Name: Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a gerar embriões quiméricos de zebrafish para imagem ao vivo do desenvolvimento da retina e cérebro usando blastômeros marcados com GFP. Este método permite rastrear células geneticamente alteradas em contexto normal.

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Este estudo foi apoiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Core Grant (5P30EY008098) e os fundos a seguir para XW: Grant NIH R01EY016099 e Pesquisa para prevenir a cegueira Prêmio de Desenvolvimento de Carreira. Agradecemos a Lathrop Kira de assistência em imagem confocal.

Dia 1. Preparação 1. Configurar atravessa peixes Configurar cruza pairwise de peixe-zebra da noite. Para evitar acasalamento ao acaso antes do tempo desejado, use divisórias para separar o peixe do sexo feminino e masculino nas cassetes de acasalamento. Expressando GFP-peixes transgénicos são usados ​​como fonte de blastômeros doador. A linhagem transgênica pt104 (Zou et al., 2008), usado aqui, expressa ubiquitously GFP sob o controle do promotor EF1. Expressão GFP permite a visualização de células do doador por imagem ao vivo. Outras linhas de peixes transgénicos que expressam proteínas fluorescentes adequado pode ser usado para necessidades específicas. 2. Prepare em forma de cunha agarose poços para a realização de embrião Despeje derretido agarose 1%, preparada em água do ovo E3 (Westerfield, 2007), em uma placa de Petri. Float um molde de plástico que tem saliências em forma de cunha na solução de agarose e deixar a solução de agarose completamente solidificar. Remover o molde com cuidado e coloque a cama agarose com água E3. 3. Prepare agulhas transplante Use um extrator de agulhas vertical (David KOPF Instruments) com potência 11,5 configuração para fazer agulhas, puxando pipetas de vidro capilar (Instrumento de precisão Mundial). Dicas agulha bom deve taper com eixos de comprimento. Moer as dicas agulha em um ângulo de 45 graus com uma Grinder Micro (Marishige) até aberturas chanfradas de 40-45μm de diâmetro interno são obtidos (Fig. 1A). Para limpar as pontas de agulhas, anexar uma mangueira até o fim brusco da agulha, conectar a mangueira a uma seringa, e então absorver e liberar uma solução de ácido fluorídrico 10% até que todo o entulho é removido. Em seguida, lave as pontas com água destilada, seguido pelo etanol 100%. Secar as agulhas até que todos evapora etanol. É importante assegurar que as pontas estão completamente secos: etanol residual vai arruinar as agulhas durante a etapa de polimento de alta temperatura. Para suavizar e polonês as arestas das pontas de agulha, coza as pontas da agulha com o calor gerado pelo filamento de uma Forger Micro (Marishige). Não deixe que as pontas de agulha toque o filamento durante o polimento. A quantidade de eletricidade passando através do filamento ea distância entre o filamento e as pontas da agulha pode ser ajustado para obtenção de condições de aquecimento desejada. A temperatura não deve ser muito alto: isto irá derreter e deformar as pontas da agulha. Após as arestas são suavizadas, cuidadosamente tocar o filamento aquecido com a ponta da agulha e puxe o filamento longe da agulha para gerar uma extremidade pontiaguda (Figura 1B). Uma agulha fina, lisa e limpa é fundamental para a obtenção de blastômeros doador intacta e para não danificar os embriões host. 4. Prepare uma sonda de embrião de posicionamento Puxe uma pipeta de vidro sobre uma chama de gás para obter uma sonda de vidro fino com uma extremidade smoothened. Esta sonda será usado para posicionar os embriões na orientação correta antes do transplante. Dia 2. Blastômero transplante 1. Coletar e embriões dechorionate No dia seguinte, retire os divisores com os cassetes de cruz para permitir que os peixes mate. Coloque os embriões em placas de Petri com água E3. Então, os embriões dechorionate manualmente arrancando o córions dos embriões com um par de fórceps bem. Use uma pipeta de vidro com haste inclinou-se para transferir cuidadosamente os embriões dechorionated em agarose poços. Evitar qualquer contato dos embriões com o ar, que causam os embriões para estourar. Deixe os embriões se desenvolvem em 28.5 ° C nos poços agarose até 3 horas após a fecundação, ou hpf. 2. Criar um aparelho de transplante Enquanto os embriões se desenvolvem, configurar um aparelho de transplante, ligando a agulha para o transplante mineral oil-filled sistema de micro-bombeamento. Certifique-se que o sistema não vaza e não bolhas de ar estão presos no sistema. Voltar preencher a agulha transplante inteiro com óleo mineral, com exceção do 0,5-1 mL de espaço na abertura da ponta. 3. Transplante de blastômeros Para transplante de blastômeros, use uma sonda de posicionamento de vidro para orientar o lado blastômero de embriões 3-4-hpf para cima. Então, gentilmente inserir a agulha em um transplante de embrião doador e, lentamente, sugar até 20/05 blastômeros na agulha. Inserir a agulha blastômero cheio em um embrião hospedeiro e solte o blastômeros lentamente. O local em que os blastômeros são liberados irá influenciar em sua progênie localizar em fases posteriores de desenvolvimento. Para analisar o desenvolvimento da retina e do cérebro, as células de liberação no pólo animal. Durante o transplante, certifique-se que a ponta da agulha não contato com o ar. Para minimizar danos mecânicos, embriões de acolhimento deve ser deixado nos poços agarose a 28,5 ° C até o dia seguinte. Então, tRANSFERÊNCIA os embriões mosaico para placas de 24 poços pré-revestidos com 0,5 ml de agarose 1%, com um embrião em cada poço. 1 ml de água do ovo E3 é adicionada a cada poço. Para evitar infecções bacterianas, adicione 10 ml de 100X penicilina e estreptomicina para a água de ovo E3. Dia 3. Incorporação e imagens ao vivo de embriões mosaico 1. Embriões incorporação Prepare 1,5% baixo ponto de fusão de agarose (LMP) em água de ovo E3 e manter a solução em banho-maria a 30 ° C. Transferência de um embrião de mosaico para um prato FluoroDish cultura de tecidos com um fundo de vidro de 0,17 milímetros de espessura (Instrumentos de Precisão Mundial). Retirar a água em excesso E3 para deixar o embrião apenas coberto por uma quantidade mínima de E3. Adicionar 30-50 LMP derretido mL de 1,5% para o embrião. Rapidamente a posição do olho ou o cérebro mais próximo possível do fundo de vidro quanto possível antes de a solução de agarose solidifica. Depois que a solução esfria, adicione a solução de agarose adicionais para proteger ainda mais os embriões no lugar. Em seguida, mergulhe a solidificou agarose bloco com 2-3 ml de água do ovo E3. 2. Imagem confocal Para microscopia confocal, um objetivo imersão em água invertido (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japão) com uma profundidade grande foco é usado. Uma gota de água é adicionada para o objetivo e em seguida, coloque uma placa de cultura de tecidos FluoroDish no objectivo. Para o desenvolvimento da imagem, execute lapso de tempo de imagem por tirar fotos dos embriões a cada 5 minutos. Dependendo da natureza dos experimentos, os intervalos de tempo entre os disparos devem ser ajustados. Resultados representativos A figura 2 ilustra um representante 24 hpf zebrafish mosaico. Expressão GFP destaca as células do doador em verde. As células da retina neuroepiteliais abrangem toda a espessura da parede da retina. O filme mostra os movimentos de células do doador no cérebro anfitrião em 24 hpf. Morfologias células notificação de mudança ao longo do tempo. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Formas das pontas de agulha transplante. A. A abertura chanfrada da ponta de uma agulha estava livre de detritos após lavagens ácido fluorídrico. B. A extremidade pontiaguda foi gerada na ponta da agulha. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Visualização de GFP-expressando células do doador em uma embriões quiméricos zebrafish menos 24 hpf. O painel esquerdo mostra os sinais de GFP no cérebro e retina. O painel do meio é uma imagem de campo claro do embrião. O painel da direita mostra a imagem mesclada. Filme 1. Vivo de imagem de células do doador GFP positivos demonstraram a grandes mudanças na morfologia do cérebro de células gliais durante o desenvolvimento. Os quadros individuais do filme foram coletados a cada 5 minutos entre 24 e 25 hpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">Clique aqui para ver o filme</a> .

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

Neste vídeo, demonstramos um método para blastômero transplante para analisar o desenvolvimento da retina e do cérebro em zebrafish. Este protocolo também pode ser usado para analisar o desenvolvimento de outros tecidos e órgãos, simplesmente liberando a blastômeros de doadores para os locais correspondentes nos embriões host. A rotulagem com as moléculas de GFP rende um aspirador de fundo do que a marcação com corante fluorescente conjugada Dextran (Ho e Kane, 1990). Isto é porque os restos de tintas Dextran a partir d...

E3 água ovo: <ul><li> 5 mM NaCl </li><li> 0,17 mM KCl </li><li> 0,33 mM CaCl 2 </li><li> 0,33 mM MgSO 4 </li><li> Azul de metileno 0,1% </li></ul>

transplante de gfp-expressando blastômeros for imaging ao vivo de desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões zebrafish quimérico

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Células mudam extensivamente em seus locais e dos bens durante a embriogênese. Essas alterações são reguladas pelas interações entre as células e seu meio ambiente. Embriões quiméricos, que são compostas de células de fundo genético diferente, são ótimas ferramentas para estudar as interações célula-célula mediada por genes de interesse. A transparência embrionário de zebrafish em fases iniciais de desenvolvimento permite a visualização direta da morfogênese de tecidos e órgãos em nível celular. Aqui, nós demonstramos um protocolo para gerar retinas quimérico e cérebros em embriões de peixe-zebra e para realizar imagens ao vivo das células do doador. O protocolo abrange a preparação de agulhas transplante, o transplante de GFP-expressando blastômeros doadores para GFP-negativos hosts, eo exame do comportamento dos doadores de células sob microscopia confocal ao vivo. Com pequenas modificações, este protocolo também pode ser usado para estudar o desenvolvimento embrionário de outros tecidos e órgãos em peixes-zebra. As vantagens de usar a GFP para as células do doador rótulo também são discutidos.

Demonstramos um protocolo para gerar embriões quiméricos zebrafish para o comportamento imagens ao vivo do celular durante a embriogênese.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

As células sofrem mudanças extensas em suas localizações e propriedades durante a embriogênese. Essas mudanças são reguladas pelas interações entre as células e seu...

Blairs são as células embrionárias formadas durante a fase de clivagem do desenvolvimento. Aqui, Blairs marcados com GFP são transferidos de um embrião de peixe-zebra para outro utilizando uma agulha de transplante. Este método permite acompanhar, por meio de imagem microscópica em tempo real, o comportamento e o destino de blasfemadores com fundos genéticos alterados em um embrião de desenvolvimento normal, ou vice-versa.Olá, sou o Dr. Zoran, do laboratório da Dra. Shawe, do Departamento de Oftalmologia da Universidade de Pittsburgh. Hoje vamos mostrar um procedimento para transporte de mielação mamária em embriões de peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o desenvolvimento da retina e do cérebro.Então vamos começar. À noite, realize cruzamentos aos pares de peixes-zebra para evitar acasalamento aleatório. Antes do horário desejado, use divisórias para separar os peixes fêmeas dos machos. Aqui.Peixes transgênicos que expressam GFP são utilizados como fonte de blastômeros doadores. A linhagem transgênica PT 1 0 4 expressa GFP de forma ubíqua sob o controle do promotor EF one para preparar os poços de agarose. Despeje 1% de agarose derretida preparada em água de ovo E3 em uma placa de Petri para conter os embriões. Coloque uma molde plástico com projeções em forma de cunha sobre a solução de agarose.Em seguida, deixe esfriar. Para solidificar cuidadosamente, remova o molde e imerja o leito de agros na água E3. A seguir, prepare as agulhas de transplante.Utilize um puxador de agulhas vertical no nível de potência 11,5 para puxar pipetas capilares de vidro. As pontas de agulha adequadas devem apresentar um afilamento com hastes longas. Afine as pontas das agulhas em um ângulo de 45 graus com um microafinador até obter aberturas biseladas com diâmetro interno entre 30 e 40 micrômetros.Para limpar as pontas das agulhas, acople uma mangueira à extremidade romba, conecte a mangueira a uma seringa e aspire e libere uma solução de ácido fluorídrico a 10%. Repita até que todos os detritos visíveis sejam removidos. Lave as pontas com água destilada.Em seguida, com etanol a 100%, seque as agulhas ao ar até que todo o etanol evapore. É importante garantir que as pontas estejam completamente secas. O etanol residual estragará as agulhas durante o polimento em alta temperatura.Passo dois, para suavizar e polir as bordas irregulares das pontas da agulha, aqueça-as com o calor gerado pelo filamento de um micro-forjador. Não permita que as pontas da agulha toquem o filamento durante a polimento, ajustando a quantidade de eletricidade que passa pelo filamento e a distância entre o filamento e a agulha. As pontas podem ser ajustadas para alcançar as condições desejadas de aquecimento.A temperatura não deve ser muito alta. Isso derreterá e deformará as pontas das agulhas após o alisamento das bordas irregulares. Toque cuidadosamente o filamento aquecido com a ponta da agulha e, em seguida, puxe suavemente o filamento para gerar uma extremidade pontiaguda.Uma agulha afiada, lisa e limpa é essencial para obter blastômeros doadores intactos sem danificar os embriões hospedeiros. Puxe uma pipeta de vidro sobre uma chama de gás para fabricar uma sonda de vidro fina com a extremidade suavizada. Esta sonda será usada para posicionar os embriões na orientação adequada antes do transplante.No dia do experimento, remova as divisórias nas caixas cruzadas para permitir que os peixes acasalem. Oito. Após 30 minutos, colete de 100 a 200 embriões despejando-os em uma peneira. Coloque os embriões em uma placa de Petri contendo água E3.Em seguida, utilizando pinças finas, decote os embriões rasgando manualmente as CORs. Depois, use uma pipeta de vidro com haste curvada para transferir cuidadosamente os embriões revestidos para poços de aros. Não permita que os embriões entrem em contato com o ar, pois isso fará com que eles estourem.Deixe os embriões se desenvolverem a 28,5 graus Celsius nos poços de aros até três horas após a fertilização ou HAF, enquanto os embriões se desenvolvem. Monte um aparato de transplante conectando a agulha de transplante a um sistema de microbombeamento contendo óleo mineral. Certifique-se de que o sistema não tenha vazamentos e não apresente bolhas de ar aprisionadas.Complete toda a agulha de transplante com óleo mineral, exceto pelo espaço de 0,5 a um microlitro na abertura da ponta. Retire os embriões do incubador e coloque-os sobre a platina de um microscópio para transplantar o blastóporo. Use uma sonda de posicionamento de vidro para orientar o lado do blastóporo dos embriões de três a quatro HPF para cima.Em seguida, insira suavemente a agulha de transplante em um embrião doador e aspire lentamente de cinco a vinte blasfêmios para dentro da agulha, certificando-se de que a ponta da agulha não entre em contato com o ar durante o transplante. Insira a agulha contendo os blasfêmios em um embrião hospedeiro e libere os blasfêmios lentamente. O local onde os blasfêmios são liberados influenciará o posicionamento de suas células-filhas em estágios posteriores do desenvolvimento; para analisar o desenvolvimento da retina e do cérebro, libere as células no polo animal.Se o desenvolvimento de outros tecidos e órgãos for analisado, diferentes locais de liberação devem ser considerados adequadamente. Para minimizar danos mecânicos durante o transplante, os embriões receptores permanecem nas cavidades de agros a 28,5 graus Celsius até o dia seguinte. Em seguida, transfira os embriões mosaicados para placas de 24 poços previamente revestidas com 0,5 mililitros de aros 1% e preenchidas com um mililitro de água de ovo E3.Um embrião deve ser adicionado a cada poço para prevenir infecções bacterianas com 10 microlitros de penicilina e estreptomicina a 100x. A cada poço, pese e prepare agarose de ponto de fusão baixa ou LMP e mantenha a solução em banho-maria a 30 graus Celsius. Transfira um embrião mosaico para um recipiente flora com fundo de vidro de espessura de 0,17 milímetro.Remova qualquer excesso de água E3 para deixar o embrião apenas coberto. Em seguida, adicione rapidamente 30 a 50 microlitros de LMP 1,5% fundido ao embrião antes que a solução de ARO solidifique. Posicione o olho ou o cérebro o mais próximo possível do fundo de vidro.Após a solução esfriar, adicione solução de agarose adicional para fixar ainda mais os embriões no lugar. Mergulhe o bloco de agarose solidificado em dois a três mililitros de água de ovo E3 para microscopia confocal. Utiliza-se uma objetiva invertida de imersão em água 40x com grande profundidade de foco.Adicione uma gota de água sobre a objetiva e coloque um recipiente de cultura de tecidos tipo flora dish na platina, focando para o desenvolvimento da imagem. Realize a aquisição de imagens com lapso de tempo capturando fotografias dos embriões a cada cinco minutos. Dependendo da natureza dos experimentos, os intervalos de tempo entre as imagens podem ser ajustados.Aqui é apresentada uma imagem representativa de um peixe-sebra de 24 HPF. A expressão de GFP destaca as células doadoras em verde. As células neuroepiteliais da retina percorrem toda a espessura da parede retiniana.Este vídeo mostra os movimentos das células doadoras no cérebro do hospedeiro aos 24 HPF. Observe como as morfologias celulares mudam ao longo do tempo. Apenas mostre como realizar o transporte espelhado da mama em peixe-zebra.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar uma boa agulha na área do seio destinada ao transplante com delicadeza. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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