Microscopia óptica de dispersão com base em filtros Gabor Two-Dimensional

Neste vídeo, a microscopia de dispersão óptica é usada para quantificar a fragmentação mitocondrial durante a apoptose. Embora a microscopia de dispersão óptica normalmente não exija fluorescência neste protocolo, as imagens fluorescentes serão adquiridas para fins de validação. Após a configuração do sistema de imagem, as células são marcadas com o rastreador do MIT verde e tratadas com esporina stor para induzir a apoptose.

Os dados ópticos são adquiridos para detectar mudanças na orientação das organelas celulares em duas horas. O início da fragmentação mitocondrial pode ser medido usando os dados de dispersão óptica, que mostram uma diminuição no grau de orientação das partículas subcelulares. Os dados são então validados correlacionando os dados ópticos espalhados com as regiões fluorescentes contendo mitocôndrias.

Olá, sou Nada Bustani, do Laboratório de Bio Óptica do Departamento de Engenharia Biomédica da Rutgers University. Eu sou Rob Pak do Bio Optics Lab, e também sou Deen do Bio Lab. Hoje mostraremos um procedimento para quantificar a dinâmica morfológica subcelular usando um método que não depende de corantes fluorescentes.

Usamos essa técnica em nosso laboratório para estudar mudanças dinâmicas na estrutura subcelular durante a apoptose ou morte celular programada. Então vamos começar. Comece este procedimento esterilizando as mãos enluvadas com etanol 70%.

Em seguida, coloque uma solução de estoque de 100 nano molares preparada de miot tracker verde e pré-quente, meio de cultura de células BAEC no capô com a luz apagada e esterilize todas as superfícies. Em seguida, coloque um prato de cultura de seis poços com células banhadas em vidro de cobertura sob o capô. Usando uma pipeta de pasta conectada a uma linha de vácuo.

Remova o meio celular dos poços. Em seguida, adicione imediatamente dois mililitros do meio marcado a cada poço para rotular as células. Mitocôndria. Cubra a placa de cultura de tecidos para evitar a exposição à luz direta da sala e coloque rapidamente as células de volta na incubadora.

Incube por 45 minutos a 37 graus Celsius enquanto as células incubam. Prepare a configuração óptica primeiro ligue o arco de mercúrio clamp. Em seguida, ligue as câmeras do microscópio do computador e conecte o laser no dispositivo de micro espelho digital ou DMD no difusor giratório.

Em seguida, olhe através da ocular do microscópio para ver se o lançamento óptico está alinhado. O campo de visão deve ser iluminado por luz laser. Para carregar a amostra, coloque uma a duas pequenas gotas de óleo de imersão sobre uma objetiva de imersão em óleo de 63 x enquanto ela está totalmente abaixada.

Em seguida, no palco, monte um slide que consiste em uma grade de linhas em intervalos regulares de 10 micrômetros chamado gradi, e levante a objetiva para que o óleo agarre seu foco. Em seguida, focalize a borda hexagonal do campo do condensador. Pare para que fique alinhado na iluminação central da Kohler.

A borda hexagonal deve ser centralizada na ocular e bem focada. Em seguida, usando o centro dos botões de posição de parada do campo do condensador, o campo do condensador, pare sobre o campo de visão. Inicie o laboratório IP e insira as configurações para operar a câmera.

Confirme se a câmera está configurada para o modo de transferência de quadros. Execute o comando acquire focus para iniciar a visualização ao vivo. Em seguida, defina o prefixo do índice e o local do arquivo no qual as imagens serão salvas.

Em seguida, inicie a imagem RS. Designe as configurações para operar a câmera instantânea fria. O modo de relógio deve ser definido como normal.

Inicie o software DMD. Coloque a íris de campo escuro no menu de script. Em seguida, clique em carregar e redefinir.

Para executar o script manualmente, defina a barra óptica do microscópio na janela de visualização como LSM. Isso enviará a imagem através do DMD na óptica alinhada. Projetando a imagem de campo escuro no CCD da câmera Cascade five 12.

A imagem de campo escuro deve aparecer na visualização ao vivo no laboratório de IP. Se necessário, concentre a imagem na visualização ao vivo. Defina o tempo de exposição alto o suficiente para garantir pelo menos 10.000 contagens de sinal na imagem.

Em seguida, tire um instantâneo do campo de visão usando o comando acquire single após a aquisição. Use o comando salvar como indexado para salvar a imagem no disco. A imagem do GTI mede o tamanho do campo de visão.

Agora mova a amostra do GTI para que ela fique além do campo de visão e apenas o plano de fundo fique visível. Capture uma imagem de fundo do campo com um tempo de exposição suficiente para adquirir pelo menos 5.000 contagens. Esta imagem ajudará na subtração de fundo das imagens não filtradas.

Agora, para adquirir imagens filtradas Gabor do fundo, carregue o script do Gabor Filter Bank no software de controle DMD. Execute todo o script para armazenar os filtros em buffer na memória integrada do DMD. Isso pode levar alguns minutos depois que todo o script for armazenado em buffer.

Use os marcadores de início e parada no software DMD para garantir que apenas um conjunto de filtros corresponda a um filtro Gabor Like seja carregado por vez. Execute o script para adquirir imagens filtradas do plano de fundo. A visualização da imagem ao vivo deve mudar de campo escuro para a imagem filtrada.

Para esse filtro, abra o script de aquisição no laboratório de IP do disco. Ajuste o tempo de exposição para garantir que pelo menos 2000 contagens sejam adquiridas. Enquanto o script DMD está em execução, cancele a visualização ao vivo no laboratório de IP e execute o script de aquisição.

Isso adquirirá automaticamente o índice e salvará a imagem filtrada no disco. Depois que a primeira imagem for adquirida, pare o script em execução no DMD. Exclua os comandos usados do script.

Em seguida, substitua os marcadores de início e parada no início e no final do próximo conjunto de filtros. Repita a aquisição no laboratório IP até que todo o banco de filtros tenha sido usado e todas as imagens filtradas tenham sido adquiridas e salvas. Prepare-se para revestir as células conectando um ferro de solda na bancada do laboratório e aquecendo o L 15 médio a 37 graus Celsius.

Faça uma estação de trabalho com uma toalha de papel e um lenço umedecido para absorver qualquer meio derramado e manter a área limpa. Prepare vários pavios rasgando e girando lenços umedecidos. Os pavios serão usados para puxar o fluido através da placa celular.

Em seguida, use o suporte de amostra de metal para criar um sanduíche de células. Use uma seringa para aplicar um cordão fino de graxa a vácuo ao redor da periferia superior do orifício na placa de metal usinada, estendendo-se até a metade das extremidades das ranhuras de cada lado. Passe suavemente uma lamínula de cobertura número um limpa na graxa.

Vire a placa e aplique a graxa ao redor do orifício. Apague as luzes da sala usando luvas de exame experimental NI esterilizadas com etanol. Recupere as células da incubadora.

Remova a lamínula que será usada para o experimento da placa de seis poços. Seque cuidadosamente a lamínula. Em seguida, pressione a lamínula com o lado da célula voltado para baixo na placa de metal lubrificada sobre o vieworifício

Imprensando as células dentro da placa. Certifique-se de que não haja espaços de ar e que a graxa tenha formado uma vedação à prova d'água para que o meio possa ser carregado. Agora vire a placa de volta pipetando 200 microlitros de cada vez.

Adicione o meio L 15 pré-aquecido no sanduíche através da ranhura entre a lamínula superior e a placa de metal até que o líquido quase atinja a ranhura do outro lado. Em seguida, lave as células segurando um pavio na ranhura oposta e pipetando mais 200 microlitros de meio no sanduíche. O meio fluirá de um lado para o outro à medida que o pavio remove o meio antigo.

Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas no líquido durante esta etapa. Repita este processo duas a três vezes usando um novo pavio para cada enxágue. Agora inverta a placa mais uma vez, apoiando a placa pelas bordas, de modo a reter o líquido no reservatório da célula.

Mergulhe o ferro de solda no copo do veap para derreter rapidamente um pouco do veap, que então se agarrará à ponta do ferro de solda. Usando a ponta do ferro de solda, aplique cuidadosamente a veap de muda ao redor das bordas da lamínula inferior. Continue mergulhando e aplicando em todo o perímetro da lamínula, selando-a na placa de metal.

Isso cria um bom selo mecânico para que a lamínula não se solte da placa enquanto está sendo visualizada. Limpe qualquer resíduo do fundo. Cubra a superfície da lamínula berrando um lenço umedecido e limpando a tampa.

Deslize em um único movimento deslizante para garantir que a lamínula esteja mais limpa no centro onde será visualizada. Retorne a placa de seis paredes para a incubadora. Leve as células revestidas para o laboratório de óptica e monte na objetiva.

Como antes, encontre um campo de células de aparência saudável e adquira uma imagem de campo escuro do campo de visão. Em seguida, alinhe o microscópio em DIC e certifique-se de que os tempos de exposição sejam adequados. Adquira uma imagem DIC com uma câmera em cascata.

Nesta configuração, as imagens fluorescentes são adquiridas usando a câmera SNAP fria enquanto o microscópio ainda está alinhado no DIC. Defina o VAR do microscópio para um x e a janela de visualização para 100% binocular e desvie a imagem da ocular para a câmera. Coloque um LED azul sobre o condensador para iluminar o campo.

Em seguida, visualize o campo de visão na imagem RSS e ajuste o foco fino. Se necessário, adquira uma imagem DIC e salve em disco. Observe como o campo de visão é diferente daquele obtido da câmera em cascata.

Essas imagens terão que ser registradas durante a fase de análise do experimento. Em seguida, mova o cubo do filtro fluorescente para a posição e adquira uma imagem de fluorescência ligando brevemente a excitação de fluorescência usando o obturador do microscópio e, em seguida, desligue-o assim que a aquisição for concluída. Para minimizar o fotobranqueamento, salve a imagem de fluorescência no disco.

Para adquirir imagens filtradas, redefina o microscópio para o campo e envie a luz através da porta LSM. Como antes, execute todo o script do banco de filtros Gabor como antes para concluir a aquisição de dados por um ponto de tempo enquanto as células ainda estão no palco e sem perturbar o campo de visão. Use o método de absorção para trocar o meio L 15 regular pelo mesmo contendo uma solução micromolar de STS.

Durante o curso do experimento, adicione meio adicional para evitar o ressecamento, pipetando o meio na ranhura da placa celular sem removê-lo do estágio ou perturbar o campo de visão. Agora, repita essas etapas para pontos de tempo subsequentes até que o experimento seja concluído. Os dados coletados incluirão um grande número de imagens filtradas que devem ser processadas para extrair os dados estruturais subcelulares.

Aqui são mostrados dois exemplos de experimentos. Esta figura mostra imagens sequenciais de uma amostra de algas diatomáceas marinhas. As características orientadas são claramente visíveis.

Em imagens de campo escuro. As imagens filtradas opticamente rotuladas como cinco igual a zero graus a cinco igual a 160 graus são mostradas ao lado da imagem não filtrada da amostra. Para comparação, o conjunto de nove imagens filtradas por Gabor da diatomácea foi processado pixel a pixel para orientação de objetos.

Em cada pixel, o sinal máximo foi dividido pelo sinal médio em função da orientação do filtro para fornecer um valor de proporção. Aqui, uma proporção próxima à indicada pelo azul está presente em áreas nas quais não há ângulo de resposta preferencial. Valores maiores indicados em vermelho indicam áreas nas quais uma resposta de ângulo preferencial mais alta está presente.

O brilho e o significado do código da resposta total do filtro GANOR, a orientação do filtro, dando o sinal máximo em cada pixel corresponde à direção perpendicular à orientação do objeto subjacente. A orientação da partícula da subestrutura é codificada em um gráfico de aljava onde cada linha concorda intimamente com a orientação do objeto local subjacente visível no campo escuro não filtrado. O gráfico de aljava mostra a orientação de objetos com intensidades de resposta superiores a 10% do máximo.

Essas imagens de campo escuro e opticamente filtradas de um campo continham células endoteliais bovinas vivas, as imagens filtradas foram posteriormente adquiridas a cada 20 minutos por um período de três horas após o tratamento com o indutor de apoptose stor sporin. Aqui, o mapa de proporção no painel superior e a imagem de fluorescência das mitocôndrias no painel inferior são mostrados em função do tempo. A tonalidade da cor representa o grau de orientação, pois antes desses gráficos de tempo comparam a diminuição no grau de orientação da proporção das partículas em células endoteliais tratadas com s thoro sporin, os traços individuais representam gráficos de tempo dentro de células individuais.

A orientação drop-in está confinada às regiões das células que se registram com regiões fluorescentes. Agora, a validação contra a fluorescência foi alcançada. Torna-se arquivamento.

Assim, nos próximos experimentos, as medições mitocondriais podem ser feitas omitindo as etapas de imagem de fluorescência e usando diretamente o método de dispersão óptica. Acabamos de mostrar como monitorar a fragmentação mitocondrial durante a apoptose usando assinaturas de espalhamento de luz com base em filtros Gabor. Ao fazer este procedimento, é importante ter uma boa preparação para o estilo de vida e garantir que a configuração óptica esteja bem alinhada e calibrada.

Então, vamos ter sentido para assistir e CoLab com experimentos de interface do usuário.