Name: Linearização do Ensaio de Proteína Bradford (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprenda a linearizar o ensaio de Bradford para quantificação proteica com maior precisão e sensibilidade. Este método melhora a exatidão das medições de concentração de proteínas em amostras biológicas.

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Este artigo é dedicado à memória do falecido Dr. Zvi Selinger, que sediou a pesquisa original descreveu aqui.

Linearização da curva de calibração Protein Bradford: O ensaio de proteína Coomassie azul brilhante, vulgarmente conhecido como o ensaio de Bradford 1, é amplamente utilizado devido ao seu protocolo rápida e conveniente, bem como a sua sensibilidade relativa. Infelizmente, não há um grande grau de curvatura sobre uma ampla gama de concentrações de proteína (Fig. 1). Portanto, somente uma estreita faixa de concentrações de proteína relativamente alto, 2-10 mg / ml BSA, é usado para o gráfico de calibração, que então se encaixa melhor regressão linear (Fig. 1, verde). No entanto, a não-linearidade exige concentração de proteína das amostras desconhecidas para cair dentro da faixa limitada do gráfico de calibração, a fim de evitar um grande erro, e também reduz a precisão dentro da faixa limitada. A não-linearidade apresenta um sério problema em particular quando as quantias microgramas de proteínas não estão disponíveis, e que muitas vezes requer várias diluições das amostras desconhecidas. Como observado no papel Bradford original, "a fonte da não-linearidade é o reagente em si uma vez que há uma sobreposição no espectro das duas formas de cores diferentes do corante." 1. Na verdade, três formas de o corante Coomassie azul brilhante estão em equilíbrio ácido-base no pH ácido usual do ensaio 2. Os formulários de vermelho, azul e verde têm absorbância maxima de 470, 590 e 650 nm, respectivamente (Fig. 2). O azul é a forma que se liga a proteínas, formando um complexo que absorve a luz intensa em 594 nm 3, 4 (Fig. 2). Bradford também observou que "o valor de fundo para o reagente está continuamente diminuindo à medida que mais corante é ligada à proteína" 1 (Fig. 3). Portanto, buscou-se calcular a redução do fundo nm 590 como quantidades de proteína crescente são adicionados, medindo a variação de absorvância a 450 nm, onde o complexo proteína-corante não absorve. Nós descobrimos que o fundo diminuindo parcialmente, mas não totalmente, as contas para a não-linearidade (Fig. 4). Em seguida, a hipótese de que a diminuição da concentração de corante livre produz outra distorção da resposta linear, porque como proteínas dye-binding está em equilíbrio 5, a formação do complexo não depende apenas da concentração da proteína livre, mas também na da tintura livre (Fig. 5). Tendo em conta as questões relacionadas com a concentração variável do corante livre, nós desenvolvemos uma equação matemática que descreve uma relação linear entre a concentração de proteína ea relação de medidas de absorbância, 590 nm mais de 450 nm (Fig. 6). Uma descrição detalhada do estudo teórico e experimental podem ser encontrados em nossa publicação de 1996, em Analytical Biochemistry 6. A equação matemática foi experimentalmente testado e está a produzir uma curva de calibração linear em toda a faixa concentrações de proteína (Fig. 7). Além disso, a equação foi validada também por uma determinação independente do valor do pH-dependente correta da interceptação do eixo Y 6. Protocolo detalhado para o ensaio Melhor Proteína Bradford, utilizando um leitor de Absorbância Microplaca: <ol><li> Prepare uma solução estoque 0,1 mg / ml do padrão, albumina de soro bovino. Qualquer outra norma pode ser escolhido, mas note que o mesmo padrão deve ser utilizado em todos os experimentos. </li><li> Diluir as amostras desconhecidas em água deionizada. Objetivo de 50-50 mcg / ml. No entanto, as concentrações de proteína maior ou menor são aceitáveis, já que não há limite aparente para o intervalo linear do ensaio. No entanto, a medição deve estar dentro da faixa linear do leitor absorbância. </li><li> Diluir o reagente de Bradford (Bio-Rad) de 2,5 vezes em água deionizada. </li><li> Adicionar 0 e 10-50 mL de solução estoque de BSA poços triplicado (criação de uma curva de calibração 0-5 mg BSA). Complementar com água deionizada para alcançar 100 l / poço. </li><li> Em poços diferentes, adicione 100 ml da amostra desconhecida em triplicatas. Várias concentrações da amostra desconhecida pode ser usado para aumentar a precisão. </li><li> Adicionar 100 ul do reagente de Bradford diluído para todos os poços. Volume total é de 200 mL / poço. </li><li> Espere pelo menos 5 min, mas não mais de 60 min para o desenvolvimento de cor. </li><li> O branco deve ser de 200 mL de água deionizada (e não o corante de proteínas de zero também). </li><li> Medir a absorvância a 590 nm e 450 nm. </li><li> Prepare uma curva de calibração, dividindo os valores de absorbância líquida a 590 nm e 450 nm. Note-se que a proteína zero (corante apenas) o valor deve ser incluído como um ponto de dados (Fig. 8). </li><li> Calcular a concentração da amostra desconhecida com base na equação linear da curva de calibração (Fig. 9). </li></ol> Resultados representativos: Ao contrário da absorvância a um único comprimento de onda de 590 nm, a proporção de valores de absorbância, 590 nm mais de 450 nm, é linear wconcentração de proteína i (Fig. 10). A concentração de proteína da amostra desconhecida pode ser simplesmente calculado usando a equação linear da curva de calibração (Fig. 10, a equação). No entanto, uma maior precisão é obtida através da medição várias diluições de amostras desconhecidas. Para este efeito, prepare dois gráficos. O primeiro é um gráfico de calibração para o padrão com proteína mg no eixo X (Fig. 11, direita). O segundo gráfico é para a amostra desconhecida, com mL da amostra original não diluído no eixo X (Fig. 11, à esquerda). O valor da tintura só devem ser incluídos em ambos os gráficos (Fig. 11). A concentração de proteína da amostra desconhecida é derivado dividindo as pistas da amostra desconhecida e do padrão (Fig. 11, a equação). <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Gráfico de calibração convencional Bradford. A faixa linear é representado por símbolos verdes. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Spectra do complexo proteína-corante e do corante sozinho. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Protein equilíbrio dye. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Redução do fundo correta calculada diminui parcialmente não-linearidade. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Protein dye-equilíbrio. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Base matemática para a linearização do ensaio de proteína Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Linearização da curva de calibração Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Cálculo dos valores de absorbância relação. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. A curva de calibração linear Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" alt="Figura 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 10"> Figura 10. Linearização da curva de calibração Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" alt="Figura 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 11"> Figura 11. Cálculo da amostra concentração Desconhecido.

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

O ensaio de proteína Bradford é popular devido à sua facilidade de desempenho e de sensibilidade relativa. A linearização sobre as concentrações de proteína toda a gama obtidos pelo protocolo aqui apresentado simplifica ainda mais o ensaio, como amostras desconhecidas não precisa estar dentro do intervalo da curva de calibração. Importante, o protocolo prevê ainda melhorou as seguintes vantagens sobre o original Bradford protocolo: <ol><li> Maior precisão. </li><li> A sensibilidade é aum...

<table><tbody><tr><td>Reagente de Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Sérica Bovina</td><td>Amersco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de absorbância multibem</td><td>BioTek</td><td>Synergy2</td><td></td></tr></tbody></table>

linearização do ensaio de proteína bradford

Linearization of the Bradford Protein Assay

Determinação das quantidades microgramas de proteína no ensaio Bradford Coomassie azul brilhante é realizado pela medição da absorbância a 590 nm. Este ensaio mais comum permite a quantificação de proteínas rápidas e simples em lisados ​​celulares, frações celulares, ou amostras de proteínas recombinantes, com a finalidade de normalização das dosagens bioquímicas. No entanto, uma não-linearidade intrínseca compromete a sensibilidade e precisão deste método. É mostrado que, sob condições de ensaio padrão, a relação entre as medidas de absorbância a 590 nm e 450 nm é estritamente linear com a concentração de proteína. Este simples procedimento aumenta a precisão e melhora a sensibilidade do ensaio cerca de 10 vezes quantificação, permitindo até 50 ng de albumina bovina. Além disso, a interferência comumente introduzidas por detergentes que são utilizados para criar a lisados ​​celulares é muito reduzida pelo novo protocolo. Uma equação linear desenvolvido com base em ação de massa e lei de Beer se encaixa perfeitamente os dados experimentais.

A precisão e sensibilidade da determinação de proteína pelo ensaio Bradford rápida e conveniente é comprometida pela não-linearidade intrínseca. Nós mostramos um procedimento de linearização simples que aumenta a precisão, melhora a sensibilidade do ensaio cerca de 10 vezes, e reduz significativamente a interferência por detergentes.

Linearização do Ensaio de Proteína Bradford

A determinação de quantidades de proteína na ordem de microgramas no ensaio de Bradford com Coomassie brilliant blue é realizada através da medição da absorbância a 590 nm.

O ensaio de proteína de Bradford começa com a adição de um padrão de BSA em quantidades crescentes e diluições de uma amostra desconhecida em uma placa de 96 poços, sendo adicionada água desionizada para completar o volume variável. O reagente de Bradford é então adicionado a todos os poços, exceto ao branco, que deve conter apenas água após cinco minutos. A absorbância é lida em 590 nanômetros para a detecção do complexo corante-proteína e em 450 nanômetros.Para a linearização do gráfico, a razão entre os valores de absorbância em 590 nanômetros e em 450 nanômetros é estritamente linear com a quantidade de proteína. Olá, sou do Departamento de Bioquímica da Universidade de Tel Aviv, de Israel, sou ou T do laboratório. Hoje vamos mostrar a vocês um procedimento para determinar a concentração de proteína utilizando um protocolo Bradford Linearizado aprimorado.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para normalizar a quantidade de proteína em SZaS, por exemplo, antes de carregarmos os géis. Vamos começar. No ensaio de Bradford, três formas do corante azul brilhante Kumasi estão em equilíbrio ácido-base no pH ácido habitual do ensaio.As formas vermelha, azul e verde apresentam máximos de absorção em 470, 590 e 650 nanômetros, respectivamente. A forma azul é aquela que se liga à proteína, formando um complexo que absorve intensamente a luz em 594 nanômetros. Este ensaio amplamente utilizado apresenta um alto grau de curvatura em uma ampla faixa de concentrações proteicas.Portanto, apenas uma faixa estreita de concentrações relativamente altas de proteína é utilizada para o gráfico de calibração, o que resulta em um melhor ajuste à regressão linear. Uma das causas da não linearidade é a absorbância em 590 nanômetros do corante livre, que diminui à medida que quantidades crescentes de proteína são adicionadas. A não linearidade é parcialmente reduzida mediante a medição da variação da absorbância em 450 nanômetros, onde a própria dieta, mas não o complexo proteína-corante, absorve.E, ao reduzir o branco corretamente calculado, a diminuição na concentração de corante livre produz outra distorção da resposta linear, pois, como a ligação do corante à proteína está em equilíbrio, a formação do complexo depende não apenas da concentração da proteína livre, mas também da concentração do corante livre. Levando em conta ambas as questões relacionadas à concentração variável do corante livre, foi desenvolvida uma equação matemática que descreve uma relação linear entre a concentração da proteína e a razão entre as medidas de absorbância em 590 nanômetros e 450 nanômetros.A equação matemática foi testada experimentalmente e demonstrou gerar uma curva de calibração linear em toda a faixa de concentração proteica. Para começar, prepare uma solução de 0,1 miligrama por mililitro do padrão de albumina sérica bovina. Pode-se escolher qualquer outro padrão, mas observe que o mesmo padrão deve ser utilizado em todos os experimentos.Dilua as amostras desconhecidas em água desionizada. Pretenda cinco a 50 microgramas por mililitro, embora concentrações proteicas mais altas ou mais baixas sejam aceitáveis, já que não há limite aparente para a faixa linear do ensaio. Observe, no entanto, que a medição deve estar dentro da faixa linear do leitor de absorbância.Também dilua o reagente de Bradford 2,5 vezes em água desionizada. Em seguida, adicione zero e de cinco a 50 microlitros da solução estoque de BSA em poços triplicados de uma placa de 96 poços para criar uma curva de calibração de zero a cinco microgramas de BSA, completando com água desionizada até atingir 100 microlitros por poço em poços diferentes. Com 100 microlitros da amostra desconhecida em triplicata, várias concentrações da amostra desconhecida podem ser utilizadas para aumentar a precisão.Por fim, adicione 100 microlitros do reagente de Bradford diluído a todas as poças. O volume total é de 200 microlitros por poça. Prepare também um branco para a medição da absorbância.Isso deve ser 200 microlitros de água desionizada e não o corante sem proteína. Aguarde pelo menos cinco minutos, mas não mais que 60 minutos, para o desenvolvimento da cor.Prossiga para medir a absorbância em 590 nanômetros e em 450 nanômetros. Lembre-se de usar água para a medida do branco. Prepare um gráfico de calibração dividindo os valores de absorbância líquida em 590 nanômetros e em 450 nanômetros.Observe que o valor zero de proteína deve ser incluído como um ponto de dados. Calcule a concentração da amostra desconhecida com base na equação linear da curva de calibração. Diferentemente da absorbância em um único comprimento de onda de 590 nanômetros, a razão entre os valores de absorbância em 590 nanômetros e 450 nanômetros é linear em relação à concentração de proteína.A concentração da proteína na amostra desconhecida pode ser simplesmente calculada utilizando a equação linear da curva de calibração. No entanto, obtém-se maior precisão ao medir várias diluições da amostra desconhecida. Para tanto, prepare dois gráficos.O primeiro é um gráfico de calibração para o padrão, com microgramas de proteína no eixo x. O segundo gráfico é para a amostra desconhecida, com microlitros da amostra original não diluída no eixo x. O valor apenas do corante deve ser incluído em ambos os gráficos.A concentração da proteína na amostra desconhecida é obtida dividindo-se as inclinações da amostra desconhecida e do padrão. Acabamos de mostrar como medir a concentração de proteína utilizando um protocolo linearizado aprimorado de Bradford. Utilizar este procedimento aumenta significativamente a precisão do ensaio, melhora a sensibilidade cerca de 10 vezes e reduz substancialmente a interferência por detergentes ao realizar este procedimento.É importante lembrar de usar o branco apropriado, que é a água, em vez da amostra de corante sem proteína. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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