Name: Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Aprenda a dissecar explantes do organizador e pólo animal de embriões Xenopus laevis e montar ensaios de adesão celular para estudar moléculas de adesão críticas no desenvolvimento.

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Preparando Chambers Adesão (um dia antes da injecção / dissecção) Ensaio de aderência Chambers Se você tem um microscópio composto convencional (óptico localiza acima do palco), é ncecessary para fazer uma baixa altura câmara de adesão da seguinte forma. Se estiver usando o microscópio invertido óptica, então &quot;NUNC Lab-Tek lamela Chambered&quot; pode apenas ser usado, e ignore as etapas # 1 - 2. <ol><li> Anexar um dos &quot;press-to-vedação isolante de silicone&quot; em uma lamínula 40 x 24mm. Pressione firmemente o isolador para a lamínula na bancada limpa e olhar do outro lado para certificar-se que o isolante é completamente ligado sem-bolhas de ar. </li><li> Opcional: Coloque as câmaras de adesão em uma placa de Petri de vidro com papel de filtro Whatman e autoclave no ciclo de seca para esterilizar. Resfriá-los para baixo para RT. </li></ol> Revestimento da Câmara <ol><li> Coloque uma gota de 200ml de solução de trabalho de caderina (10mg/ml) ou fibronectina (20mg/ml) para o centro de uma câmara de adesão autoclavada, utilizando sigmacoated dicas amarelo. Incubar a RT por 4 horas. </li><li> Retire a solução caderina ou fibronectina e transferir para um tubo de 1,5 ml. Esta solução pode ser reutilizado para próximas duas semanas. </li><li> Dispense 500ml de BSA 4% em 1x MBS-H para bloquear a câmara. Incubar a RT por 1 hora. </li><li> Aspirar a solução de BSA. Lave a câmara com 500ml de 1x MBS-H duas vezes. Depois da segunda lavagem, aspirar a maioria dos MBS-H (não completamente), e armazenar em um recipiente fechado a 4 º C. Esta câmara de adesão é bom para os dois próximos - 3 dias. </li></ol> Dissecção e dissociação de explantes Cap animal <ol><li> Incubar os embriões injetados em 0,1 x MBS-H, diluídos a partir do 1x autoclavado MBS-H, como não-autoclavado médio sometime carrega germes pouco que pode perturbar as células cap dissociada animal. </li><li> Faça agarose 1x Barth e placas CMF-MBS agarose com pratos 60mm, pelo menos tantos como o número de suas amostras. Despeje autoclavado 1x MBS-H para placas 1x Barth. Para placas MBS-CMF, despeje 10ml de CMF-MBS. </li><li> Quando os embriões tornam-se palco 8,5, iniciar dissecar as tampas de animal em uma placa de Barth 1x. 10-15 explantes por amostras são geralmente suficiente para uma experiência. </li><li> Transferir os explantes cap animal para uma placa CMF-MBS. Incubar os explantes de 45-60 minutos, até que os explantes são completamente dissociados. Agitações suave em cada 15 minutos vai ajudar a dissociação. </li></ol> Ensaio de adesão celular <ol><li> Semeadura das células: Dispense 500ml de 1x MBS-H para a câmara de adesão preparada nas etapas nas seções acima, Chambers Ensaio de Adesão e revestimento da Câmara. Transferência das células animais cap dissociada da placa CMF-MBS para a câmara de adesão usando P200 com dicas sigmacoated e picados-off amarela. </li><li> Opcional: Se possível, cuidadosamente sugar até o meio até aproximadamente 2 / 3 para metade, sem expor as células para o ar. Adicionar aproximadamente a mesma quantidade de doce MBS-H, para se certificar de que o meio contém suficientes Ca 2 + e Mg 2 +. </li><li> Incubar a RT para 45-90 minutos. Verifique as células ocasionalmente para ver se eles são inerentes a superfície inferior. </li><li> Agora você pode tirar a foto das células sob um microscópio. </li><li> Coloque a câmara de aderência em um copo de slides grid. Alinhar um dos cantos da câmara de adesão a um canto do slide grid. Contar e registrar o número de células associadas em diversas redes diferentes. </li><li> Despeje 1L de MBS-H em um balde grande de plástico (por exemplo, Tupperware, etc.) Com cuidado, coloque a câmara de slides adesão ao fundo do balde. Girá-lo no agitador orbital por cinco minutos em baixa velocidade (50 - 60rpm). </li><li> Coloque a câmara de adesão de volta no slide grid, alinhando o mesmo canto da câmara para o mesmo canto do slide grid, como foi feito no passo 5 desta seção Ensaio de Adesão, Cell. Contar o número de células que permanecem ligados na mesma grelha que você tem contado antes da lavagem. Calcular a porcentagem de células que permanecem ligados após a lavagem. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>Barth Modificado&amp;rsquo;s médio: receita para 1 L: 5,14 g de NaCl, 75 mg de KCl, 0,2 g de NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0,2 g de MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg de CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 38 g de HEPES, ácido livre Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Autoclave.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>Este é o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-versão livre de MBS-H. Receita de 500 mL: 2,57 g de NaCl, 37,5 mg de KCl, 0,1 g de NaHCO₃&lt;sub&gt;3/sub&gt; 1,19 g de HEPES, ácido livre. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Autoclave.</td></tr><tr><td>1% agarose/1x Barth&amp;rsquo;placas s</td><td></td><td></td><td></td><td>tantos quanto o número de amostras</td></tr><tr><td>placas de 1% agarose/MBS-CMF</td><td></td><td></td><td></td><td>tantos quanto o número de amostras</td></tr><tr><td>E-Caderina/Fc quimérica </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>Dissolva 0,1 mg de E-caderina sólida em 100 μl de MBS-H 1x contendo 40% de glicerol para obter um estoque-mãe 100x (1,0 mg/ml). Armazene-o em &amp;#8211;20 &amp;deg;C. Faça uma diluição 1/100 com MBS-H 1x para obter uma solução trabalho de 10 μg/ml logo antes de usar. Você precisará de 200 μl dessa solução trabalho por amostra.</td></tr><tr><td>Fibronectina, solução a 0,1% </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>Esta solução pré-pronta pode ser usada como estoque 50x. Faça uma diluição 1/50 com MBS-H 1x para preparar 20 &amp;mu;solução trabalho de g/mL logo antes de usar. Você precisa de 200 &amp;mu;L por amostras desta solução de trabalho. NÃO recomendo o uso de Fibronectina sólida, porque é difícil dissolvê-la na concentração de 0,1% para preparar a solução estoque. Embora seja mais cara, essa solução pronta de 0,1% é preferível para obter resultados consistentes.</td></tr><tr><td>4% BSA /MBS-H</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>BSA: fração V grau biologia molecular</td></tr><tr><td>pontas amarelas Sigmacoted </td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura nº 1</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm ou 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Isolador de silício com vedação por pressão</td><td>Ferramenta</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>2,5 mm de profundidade x 20 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 poços/lâminas</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro com grade</td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td><td>ou retículo do Finder para contagem de células</td></tr></tbody></table>

dissecção do organizador e explantes pólo animal a partir de embriões xenopus laevis e montagem de um ensaio de adesão celular

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Este vídeo demonstra a técnica utilizada para a preparação de organizador e explantes pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis, incluindo o uso da faca sobrancelha - uma ferramenta de dissecção especializados feitos da própria sobrancelha. O protocolo para a montagem de um ensaio de aderência também é dado, que investiga para a presença de moléculas de adesão chave presentes na superfície ou organizador de células animais pólo que são críticos para o desenvolvimento adequado.

Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Olá, meu nome é Sochi Agata. Sou cientista pós-doutoranda no laboratório do Dr. Ken Cho, de desenvolvimento em biologia celular e do desenvolvimento, na Universidade da Califórnia em Irvine. Hoje demonstrarei a dissecação e o ensaio de adesão de explantes do chapéu animal ou expansão do organizador a partir de embriões de Xenopus laevis.Este procedimento pode ser utilizado para estudar as características de adesão celular e a morfologia celular de células derivadas de tecido dissecado. Este procedimento envolve a dissecação de um determinado tecido do embrião de rã Xenopus, e a dissociação em meio livre de cálcio e magnésio, seguida pela transferência das células dissociadas para condições contendo cálcio e magnésio, sobre lâminas de vidro recobertas com moléculas de adesão celular. E, com este procedimento, podemos estudar o comportamento celular, a migração celular e as características de adesão das células X dissecadas.Ok, em todo este procedimento de dissecação do embrião e ensaio de adesão, utilizo primeiramente ferramentas especiais importadas. Este é um bar x um sem cálcio e magnésio, com 1% de agarose pulverizado. E este aqui ao lado é um bar x um comum, com 1% de agarose p

dissection-organizer-animal-pole-explants-from-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este ensaio avalia a capacidade de uma molécula de sinalização, aqui proteína morfogenética óssea 7 (BMP7), para reorientar axônios comissurais. Um explante da medula espinhal dorsal embrionárias cultivadas é adjacente a um agregado de células secretoras de COS os fatores de crescimento candidato. Reorientou axônios comissurais crescendo dentro do explante são visualizados através da imuno-histoquímica.

Doseamento do Capacidade de difusíveis moléculas sinalizadoras para Reorientar embrionárias Spinal Axônios comissural

Superexpressão de genes animais tampas de produto (s) são transplantadas para o flanco de...

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Xenopus embrionárias epitélios são um sistema modelo ideal para estudar os comportamentos das células, como o desenvolvimento de polaridade e mudar de forma durante a morfogênese epitelial. Histologia tradicional de amostras fixa é cada vez mais sendo complementado por live-célula de imagem confocal. Aqui nós demonstrar os métodos para isolar os tecidos de rã e visualizar ao vivo as células epiteliais e seus citoesqueleto usando live-célula microscopia confocal.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Xenopus ectoderma embrionário tornou-se um modelo atraente para os estudos da polaridade celular. Um ensaio é descrito, em que a distribuição subcelular de proteínas fluorescentes é avaliada em células ectoderma. Este protocolo vai ajudar abordar as questões relacionadas ao controle espacial de sinalização.

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

Neurais culturas de explante de<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis proporciona um sistema de modelo ideal para o estudo da especificação célula destino e função fisiológica de células individuais da retina em cultura celular primária. Aqui apresenta-se uma técnica para dissecar os tecidos da retina e geração de culturas de células primárias que têm imagem para a actividade de cálcio e analisados ​​por hibridação in situ.

Dissecção, Cultura, Análise e de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tecido embrionário da retina

Este protocolo descreve como dissecar crista neural craniana premigratory (NC) de Xenopus laevis neurulas. Estes explantes podem ser semeadas em fibronectina e cultivadas in vitro, ou enxertados em embriões hospedeiros. Esta técnica permite estudar os mecanismos da transição epitélio NC-to-mesênquima, migração e diferenciação.

Dissecção<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crista neural para<em&gt; In vitro</em&gt; Cultura Explant ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplante

O manuscrito aqui fornece um simples conjunto de métodos que permitam analisar a secreção e difusão de ligantes marcados fluorescentes em Xenopus. Isto proporciona um contexto para testar a capacidade de outras proteínas para modificar a distribuição de ligando e permitindo experiências que podem dar uma visão sobre os mecanismos que regulam a gradientes de morfogénio.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

Nos embriões de Xenopus, as células do teto do blastocele são pluripotentes e podem ser programadas para gerar vários tecidos. Aqui, descrevemos protocolos para usar explantes de telhado de blastocele de anfíbios como um sistema de ensaio para investigar as principais características in vivo e in vitro do desenvolvimento neural inicial.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Apresentamos um protocolo de duas partes que combina imagens fluorescentes de cálcio com hibridização in situ, permitindo que o experimentador correlacione padrões de atividade de cálcio com perfis de expressão genética em um nível unicelular.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Descrevemos um protocolo simples para desenvolver organoides epiteliais mucociliais a partir de células ectoderm profundas isoladas dos embriões Xenopus laevis. Os progenitores multipotentes regeneram precursores de células de cálice epitelial e permitem o acompanhamento ao vivo da iniciação e progressão das transições celulares na superfície dos organoides.

Organoides epiteliais mucociliais de células embrionárias xenopus: geração, cultura e imagem ao vivo de alta resolução

Aprenda a dissecar explantes do organizador e pólo animal de embriões Xenopus laevis e montar ensaios de adesão celular para estudar moléculas de adesão críticas no desenvolvimento.

Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

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