Name: Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Aprenda a dissecar explantes do organizador e pólo animal de embriões Xenopus laevis e montar ensaios de adesão celular para estudar moléculas de adesão críticas no desenvolvimento.

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Preparando Chambers Adesão (um dia antes da injecção / dissecção) Ensaio de aderência Chambers Se você tem um microscópio composto convencional (óptico localiza acima do palco), é ncecessary para fazer uma baixa altura câmara de adesão da seguinte forma. Se estiver usando o microscópio invertido óptica, então &quot;NUNC Lab-Tek lamela Chambered&quot; pode apenas ser usado, e ignore as etapas # 1 - 2. <ol><li> Anexar um dos &quot;press-to-vedação isolante de silicone&quot; em uma lamínula 40 x 24mm. Pressione firmemente o isolador para a lamínula na bancada limpa e olhar do outro lado para certificar-se que o isolante é completamente ligado sem-bolhas de ar. </li><li> Opcional: Coloque as câmaras de adesão em uma placa de Petri de vidro com papel de filtro Whatman e autoclave no ciclo de seca para esterilizar. Resfriá-los para baixo para RT. </li></ol> Revestimento da Câmara <ol><li> Coloque uma gota de 200ml de solução de trabalho de caderina (10mg/ml) ou fibronectina (20mg/ml) para o centro de uma câmara de adesão autoclavada, utilizando sigmacoated dicas amarelo. Incubar a RT por 4 horas. </li><li> Retire a solução caderina ou fibronectina e transferir para um tubo de 1,5 ml. Esta solução pode ser reutilizado para próximas duas semanas. </li><li> Dispense 500ml de BSA 4% em 1x MBS-H para bloquear a câmara. Incubar a RT por 1 hora. </li><li> Aspirar a solução de BSA. Lave a câmara com 500ml de 1x MBS-H duas vezes. Depois da segunda lavagem, aspirar a maioria dos MBS-H (não completamente), e armazenar em um recipiente fechado a 4 º C. Esta câmara de adesão é bom para os dois próximos - 3 dias. </li></ol> Dissecção e dissociação de explantes Cap animal <ol><li> Incubar os embriões injetados em 0,1 x MBS-H, diluídos a partir do 1x autoclavado MBS-H, como não-autoclavado médio sometime carrega germes pouco que pode perturbar as células cap dissociada animal. </li><li> Faça agarose 1x Barth e placas CMF-MBS agarose com pratos 60mm, pelo menos tantos como o número de suas amostras. Despeje autoclavado 1x MBS-H para placas 1x Barth. Para placas MBS-CMF, despeje 10ml de CMF-MBS. </li><li> Quando os embriões tornam-se palco 8,5, iniciar dissecar as tampas de animal em uma placa de Barth 1x. 10-15 explantes por amostras são geralmente suficiente para uma experiência. </li><li> Transferir os explantes cap animal para uma placa CMF-MBS. Incubar os explantes de 45-60 minutos, até que os explantes são completamente dissociados. Agitações suave em cada 15 minutos vai ajudar a dissociação. </li></ol> Ensaio de adesão celular <ol><li> Semeadura das células: Dispense 500ml de 1x MBS-H para a câmara de adesão preparada nas etapas nas seções acima, Chambers Ensaio de Adesão e revestimento da Câmara. Transferência das células animais cap dissociada da placa CMF-MBS para a câmara de adesão usando P200 com dicas sigmacoated e picados-off amarela. </li><li> Opcional: Se possível, cuidadosamente sugar até o meio até aproximadamente 2 / 3 para metade, sem expor as células para o ar. Adicionar aproximadamente a mesma quantidade de doce MBS-H, para se certificar de que o meio contém suficientes Ca 2 + e Mg 2 +. </li><li> Incubar a RT para 45-90 minutos. Verifique as células ocasionalmente para ver se eles são inerentes a superfície inferior. </li><li> Agora você pode tirar a foto das células sob um microscópio. </li><li> Coloque a câmara de aderência em um copo de slides grid. Alinhar um dos cantos da câmara de adesão a um canto do slide grid. Contar e registrar o número de células associadas em diversas redes diferentes. </li><li> Despeje 1L de MBS-H em um balde grande de plástico (por exemplo, Tupperware, etc.) Com cuidado, coloque a câmara de slides adesão ao fundo do balde. Girá-lo no agitador orbital por cinco minutos em baixa velocidade (50 - 60rpm). </li><li> Coloque a câmara de adesão de volta no slide grid, alinhando o mesmo canto da câmara para o mesmo canto do slide grid, como foi feito no passo 5 desta seção Ensaio de Adesão, Cell. Contar o número de células que permanecem ligados na mesma grelha que você tem contado antes da lavagem. Calcular a porcentagem de células que permanecem ligados após a lavagem. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>Barth Modificado&amp;rsquo;s médio: receita para 1 L: 5,14 g de NaCl, 75 mg de KCl, 0,2 g de NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0,2 g de MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg de CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 38 g de HEPES, ácido livre Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Autoclave.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>Este é o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-versão livre de MBS-H. Receita de 500 mL: 2,57 g de NaCl, 37,5 mg de KCl, 0,1 g de NaHCO₃&lt;sub&gt;3/sub&gt; 1,19 g de HEPES, ácido livre. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Autoclave.</td></tr><tr><td>1% agarose/1x Barth&amp;rsquo;placas s</td><td></td><td></td><td></td><td>tantos quanto o número de amostras</td></tr><tr><td>placas de 1% agarose/MBS-CMF</td><td></td><td></td><td></td><td>tantos quanto o número de amostras</td></tr><tr><td>E-Caderina/Fc quimérica </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>Dissolva 0,1 mg de E-caderina sólida em 100 μl de MBS-H 1x contendo 40% de glicerol para obter um estoque-mãe 100x (1,0 mg/ml). Armazene-o em &amp;#8211;20 &amp;deg;C. Faça uma diluição 1/100 com MBS-H 1x para obter uma solução trabalho de 10 μg/ml logo antes de usar. Você precisará de 200 μl dessa solução trabalho por amostra.</td></tr><tr><td>Fibronectina, solução a 0,1% </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>Esta solução pré-pronta pode ser usada como estoque 50x. Faça uma diluição 1/50 com MBS-H 1x para preparar 20 &amp;mu;solução trabalho de g/mL logo antes de usar. Você precisa de 200 &amp;mu;L por amostras desta solução de trabalho. NÃO recomendo o uso de Fibronectina sólida, porque é difícil dissolvê-la na concentração de 0,1% para preparar a solução estoque. Embora seja mais cara, essa solução pronta de 0,1% é preferível para obter resultados consistentes.</td></tr><tr><td>4% BSA /MBS-H</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>BSA: fração V grau biologia molecular</td></tr><tr><td>pontas amarelas Sigmacoted </td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura nº 1</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm ou 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Isolador de silício com vedação por pressão</td><td>Ferramenta</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>2,5 mm de profundidade x 20 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 poços/lâminas</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro com grade</td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td><td>ou retículo do Finder para contagem de células</td></tr></tbody></table>

dissecção do organizador e explantes pólo animal a partir de embriões xenopus laevis e montagem de um ensaio de adesão celular

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Este vídeo demonstra a técnica utilizada para a preparação de organizador e explantes pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis, incluindo o uso da faca sobrancelha - uma ferramenta de dissecção especializados feitos da própria sobrancelha. O protocolo para a montagem de um ensaio de aderência também é dado, que investiga para a presença de moléculas de adesão chave presentes na superfície ou organizador de células animais pólo que são críticos para o desenvolvimento adequado.

Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Olá, meu nome é Sochi Agata. Sou cientista pós-doutoranda no laboratório do Dr. Ken Cho, de desenvolvimento em biologia celular e do desenvolvimento, na Universidade da Califórnia em Irvine. Hoje demonstrarei a dissecação e o ensaio de adesão de explantes do chapéu animal ou expansão do organizador a partir de embriões de Xenopus laevis.Este procedimento pode ser utilizado para estudar as características de adesão celular e a morfologia celular de células derivadas de tecido dissecado. Este procedimento envolve a dissecação de um determinado tecido do embrião de rã Xenopus, e a dissociação em meio livre de cálcio e magnésio, seguida pela transferência das células dissociadas para condições contendo cálcio e magnésio, sobre lâminas de vidro recobertas com moléculas de adesão celular. E, com este procedimento, podemos estudar o comportamento celular, a migração celular e as características de adesão das células X dissecadas.Ok, em todo este procedimento de dissecação do embrião e ensaio de adesão, utilizo primeiramente ferramentas especiais importadas. Este é um bar x um sem cálcio e magnésio, com 1% de agarose pulverizado. E este aqui ao lado é um bar x um comum, com 1% de agarose pulverizado, no qual você realiza a dissecação do embrião.E então esta é uma dissecação, uma ferramenta especial de dissecação além de pinças. Isso se chama faca de sobrancelha, um nome estranho, mas na verdade é feita literalmente de uma sobrancelha arrancada do rosto. E então colada na ponta de uma pipeta de pasta.E esta outra ferramenta aqui é chamada de laço de cabelo, que consiste novamente em um cabelo formando um laço na ponta de uma pipeta pastosa. Eu não usei esta ferramenta desta vez, mas algumas pessoas preferem o laço de cabelo em vez da lâmina em forma de olho, especialmente para o ensaio de adesão. Utilizo o isolante de borracha de silicone, que é colado na parte superior do lâmina de vidro, para formar a câmara do ensaio de adesão.Primeiro, retire o envoltório do embrião. Esta peça é o envoltório do embrião. Em seguida, dissecar o polo animal aderente.Este é um projeto com animais, você não precisa disso. Vire o embrião e você verá aqui o lábio dorsal claro. É lindo.Em seguida, pegue uma lâmina para globo ocular, encoste-a ao lado do lábio dorsal, encoste também do outro lado e, então, corte esta peça logo abaixo do lábio dorsal. Esta peça contém o organizador e a derme circundante. Vire esta peça e retire a parte abdominal do organizador interno.Me. Ok, eu meio que destruo a parte dérmica, mas isso não é importante. Então, tudo bem. E este pedaço no lado direito é a medida do organizador.Acabei de passar para o lado mais limpo da placa. O fragmento do lado direito é o pedaço organizador mera e este é o embrião inteiro. E agora você vê como, como, como, como é o tamanho do fragmento organizador.E isso pode ser usado para extrair algum fator que expresse a região organizadora, ou para criar CD organizador na biblioteca ou estudar a teratologia no tecido romal migratório. Antes de dissecar o capuz animal, você precisa encontrar o estágio adequado. Utilizamos embrião blastular no estágio oito.E agora aqui observamos na imagem três embriões em estágios diferentes. Os dois embriões no lado esquerdo estão no estágio sete, blastocisto, e o embrião M dois no centro está no estágio oito. Já os dois embriões no lado direito estão quase no estágio nove, blastocisto tardio.E gostamos de observar, gostamos de usar também o estágio oito intermediário porque, veja bem, antes de tudo, é possível notar claramente a diferença entre cada blastômero no polo animal. E este embrião no estágio oito oferece uma boa combinação de sítios celulares adequados e facilidade para dissecção no estágio sete. No polo animal, as células no estágio sete são muito grandes e o número é muito pequeno, enquanto no embrião no estágio nove, cada célula é muito pequena e, além disso, o tecido do exoma no polo animal torna-se mais fino do que no estágio oito.Para que você não obtenha tantas células quanto deseja. Primeiro, encoste a pinça na lateral do embrião e retire o envelope vitelino do embrião. Este é o envelope vitelino.Em seguida, você dissecará o centro do polo animal a partir do embrião. Ok, esta é uma peça excelente. O lado esquerdo é o explante do capuz animal dissecado e esta é o resto do embrião.E este fragmento pode ser usado, por exemplo, quando se injeta algo no polo animal do embrião em um estágio inicial, como uma construção do gene Porto; então, esse fragmento é dissecado posteriormente e utilizado no ensaio Porto, como no ensaio de reação cruzada, por exemplo. Agora vou utilizar o transplante e transferir o organizador x explante para estudar o ensaio de adesão celular. Para isso, preciso dissociar o organizador x explante em meio contendo cloreto de cálcio.Então, estou transferindo o explante do organizador deste prato de cultura comum para um prato com meio livre de cálcio e magnésio. No entanto, para fazer isso, se você tiver muita destreza manual, pode usar esta pipeta de transferência comum, mas ainda assim há um pequeno risco de danificar o embrião durante o procedimento. Por isso, o que normalmente faço é utilizar uma pipeta P200 com ponteira amarela.E esta ponta amarela foi previamente codificada com este código químico único para impedir que a célula adira à lateral da ponta amarela. Além disso, cortei a ponta com uma tesoura na extremidade da ponta amarela, de modo que a ponta agora é romba e de grande diâmetro, minimizando assim a chance de danificar o explante DX. Ok, agora o que você vê na imagem são os dois explantes organizadores e eu vou transferir essas duas peças deste prato de cultura regular para um prato contendo meio livre de mecanismo de cálcio.Aspire lentamente esses fragmentos e transfira-os para o meio livre de cálcio e magnésio. E agora, assim é como eles se apresentam no início, e veja como agora estão se dissociando quase ao nível de célula única. Agora, os explantes organizados estão em meio livre de cálcio e magnésio, e eu os incubarei nesse meio livre de cálcio e magnésio por uma hora, para permitir que se dissociem ao nível de célula única, para a próxima etapa de estudo da morfologia ou comportamento celular. Após uma hora de incubação, a célula, quero dizer, o explante organizado deverá estar dissociado.Eles estão bastante bem. E agora dê uma olhada nos microscópios e no microscópio. Eles são, sim, parecem bastante ativos.Ok, agora estou estudando o comportamento celular na câmara de imagem de lâmina, que capturei com cadherina ou INE ou outro tipo de molécula de adesão celular para criar uma câmara de imagem de adesão celular. Eu pego essa lâmina e também esse isolante de borracha de silicone e simplesmente coloco o isolante de borracha de silicone sobre a superfície da lâmina, pressionando firmemente para garantir que ele adira completamente ao redor desse círculo. Em seguida, olho do outro lado para verificar se houve adesão completa, de modo que o líquido não vaze pela parte superior.Naquela câmara de areia, despejo a gota de 200 microlitros da suspensão celular, a suspensão que contém proteínas de adesão celular como coesina ou fibronectina. E depois bloqueio essa câmara com 500 microlitros de BSA a 4%. Em seguida, substituímos a BSA por meio regular de PBS 1x.E agora parece que aqui está uma câmara pronta para transportar a célula. Então, pego novamente esta câmara, com uma pipeta P 200 acoplada a uma ponteira amarela cortada e revestida com sigma code, e aspiro a célula a partir do meio livre de cálcio e magnésio para esta câmara, que contém o meio, o qual também possui cálcio e magnésio. Agora, está bem, estou transferindo este organizador dissociado do ponto X usando a P 200.Primeiro, você coloca esta pipeta P200 e aspira lentamente a célula, podendo movimentá-la suavemente para cima e para baixo. Ainda assim, estou espalhando um pouco as células por toda parte, mas para garantir que estejam isoladas, posicione a câmara de imagem no centro do seu campo de visão e distribua as células uniformemente dentro da câmara de imagem. Agora, as células estão espalhadas sobre a superfície revestida.E vamos ver, no capilar superior as células parecem com isso. Ok, após duas ou três horas de espalhamento da célula na câmara adesiva, conto as células nesta câmara usando este microscópio. Normalmente, quando se tenta estudar a adesão de células de órgãos a partir de um explante organizador, deixa-se a célula sobre a lâmina revestida por duas a três horas.Em seguida, você pode quantificar o número de células na lâmina sob o microscópio para lavagem. Para remover as células triplamente ligadas ou não ligadas, basta colocar esta camada na câmara de Hession dentro do recipiente com tampão, que contém uma grande quantidade de tampão. Em seguida, inicie a agitação em velocidade muito suave, como 50 RPM, que é aproximadamente essa velocidade, e aguarde cinco minutos.Após cinco minutos, retire cuidadosamente esta câmara de adesão sem expor a célula no interior da câmara. Portanto, retire-a com cuidado assim, depois limpe o excesso de tampão e observe novamente ao microscópio para contar quantos por cento das células permanecem aderidas à superfície revestida. Após a lavagem, coloque novamente a câmara de adesão no mesmo local para garantir que estou observando exatamente a mesma posição da câmara de adesão.E agora comece a contar. Nesta tela, estou mostrando dois tipos diferentes de célula com a mesma molécula de adesão celular. E esses dois tipos de célula apresentam características de adesão completamente diferentes na mesma proteína.Na parte superior da mesma proteína adesiva celular adesiva. Também poderíamos usar esta célula dissociada do explante para analisar seu comportamento de agregação ou migração em imagens de lapso de tempo.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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