Name: Extensão Proboscis Response Assay (PER) em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 28 min 40 s
Description: Aprenda o ensaio de resposta de extensão da probóscide (PER) em Drosophila para estudar comportamento gustativo e preferências alimentares em insetos. Este método demonstra como substâncias atraentes induzem a extensão da probóscide.

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Agradecemos a Paul Graham para servir como um homem da câmera na apresentação de vídeo.

Fome <ol><li> Primeiro, morrer de fome a voar. </li><li> Coloque um pequeno pedaço de Kim-wipe encharcada com água em um tubo vazio. </li><li> Transferência de 20-30 bem alimentados voa para o frasco vazio. </li><li> Verifique a cada 12 -24 horas para fazer se o papel está úmido. </li><li> Fome a voar por 36-72 horas. </li></ol> Fix the fly <ol><li> Tome uma mosca em um aspirador. </li><li> Coloque uma ponta de 200 mL amarela sobre a abertura. Simultaneamente lançando e soprando sobre ele, você pode espremer a voar para a ponta amarela. </li><li> Aplicar suavemente um pouco de ar para empurrar a voar até um ponto onde ele não pode se mover. </li><li> Usando uma navalha, colocar uma marca de cerca de olho da mosca, em seguida, sugar a voar de volta e cortou a ponta. </li><li> Suavemente soprar a voar de volta para a posição, mas apenas antes de chegar ao fim, faça um corte inclinado na posição em que a tromba vai ser localizado. Você pode fazer sem este corte viés, mas com certeza gostaria de fazer o seguinte processo mais fácil. </li></ol> Prepare pavios sacarose <ol><li> Torça uma faixa de 6 mm de largura Kimwipes ® papel em um thread, e separe em pedaços pequenos de pavio cone-like forma (&lt;1 cm). </li><li> Essas mechas pequenas foram mergulhados em soluções de sacarose ou água e apresentado ao proboscis fazendo o contato. </li></ol> Prepare os controles e animais experimentais <ol><li> Antes de testar qualquer tastants, dar uma solução de sacarose 4% para a mosca. Isto age como um controle positivo. Descartar qualquer mosca que não respondeu. </li><li> Em seguida, teste dH 2 0 na mosca. Este ato como um controle negativo. Descartar a voar se o fez responder. </li><li> Testar esses controles depois de testar o seu tastants. </li></ol>

<ol><li>Dethier, V. G. The Hungry Fly. , Harvard University Press. Cambridge. (1976).</li>
</ol>

Nesta apresentação, nós passamos por todas as etapas para Proboscis ensaio de resposta de extensão. O método parece muito simples, mas como em muitos ensaios outro comportamento, muitas coisas pequenas podem impedir que o ensaio de trabalhar. Nós já passamos por diversas etapas que necessitam de atenção especial. Aqui, eu enfatizar alguns dos fatores mais importantes. Um desses fatores é a forma do pavio. Eu tenho mostrado alguns dos exemplos muito bons, mas é claro que, na realidade, tudo seria um espectro contínuo entre muito bom ...

<table><tbody><tr><td>HDR-HC1</td><td>Câmera</td><td>Sony Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ800</td><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-IBSS</td><td>Adaptador de câmera</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DC10LN</td><td>Adaptador de câmera</td><td>Optem, Qioptiq Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>257010</td><td>Adaptador de câmera</td><td>Optem, Qioptiq Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TREKKER Mk2</td><td>Trípode</td><td>BENBO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gorillapod SLR</td><td>Trípode</td><td>Joby</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMac G5</td><td>Computador</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power Mac G5</td><td>Computador</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie</td><td>Software</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPEG Streamclip</td><td>Software</td><td>SQUARED 5</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

extensão proboscis response assay (per) em drosophila

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis resposta extensão (PER) é um ensaio de comportamento gosto que tem sido utilizado em moscas, bem como em abelhas. Sobre a superfície da boca da mosca (labelo), existem cabelo-como estruturas chamadas sensilla que abriga neurônios gosto. Quando uma substância atraente faz contato com o labelo, a mosca estende sua tromba para consumir o material. Extensão Proboscis Response ensaio (PER) mede a resposta comportamento, gosto e é um método útil para aprender sobre as preferências alimentares em uma única mosca. Soluções dos vários açúcares, como sacarose, glicose e frutose, são muito atraentes para a mosca. O efeito de substâncias aversivo também pode ser testada como a redução do PER, quando misturado em uma solução doce. Apesar da simplicidade do procedimento básico, existem muitas coisas que podem impedi-lo de trabalhar. Um dos fatores que requer atenção é o estado de resposta da mosca. O tempo necessário para trazer a fome a voar para o estado adequado de resposta varia drasticamente de 36 a 72 horas. Nós estabelecemos uma série de controles para avaliar o estado da mosca e que permite a triagem de não-responsivos ou hiper-sensíveis animais individuais. Outro fator importante é o nível de impacto ea posição do contato com o labelo, que seria difícil descrever com palavras. Esta apresentação em vídeo demonstra todos juntos estes com várias outras melhorias que poderiam aumentar a reprodutibilidade deste método.

Proboscis resposta extensão ou PER é um ensaio de comportamento gosto que tem sido utilizado em moscas, bem como em abelhas. Quando a tromba faz contato com uma substância atrativa, a mosca estende sua tromba para consumir a substância. Soluções dos vários açúcares, são muito atraentes para a mosca.

Extensão Proboscis Response Assay (PER) em Drosophila

A resposta de extensão da probóscide (PER) é um ensaio de comportamento gustativo que tem sido utilizado tanto em moscas quanto em abelhas melíferas.
Na superfície da boca da mosca...

Olá. Nesta apresentação, gostaríamos de mostrar como realizar o ensaio de resposta de extensão do probóscide em esôfago. A resposta de extensão do probóscide, ou PER, é um ensaio de comportamento gustativo utilizado em moscas e também em abelhas melíferas. Quando o probóscide entra em contato com uma substância atrativa, a mosca o estende para consumir a substância.Soluções de vários açúcares, como sacarose, glicose e frutose, são muito atrativas para a mosca. A RP também pode ser observada por meio de um contato feito com a pata, mas gostaríamos de focar no contato do probóscide nesta apresentação. Assim, o primeiro passo para o ensaio de RP é privar a mosca de alimento.A otimização da condição de privação é um dos fatores mais importantes para este ensaio. E existem duas questões principais que são importantes aqui. Uma é o tempo de privação e a outra é o tamanho corporal da mosca antes da privação.E parece haver uma correlação positiva entre esses dois fatores. E se a mosca for grande e gorda, é necessário privá-la de alimento por mais tempo. Agora, o tamanho do corpo depende da nutrição do alimento fornecido às moscas e da densidade das moscas no frasco.Vou mostrar um bom exemplo. Você pode observar neste frasco que as moscas não estão superpovoadas. Há cerca de, vamos ver, de cem a 150 PPE no frasco.Assim que a mosca for fechada aqui, você deve mantê-las em um alimento fresco por mais três a cinco dias e, em seguida, transferi-las para um frasco vazio, que contém um pedaço de papel. Este papel é mantido úmido o tempo todo, e o tempo de privação alimentar pode variar de 24 a 96 horas. Voltaremos mais tarde para descrever detalhes sobre o tempo de privação alimentar.Aqui está como preparar uma mosca para PER. Primeiro, pegue uma mosca e um aspirador. Em seguida, coloque uma ponteira amarela de 200 microlitros sobre a abertura.Agora, vire e sopre simultaneamente sobre ele. Você pode pressionar suavemente a mosca para dentro da ponta amarela e aplicar um pouco de ar para empurrar a mosca até um ponto em que ela não consiga se mover. Usando uma lâmina, faça uma marca aproximadamente no olho da mosca, então aspire novamente a mosca e corte a ponta. Agora, sopre suavemente de volta, devolvendo a mosca à posição.Mas logo antes de chegar ao final, faça um corte SL na posição onde a probóscide será localizada. Você pode fazer sem o corte SL, mas certamente tornaria o processo seguinte mais fácil se o tivesse. Agora, corte a ponta amarela abaixo da mosca, recheie a base com argila e coloque-a em posição vertical.Você pode fazer o ajuste final adicionando mais argila à ponta. Uma coisa importante é tentar não empurrar a mosca com muita força. Deixe-me apenas focar aqui e talvez eu a empurre um pouco mais para cima.Portanto, a cabeça da mosca ficaria um pouco acima desse ponto. Assim é como ficaria sob o microscópio quando você estiver tentando, sendo esta uma vista lateral e a outra vista frontal. Agora você está pronto para testar pr.O WIC que usamos para administrar o sabor é produzido da seguinte maneira. Utilizamos lenços Kim e os passamos por um triturador, o que resulta em uma tira como esta. A largura da tira é de aproximadamente seis milímetros, seis milímetros, cerca de cinco a seis milímetros.Agora, o que você faz é torcer esta tira para formar um fio, torcendo firmemente. Então estou torcendo, e agora temos um fio, que se transforma em um fio assim. Em seguida, pegamos um par de pinças, puxamos, separamos essas pequenas mechas do fio.E é assim que produzimos o wake. Neste clipe de vídeo, gostaríamos de demonstrar a posição correta para fazer contato com o Pro Bois. Utilizaremos um fio embebido em sacarose 4% e gostaríamos de mostrar a diferença na sensibilidade ao tocar diferentes regiões ao longo do eixo dorsal-ventral.O centro do legume aqui é o local mais sensível. Portanto, você sempre deve tentar fazer contato com o centro, assim. Agora, quando você toca na parte superior ou na área dorsal do lábio, a mosca não responderá.Então estamos fazendo contato ali, mas você pode ver que a mosca não está estendendo as ssis. E a mesma coisa acontece quando você toca a parte ventral do lábio. Isso é um pouco mais difícil, mas vamos ver se conseguimos fazer um bom contato com a parte mais baixa do nível.Vamos fazer uma abordagem suave, bem suave. E vamos ver aqui. Vou tocar o centro novamente para garantir que esta mosca ainda está dentro.Interessado no sabor adocicado. Portanto, no lum, devemos sempre tocar o centro, esta região no meio. Assim, quando você olha verticalmente no ensaio, o centro do lum está apontando nesta direção, um pouco para baixo.Portanto, quando você se aproxima da leguminosa apenas horizontalmente, que é nesta direção, esta direção, o ponto mais próximo estaria entre a região sensível e a não sensível. Assim, essa responderia. Mas se estiver um pouco acima, não vai responder.Então, vamos explorar um pouco. Agora, sem resposta na primeira fileira da silla, segunda fileira, terceira fileira, sim. Portanto, é necessário ir pelo menos abaixo da terceira fileira da silla.Agora vou fazer uma sondagem semelhante a partir da base. Isso é um pouco mais difícil. Estou tocando a segunda linha a partir da base.Agora vou subir para lá. A terceira linha, quarta linha, não, não está respondendo. Quinta linha ali.Portanto, você deseja tocar pelo menos da quarta à quinta linha de Sula a partir da base. Isso significa que você realmente precisa tocar constantemente o centro, caso contrário, a variância dos seus dados aumentaria significativamente. Talvez você queira praticar isso repetidamente.E o fator-chave é fazer contato levemente abaixo do ponto mais próximo por uma abordagem horizontal, que é aqui. Em seguida, gostaria de mostrar a você a diferença de sensibilidade entre a área medial e a lateral do lábio. Movo a posição da mosca para que ela fique voltada para cima nesta imagem.Primeiro, tocarei o centro ou a parte medial do lábio da mosca, e você pode ver que a mosca responde bem. Agora, em seguida, tocarei o sensor localizado na parte mais lateral do lábio, e você pode ver que a mosca não responde aqui. Agora, deixe-me sondar a partir do lado em direção ao centro, tocando exatamente na lateral.Estou me movendo em direção ao centro pouco a pouco. E, como você pode ver, assim que atinge o centro exato, a mosca responde. Deixe-me fazer novamente a partir do lado e em direção ao centro aqui.Portanto, é importante tocar o centro do nível em ambas as direções, vertical e horizontalmente. Nesta seção, gostaria de demonstrar como fazer contato com o osis. De modo geral, você deve fazer o contato o mais suave possível.Um bom indicativo do impacto é o movimento resultante da cabeça da mosca. Assim, o toque ideal é aquele em que você não vê a cabeça sendo movida para trás em absoluto. O outro fator importante é a forma do pavio.Vou mostrar alguns exemplos. O formato do pavio aqui é muito bom. Não é muito grosso, nem muito fino.Se for muito espesso, torna-se difícil fazer um contato preciso e o impacto tende a ser maior. Se for muito fino, você não saberá se a solução foi entregue corretamente até a ponta, o que é pior do que um filme espesso. Deixe-me tocar o lábio algumas vezes com isso.E ali, ali, ali, e quase não se percebe nenhum movimento da cabeça devido ao contato nesse ponto. Às vezes, obtém-se uma mecha que se parece com isso. Assim, a parte da ponta é claramente muito fina.Você não está, não pode ter certeza se a concentração na ponta é aquela que deseja administrar. Então, o que você pode fazer com estes é usar a parte amarela da ponta e dobrá-la várias vezes assim, e, ao fazê-lo, você pode moldá-la nesta forma adequada, deixe-me fazer contato com isso. Assim, você pode ver que não observa muitos movimentos da cabeça.Houve um pequeno movimento do quadril ali, mas sim, este é outro bom exemplo. Você nem sempre precisa descartar os mais grossos, desde que consiga fazer um contato preciso e suave. Ainda é possível utilizá-los também.O movimento da ponta pode ser ligeiramente maior do que nas pontas finas, mas, desde que você tenha uma mão firme, ainda é possível obter um bom contato como este. Isso é algo que você não deve usar. Há, há muitas fibras saindo e é difícil agrupá-las juntas.Você deve descartar estes e encontrar outro. Este também não é adequado. A ponta é muito fina e muito curta para ser dobrada e formar uma ponta mais grossa.E as partes ao redor são muito grossas para fazer um contato preciso. Você também deve descartar essas. O problema deste é que há muito líquido sobre ele, e é difícil fazer um contato preciso.Isso deixaria uma quantidade maior de líquido no pavio de madeira, o que poderia interferir no procedimento seguinte. Mesmo que você tivesse um pavio muito bom, não seria adequado se o contato não fosse feito suavemente. Aqui está um exemplo ruim.Você pode ver a cabeça da mosca sendo movida violentamente. Um impacto forte desencorajaria a mosca de responder a uma substância, e a mosca pode facilmente perder o interesse por provas subsequentes. A seguir, gostaria de dar algumas dicas sobre como reduzir o impacto.Primeiro, pare o pavio acima da ponta amarela pouco antes de ele fazer contato. Dessa forma, é possível observar a amplitude da tremulação da sua mão naquele momento. Ao observar isso, você pode visualizar a distância da aproximação final e mover o pavio para que o ponto mais distante da tremulação da sua mão alcance a ilha do velame.É claro que é melhor se você não tiver qualquer tremor nas mãos. Mas este método permite que você trabalhe com isso e reduzirá o impacto geral. Uma coisa que observamos é que, mesmo se você iniciar a mosca pelo mesmo período de tempo, obtém-se um grupo de moscas que não respondem a nada devido ao tempo insuficiente de privação alimentar.Ou, por outro lado, você pode encontrar um lote de moscas que estão todas mortas. Portanto, testar moscas após um tempo fixo de inanição, independentemente do estado das moscas, não é muito aconselhável. E isso aumentaria tanto a variação dos dados que poderia ofuscar o fenômeno que você está analisando.Para melhorar essa situação, gostaríamos de apresentar uma série de controles para avaliar o estado da mosca. O primeiro passo é testar a REP de um controle positivo, que é sacarose a 4%. Essa concentração é suficientemente alta para induzir uma resposta.Para a maioria das moscas, se a mosca não responder a esse controle positivo, isso significa que ela precisa de mais tempo de privação alimentar ou está inativa por diversas outras razões, como lesões. Portanto, você deve descartar essas moscas. Agora, se elas responderam, teste um controle negativo, que é a água.Se a mosca responder à água, isso significa que ela está com sede, ou que simplesmente responde a tudo, ou que foi condicionada a comer qualquer coisa que se aproxime. Isso ocorre devido à substância atrativa que fornecemos como controle positivo aqui. E a mosca aprendeu que um objeto que se aproxima provavelmente é doce.Portanto, estamos tentando medir um comportamento relacionado ao paladar, não um comportamento de aprendizado. E você não deseja que o ensaio anterior influencie o ensaio seguinte devido à aprendizagem. E parece que, quando uma concentração mais alta é usada como controle positivo, as chances de uma resposta ao negativo tornam-se maiores.Agora, você pode testar a mosca para PER com qualquer substância ou condição que tiver, mas após o teste, você deverá tentar novamente os controles positivo e negativo, pois se a mosca não responder ao positivo aqui, isso significa que ela perdeu o interesse por estímulos durante o teste e você não saberá se a ausência de resposta no teste se deve à falta de interesse geral da mosca. Em seguida, se a mosca responder ao controle negativo, isso indica que a mosca ficou com sede ou foi condicionada a um objeto que se aproxima. E se a mosca não responder ao negativo, finalmente você terá um dado que poderá acumular.Então, essa janela geralmente dura cerca de cinco a 10, 15 minutos. E, em alguns casos, vi que essa janela pode durar até 30 minutos. Assim, após algum tempo, percebemos que esta é uma representação gráfica da relação entre o tempo de estrela-do-mar e a mortalidade.Então, este é o tempo e esta é a porcentagem de moscas vivas em um frasco. E, é claro, elas começarão a morrer, e isso varia muito. E o que, o que, uma coisa que percebi é que, até um certo ponto, não haverá moscas que responderiam ao controle positivo, mas, de repente, você começará a ver uma mosca que começa a responder.E, é claro, com o passar do tempo, você pode continuar usando-o. Mas, a partir de um determinado momento, percebemos que haverá mais moscas respondendo ao controle negativo. Portanto, este será o intervalo de tempo que você deverá considerar para realizar os ERs.Então a pergunta é: quando isso vai acontecer? E na minha experiência, em condições muito boas, geralmente isso ocorre entre 36 e talvez 48 horas, mas às vezes pode chegar a 72 horas, variando bastante. Portanto, é importante ter vários frascos preparados para conseguir capturar essa janela curta.Mais uma vez, mesmo com os mesmos tempos de privação de alimento, a mesma comida, tudo idêntico, isso varia muito. Assim, mesmo com o mesmo genótipo, em um background genético muito semelhante, esse fenômeno varia bastante. Por isso, é isso que você realmente precisa ter cuidado.Conversamos sobre as moscas que foram condicionadas aos estímulos, as quais agora respondem a qualquer coisa. E uma maneira de evitar isso é não oferecer repetidamente um sabor atrativo e misturar controles negativos entre os ensaios. Então, deixe-me mostrar como isso funciona.Então, este é um controle positivo. Ou seja, 4% de sacarose, que foi administrado duas vezes aqui. E se mantivermos isso, continuarmos administrando repetidamente este sabor doce, eventualmente ocorrerá o condicionamento.Agora, em vez disso, vamos adicionar um controle negativo. Como você pode ver, não está reagindo ao controle negativo. Deixe-me fazer isso novamente.Primeiro controle positivo, 4% com 4% de sacarose. Deixe-me ajustar isso um pouco. Uma resposta de repouso novamente muito forte e muito rápida.E agora novamente, vamos para o controle negativo. E vejamos, não há um bom, deixe-me virar isso. Ok, aqui.Então, esta é a água do controle negativo. Como você pode ver, ela não responderá ao controle negativo. Agora, deixe-me mostrar um exemplo ruim.Então, estamos administrando 8% de sacarose, o que é mais alto do que o controle positivo que utilizamos. Assim, a mosca realmente gosta e tenta procurar, deixe-me deixar, vamos tentar novamente. Vamos ver um contato suave ali.E está buscando ativamente. Ainda está com suas vantagens estendidas. Então, vamos esperar um pouco e fazer outro contato ali.Oh, aqui está. Então está, sim, ainda procurando por ele. Procurando por ele.Certifique-se, sim, ainda está tudo bem. E talvez mais uma vez, mais uma vez, novamente. Ah, sim, há uma resposta muito forte.Agora, em vez da sacarose a 8%, vamos utilizar um controle negativo. Então, vamos trazer este pavio aqui. Este é um pouco fino demais.Então, vamos dobrar isso e dar um formato, criando uma escada agradável. Mas isso é água. Assim, você pode observar, neste caso, a resposta da mosca à água.Agora, neste exemplo, aplicamos uma substância muito atrativa por cinco vezes. Isso não significa que duas vezes seja aceitável, mas cinco, ruim. Há muitos casos em que a mosca é condicionada apenas com uma aplicação de 4% de gross ou até com um custo menor, uma concentração mais baixa.E a mensagem importante é tentar reduzir o número de aplicações repetidas de uma substância atrativa. E se você tiver uma série de concentrações de um sabor atrativo, é mais seguro começar pela concentração mais baixa e aumentar gradativamente para uma mais alta, recolhendo o sabor o mais rápido possível para que a mosca não consiga consumir muito dele, o que também reduziria o condicionamento da mosca. Olá, nesta apresentação, percorremos todos os passos do ensaio de resposta de protração.O método em si parece bastante direto, mas, assim como muitos outros ensaios comportamentais, existem pequenos detalhes que podem impedir o funcionamento deste ensaio. E nós já passamos por muitas dessas etapas que exigem atenção cuidadosa. Aqui, gostaria de reforçar alguns dos fatores mais importantes.E a primeira coisa é a forma do pavio. Eu mostrei algumas imagens de exemplos muito bons, mas na realidade, tudo estará dentro desse espectro contínuo de muito bom e muito ruim. E no início você pode estar usando algo nessa faixa de muito bom, mas dia a dia pode começar a se deslocar para você.A coisa, as semanas que você pode estar usando podem começar a mudar para a faixa não tão boa. E a percepção humana do que é chamado de bom pode mudar muito facilmente, sem, sem perceber. E uma maneira de evitar isso é tirar uma foto boa de um WIC que funcione muito bem e simplesmente olhar para a foto logo antes de testar o P. Agora, o segundo fator importante é o impacto.E isso é mais fácil de lidar porque o melhor contato, o impacto ideal, seria um contato no qual você não percebe qualquer movimento da cabeça. Assim, se você conseguir torná-lo o mais suave possível, e se não vir a cabeça da mosca se deslocar de maneira alguma, esse seria o melhor resultado. Agora, a condição de privação de alimento, o terceiro fator, é a condição mais difícil de controlar.E em muitos ensaios comportamentais de paladar ou ensaios comportamentais olfativos, um período de privação alimentar de 24 horas é muito frequentemente utilizado, e 24 horas pode ser bastante conveniente para nós humanos realizarmos o experimento. Mas se você criar suas moscas em condições muito boas, essas 24 horas são bastante curtas. Mas mesmo que você utilize um alimento rico para as moscas e controle com precisão a densidade das moscas, essa janela experimental pode variar, digamos, de 36 a 72 horas. Agora.Assim, como um experimento, devo dizer que é muito inconveniente para um ser humano ou para pessoas realizar este experimento, mas há outro fator que torna a tarefa mais difícil para os pesquisadores. De fato, haveria muitos lotes em que a janela experimental poderia ser muito curta ou até mesmo não existir completamente. Portanto, existem alguns obstáculos significativos que você precisa superar.Mas a coisa mais importante são os controles positivo e negativo. E ao manter esses padrões de forma muito rigorosa, você será capaz de coletar conjuntos de dados confiáveis.

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