com meio limpo e use pinças. Transfira cinco a seis fragmentos para um novo ígote de 90 milímetros de meio de cultura de ovos (OCM) para isolar células individuais. Comece transferindo um dos fragmentos para um pequeno ígote de meio e leve ao microscópio estereoscópico.

Use pinças de relojoeiro para remover manualmente três a 500 ovócitos. Segure a camada de tecido conjuntivo que envolve um ovócito em estágio seis completamente desenvolvido próximo ao estoque com um segundo par de pinças. Segure o ovário adjacente ao ovócito com o primeiro par de pinças.

Puxe suavemente sobre o ovócito para rasgar a camada folicular. Retire cuidadosamente o ovócito do tecido com sucesso. Os ovócitos desfolliculados não apresentam vasos sanguíneos visíveis e são mais moles do que os ovócitos com folículos intactos.

Utilize uma pipeta de vidro polida a fogo com tampa de algodão para transferir grupos de 100 a 150 cistos para placas de cultura de 60 milímetros contendo oito mililitros de OCM. Armazene os ovócitos nas placas a 18 graus Celsius. Os ovócitos podem agora ser microinjetados conforme desejado com oligonucleotídeos antissenso ou RNAs mensageiros, de acordo com diversos protocolos, e então cultivados em OCM em uma incubadora a 18 graus Celsius.

Utilize ovócitos para transferência dentro de 96 horas após o isolamento, realizado na noite anterior à realização da transferência. Incube os ovócitos necessários com progesterona para maturação, adicionando 16 microlitros de progesterona a um milimolar ao meio contendo os ovócitos, para uma concentração final de dois micromolares. Incube por 10 a 12 horas a 18 graus Celsius na mesma noite; injete três a cinco fêmeas com 1000 unidades de gonadotrofina coriônica humana por rã para induzir a postura de ovos.

Deixe as fêmeas em temperatura ambiente ou a 18 graus Celsius durante a noite na manhã da transferência. Verifique ao microscópio estereoscópico para garantir que os cítos cultivados tenham passado pela maturação. Aspire os corantes vitais e centrifugue a mais de 10.000 Gs por cinco minutos.

Para reduzir o fundo proveniente de detritos, adicione 80 microlitros do corante vital apropriado a cada grupo experimental de ovócitos. Incube em temperatura ambiente por 15 minutos em um agitador. Transfira os ovos corados para uma placa de 90 milímetros com o cm fresca e agite brevemente para lavá-los.

Prepare um pipeta para usar na transferência dos citos. Use um lápis de diamante para marcar um ponto no seu pipeta cerca de dois centímetros abaixo da porção cônica e quebre-o limpidamente. Isso deve criar um pipeta com um orifício de 1,5 milímetro, apenas grande o suficiente para acomodar um oócito fogo.

Polida a ponta até que as bordas fiquem lisas sem fechar a ponta. Transplante de ovócito. A cirurgia deve ser realizada o mais rapidamente possível.

Realize uma incisão como antes em uma fêmea anestesiada que esteja produzindo ovos de boa qualidade. Este corte deve ter o comprimento mínimo necessário para acomodar apenas o diâmetro interno da transferência. Pipete menos de um centímetro.

Agite suavemente o recipiente com ovócitos experimentais para reuní-los no centro do recipiente. Use a pipeta de pasteur preparada para aspirar o maior número possível. Deixe os ovócitos sedimentarem na extremidade da pipeta para minimizar a quantidade de líquido transferida para o sapo.

Use uma pinça para segurar e elevar uma aba de músculo e fáscia. Insira a ponta da pipeta na incisão e permita lentamente que os citos escorram para a cavidade corporal. Repita o processo até que todos os ovócitos tenham sido transferidos.

Não solte a camada muscular para evitar que os ovócitos escapem pelo corte. Use uma pinça para segurar ambos os lados da incisão e aproximá-los, permitindo que os cítos se acomodem na cavidade corporal. Inicie a sutura da camada muscular e da fáscia como antes, tomando cuidado para manter a tensão para cima até que o primeiro nó seja amarrado.

Suture a pele. Enxágue a rã com água desionizada e permita que ela se recupere como antes. A rã deve começar a pôr ovos normalmente após a operação, iniciando duas a três horas após a cirurgia.

Recupere os ovos por espremedura normal a cada meia hora até a fêmea parar de pôr, em um recipiente com ovos coletados. Adicione quatro mililitros de uma suspensão de espermatozoides recém-coletados em um XMMR e incube à temperatura ambiente por quatro minutos. Encha com líquido e lave os ovos extensivamente com água à temperatura ambiente.

Incubar o XMMR por um ponto a temperatura ambiente para permitir a ativação e clivagem. Utilize cisteína em qualquer momento para remover os códigos de gelatina. Os embriões transferidos podem então ser separados em placas distintas conforme a cor e cultivados como embriões normais.

Normalmente, mais de dois terços dos ovos transferidos irão ativar em minutos após a fertilização, mostrando uma contração cortical acentuada no polo animal. Na maioria dos experimentos, mais da metade dos ovos transferidos realizará a primeira clivagem normal. Às vezes, a clivagem será atrasada cerca de 20 minutos em relação aos ovos hospedeiros em nossas mãos.

De 30 a 60% dos embriões transferidos prosseguem normalmente até a gastrulação e sobreviverão além do estágio neural. Os embriões transferidos manterão a cor do corante vital por muitos dias de desenvolvimento. Embriões derivados de citoplasmas-controle não injetados aparecerão normais, conforme esperado.

Por outro lado, embriões derivados de ovócitos injetados com beta catina e oligonucleotídeos antissenso, por exemplo, terão uma aparência centralizada. Acabamos de mostrar como obter embriões de citozóides manipulados em cultura.

Ao realizar este procedimento, é importante começar com ovócitos doadores saudáveis e completamente desenvolvidos e utilizar fêmeas hospedeiras com ovos de alta qualidade. Além disso, o sucesso do método tende a se correlacionar com a velocidade com que você isola os ovócitos e realiza as cirurgias. Portanto, pode ser necessário algum treino antes de se obterem resultados consistentes.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.