Aplicação de Métodos Stopped fluxo de Cinética para investigar o mecanismo de ação de uma proteína de reparo do DNA

Esta é uma apresentação de dois métodos de fluxo interrompido para medir a cinética da reação da proteína de reparo de erros no pareamento de DNA mush dois mush seis A. O mush dois mush seis reconhece erros no pareamento de bases no DNA e sinaliza o reparo em uma reação impulsionada por ATP. O primeiro método mede a ligação do mush dois mush seis ao DNA por meio do aumento na fluorescência de uma base de dois amino purina posicionada adjacente a um par GT com erro no DNA. Os reagentes são misturados em um instrumento de fluxo interrompido e monitorados ao longo do tempo para determinar a constante de velocidade.

O segundo método mede a atividade da TPA mush two mush six utilizando um repórter fluorescente de proteína ligadora de fosfato. Os reagentes são misturados em um sistema de fluxo interrompido e monitorados ao longo do tempo. Para determinar as constantes de velocidade da hidrólise de TP e da liberação de fosfato, os dados cinéticos resultantes elucidam o mecanismo de ação da mush two mush six no reparo de erros de pareamento do DNA.

Olá, sou Noah Biro do Laboratório de MONI, do departamento de biologia molecular e bioquímica da Universidade Wesleyan. Ei, sou DJ J, também do Laboratório de Man na Universidade Wesleyan. E sou Chris Dset, também do Laboratório de JI'S.

Hoje vamos mostrar a você dois ensaios baseados em fluorescência para monitorar a cinética de uma reação na escala de tempo de milissegundos. Utilizamos esses métodos em nosso laboratório para estudar como a proteína de reparo DA, MutSα, reconhece pares de bases desemparelhados no DNA e inicia o reparo. Então, vamos começar.

Antes que este procedimento possa começar, os reagentes proteicos e de DNA devem estar prontamente disponíveis. Obtenha a proteína visier mush dois mush seis que tenha sido previamente superexpressa em coli e purificada por cromatografia de troca iônica e afinidade. Para gerar os reagentes de DNA, adquira DNA de fita simples, modificado com o análogo de nucleotídeo fluorescente amino purina, purifique as fitas por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante e hibridize-as para gerar DNA duplex com erro pareamento contendo duas amino purinas adjacentes a um erro pareamento GT.

Da mesma forma, prepare DNA não marcado a partir de DNA de fita simples não modificado. As sequências de DNA utilizadas aqui podem ser encontradas na parte escrita deste protocolo. Durante todo este procedimento, assegure uma alta integridade experimental utilizando produtos químicos de alta qualidade para minimizar impurezas fluorescentes.

Filtre também todas as soluções estoque através de uma membrana de 0,2 micrômetro para remover partículas que possam entupir o instrumento de fluxo interrompido. Para preparar os experimentos de ligação ao DNA, prepare amostras com um volume final de 400 microlitros por amostra, o que é suficiente para cerca de 10 traçados cinéticos. Mantenha as amostras em gelo.

Para manter a atividade proteica, prepare a amostra de DNA a 0,12 micromolar e a amostra mush dois mush seis a 0,8 micromolar de concentração no tampão de ligação ao DNA. Isso resultará em concentrações finais de 0,06 micromolar de DNA e 0,4 micromolar de mush. Dois M seis após mistura um para um na fluoretação interrompida.

Um instrumento de fluxo interrompido utiliza um motor de acionamento para empurrar simultânea e rapidamente as soluções reagentes das seringas de acionamento para dentro de um dispositivo de mistura. A solução misturada então flui para uma célula de observação para coleta de dados, preparando o instrumento. Primeiro, certifique-se de que o computador e o controlador estão desligados.

Em seguida, ligue o banho de água circulante para resfriar a lâmpada e acenda a lâmpada. Ajuste o monocronômetro para o comprimento de onda de excitação desejado, que é 315 nanômetros. Para a duas amino purina, ajuste a largura do SL para o valor desejado.

Insira um filtro de corte de 350 nanômetros no tubo fotomultiplicador ou PMT para coletar o sinal fluorescente das duas purinas amino. Ligue o controlador e o computador. Em seguida, ligue o banho de água circulante.

Isso enche o manto de água ao redor das seringas de acionamento para manter a reatância na temperatura desejada durante o experimento. Por fim, execute o programa de parada de fluxo no menu de controle P-M-T-H-V. Ajuste a tensão do PMT, que pode variar inicialmente para regular a sensibilidade do PMT, mas deve ser mantida constante.

Durante o experimento, meça a corrente escura para corrigir o ruído elétrico de fundo. Em seguida, lave as seringas do acionador de fluxo interrompido e a célula de observação. Posicione a válvula de carregamento da amostra na posição de carregamento.

Encha uma seringa de um mililitro com água deionizada filtrada. Fixe a seringa na porta de carregamento localizada abaixo da seringa motriz e empurre a água entre as duas seringas. Repita o processo duas vezes para cada uma.

Acione a seringa que será usada no experimento. Em seguida, encha as seringas de acionamento com água para lavar a célula de observação. Mude a válvula de carregamento da amostra para a posição de fogo.

Use o comando ajustar o drive da seringa para abaixar a placa do drive e empurrar a água através da célula de observação e para dentro da linha de saída. Tenha cuidado para não empurrar o êmbolo até o final da seringa do drive. Por fim, levante a placa do drive e mude a válvula para a posição de carga.

Lave uma vez com tampão de reação e esvazie as seringas. Para iniciar os experimentos de ligação ao DNA, transfira cada amostra do tubo para uma seringa fresca de um mililitro. Conecte cada seringa a uma porta de carregamento e empurre a solução para dentro da seringa motriz.

Remova quaisquer bolhas de ar empurrando manualmente a solução entre as duas seringas com pausas intermitentes. Em seguida, abaixe a placa de acionamento até que entre em contato com a parte superior das seringas de acionamento. Para a coleta de dados, abra a janela de canais de tempo definido.

Selecione o modo de canal de coleta de dados da análise e o número de traçados a serem coletados. Insira o tempo de coleta de dados durante o qual 1000 pontos de dados serão coletados. Em seguida, ajuste a válvula para a posição de ignição e clique no botão coletar dados.

Essa ação inicia a mistura de mush dois, mush seis e DNA, seguida pela entrada da reação na observação. A emissão fluorescente celular de duas purinas amino é monitorada ao longo do tempo. Colete pelo menos cinco traçados cinéticos para obter um conjunto de dados de alta qualidade e salve o arquivo quando o experimento estiver concluído.

Abra cada arquivo de dados e faça a média de múltiplos traços cinéticos. Em seguida, salve o arquivo com os dados médios e exporte-o para um programa de análise gráfica. Por fim, desligue a lâmpada e lave extensivamente as seringas e a cubeta de observação com água.

Em seguida, desligue o restante dos equipamentos, exceto o banho de água circulante. Este permanece ligado por mais 15 minutos para resfriar a lâmpada. Os dados cinéticos da ligação do mush dois mush seis ao DNA com erro de pareamento são melhor ajustados por uma função exponencial simples, que fornece uma taxa rápida de associação na ordem de 10 elevado à sétima por molar por segundo. Experimentos análogos de fluxo interrompido fornecem a taxa de dissociação do complexo de mush dois mush seis com DNA de pareamento incorreto, que ocorre muito lentamente, entre 0,01 e 0,02 por segundo.

Esses resultados fornecem uma medida direta da velocidade e afinidade com que mush dois mush seis se liga a um par de bases desemparelhado durante a reação de reparo do DNA. Em seguida, um experimento de fluxo interrompido será realizado para medir a atividade ATPase de mush dois mush seis.

Em condições de estado pré-estudo para este ensaio, é absolutamente essencial evitar o uso de vidro em todas as etapas da preparação dos reagentes, incluindo a purificação de proteínas e DNA, a fim de minimizar os níveis de fosfato de fundo. A proteína de ligação a fosfato, ou PBP, que foi purificada de e coli e marcada com o fluoróforo MDCC, é utilizada como repórter para medir a liberação de fosfato após a hidrólise de A TP. M-D-C-C-P-B-P é um repórter robusto da hidrólise de A TP e da cinética de liberação de fosfato no estado pré-estudo. Ele se liga ao fosfato livre rapidamente e com alta afinidade, o que resulta em um grande aumento na fluorescência do MDCC.

Prepare uma amostra com quatro micromolar de mush, duas mush seis proteína com ou sem seis micromolar de DNA não pareado. Prepare outra amostra com um milimolar de HEP recém-dissolvido e 20 micromolar de M-D-C-C-P-V-P para remover qualquer fosfato contaminante. Adicione purina, nucleosídeo, fosforilase e sete metil guanina às amostras e incube em gelo por pelo menos 20 minutos.

Prepare o instrumento de fluxo interrompido conforme descrito anteriormente. Além disso, remova quaisquer contaminantes de fosfato das seringas de impulso com purina, nucleosídeo, fosforila e sete metil guanina. Incube por 20 minutos. Ajuste o comprimento de onda de excitação para 425 nanômetros e utilize um filtro de corte em 450 nanômetros com o PMT para a detecção da fluorescência de M-D-C-C-P-B-P.

Carregue as seringas do sistema com as amostras conforme descrito anteriormente. Defina os parâmetros de aquisição de dados e clique em coletar dados para misturar mush dois mush seis com um TP e monitore a liberação de fosfato por mush dois mush seis e o aumento acoplado na fluorescência de M-D-C-C-P-P-P. Ao longo do tempo, colete pelo menos cinco traçados cinéticos para obter um conjunto de dados de alta qualidade, salve o arquivo, faça a média de múltiplos traçados cinéticos e exporte o arquivo de dados para análise conforme descrito anteriormente. Prepare uma curva de calibração para determinar a relação linear entre a concentração de fosfato e a fluorescência de M-D-C-C-P-P-P; primeiramente, misture M-D-C-C-P-P-P com diferentes concentrações de fosfato sob as mesmas condições experimentais no sistema de fluxo interrompido.

Em seguida, plote a fluorescência máxima M-D-C-C-P-P-P versus cada concentração de fosfato para a curva de calibração e use a inclinação para determinar a concentração de fosfato nas reações mush dois mush seis. Plote a concentração de fosfato versus tempo e ajuste os dados a uma função exponencial e a uma função linear. Essa função descreve um surto de hidrólise de A TP e liberação de fosfato no estado pré-estudo A, seguido pela fase linear em estado estacionário da reação. Os dados cinéticos mostram que o mush dois mush seis hidrolisa A TP e libera fosfato rapidamente a 1,4 por segundo na primeira volta catalítica.

Em seguida, ocorre uma etapa lenta na reação que limita as conversões subsequentes a uma constante catalítica de estado estacionário sete vezes mais lenta, de 0,2 por segundo. No entanto, quando o mush to mush seis está ligado ao DNA com erro de pareamento, o surto de hidrólise de A TP e liberação de fosfato é suprimido. Esses resultados demonstram diretamente que, ao se ligar a um par de bases desemparelhado, o DNA mush to mush seis comuta para um estado ligado ao A TP.

Essa comutação é uma etapa crítica na reação de reparo do DNA. Acabamos de mostrar como usar um instrumento de fluxo interrompido para medir as velocidades de uma reação em tempo real. Tais medições aprimoraram nossa compreensão do mecanismo de ação do MASH dois, MASH seis e do reparo de erros de pareamento do DNA.

Ao realizar este tipo de experimentos, é importante lembrar de utilizar agentes de alta qualidade, incluindo DNA e proteína muito puros, e ter cuidado especial para evitar contaminação por fosfato no ensaio de ATPs. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.