Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Este protocolo demonstra o método de bioinformática por vídeo para medir o crescimento de colônias de células-tronco embrionárias humanas, analisando vídeos de lapso de tempo coletados em uma incubadora de tomografia computadorizada de bioestação ícone, equipada com uma câmera para imagens de vídeo. As colônias de células-tronco embrionárias humanas ou HESC são cultivadas a 70% de fluência co, replaqueadas e incubadas por 48 horas, após as quais as colônias HESC são filmadas por mais 48 horas no Biot ct. A taxa de crescimento é determinada usando receitas de aprimoramento e medição de segmentação desenvolvidas com o software CL quant.

As receitas são validadas por comparação com o Adobe Photoshop, uma ferramenta de análise de imagem que permite o ajuste manual preciso da máscara a cada colônia. O campo emergente da bioinformática de vídeo pode ser usado para automatizar o processamento, análise e mineração de dados biológicos de vídeos microscópicos. Olá, sou Serena Lin, do laboratório do Dr. Prou Talbot no Departamento de Biologia Celular e Neurociência aqui na Universidade da Califórnia em Riverside.

Olá, sou Sean Fino, também do Talbot Lab. Olá, sou TI Satish do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular Molecular e do Desenvolvimento. Hoje mostraremos como medir o crescimento de colônias de células-tronco embrionárias humanas usando ferramentas de bioinformática de vídeo.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para medir os efeitos de tóxicos ambientais no comportamento das células-tronco embrionárias humanas. Estaremos demonstrando esse procedimento em nossa nova instalação central de células-tronco. Então vamos começar.

Para preparar o HESC para análise de vídeo, cultive HESC em placas de seis poços revestidas com matrigel até 70% de meio aspirado confluente de um poço contendo HESC e enxágue duas vezes com um mililitro de PBS. Adicione um mililitro de Accutane e incube por um minuto a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Em seguida, adicione 10 a 12 contas de vidro no poço e agite a placa suavemente até que as colônias se desprendam completamente.

Neutralize Accutane usando um mililitro de manutenção de células-tronco embrionárias humanas, meio ou meio condicionado de fibroblastos embrionários de camundongo. Recolher as células separadas sem as esferas para um tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar a 200 g durante três minutos. Transvase o SUP e quebre o pellet com 500 microlitros de meio de manutenção de células-tronco embrionárias humanas frescas ou placa M-T-E-S-R 100 microlitros da suspensão HESC gota a gota em vários poços de uma placa revestida de matrigel de 12 poços.

Balance a placa para frente e para trás suavemente e observe as culturas sob um microscópio de luz para fazer com que os aglomerados de células sejam distribuídos uniformemente pelos poços. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus e 5% de dióxido de carbono por 48 horas para garantir que as células estejam planas e grandes o suficiente para serem facilmente visualizadas. Após 48 horas, aspire o meio e lave os poços com 500 microlitros de PBS para remover as células soltas e, em seguida, adicione 500 microlitros de meio M-T-E-S-R a cada um.

Bem, coloque imediatamente a placa no Biot CT e comece a coletar imagens de lapso de tempo. Tente selecionar campos com colônias únicas discretas que provavelmente não se transformarão em outras colônias. Neste protocolo, as células são gravadas em vídeo por mais 48 horas com quadros em intervalos de sete minutos.

Para criar a receita de segmentação primeiro, verifique manualmente todo o vídeo para verificar se ele contém uma única colônia que permanece focada durante todo o período de gravação. Depois disso, abra o assistente de segmentação no software CL quants e clique no botão Avançar. Selecione o canal de imagem correto e clique no botão Avançar.

Escolha a correspondência flexível e clique em Avançar. Selecione uma ou duas regiões desejadas circulando a borda externa até a área central da colônia. Esta área deve ser a menor possível, mas deve ser representativa de toda a colônia.

Não escolha muitas regiões, pois isso pode resultar em uma aplicação de máscara imprecisa. Clique no botão Avançar. Selecione Não quero regiões circulando regiões que não fazem parte da colônia e não fazem parte do plano de fundo.

Essas regiões têm padrões que devem ser suprimidos, como detritos e células mortas. Clique em Avançar. Selecione o plano de fundo circulando regiões que não são colônias, detritos ou células mortas.

O plano de fundo deve ser uniforme e provavelmente aparecerá em todos os quadros. Normalmente, selecionamos o fundo cinza ao redor da colônia. Clique no botão Avançar.

Uma máscara colorida deve ser exibida sobre a região de interesse se a máscara não cobrir com precisão a região de interesse. O intervalo do limite de segmentação no canto inferior direito da tela pode ser aumentado ou diminuído se for necessária uma mudança de máscara. Selecione as regiões de correspondência flexível de atualizações.

Isso permite alterar as áreas de quero não quero ou de fundo. Se a máscara for satisfatória, selecione aplicar limite e salve minha máscara. Em seguida, clique no botão Avançar.

A máscara será então exibida em uma cor diferente. Selecione Concluir. A receita deve ser exibida no canto superior direito do software como receita de segmentação.

Renomeie a receita, se desejar, clicando com o botão direito do mouse e inserindo um novo nome. Para aplicar a receita. Clique com o botão direito e coloque o mouse sobre ele.

Aplique a receita. Um menu aparecerá permitindo a seleção do número de quadros a serem usados. Defina o intervalo de quadros para cada 20 quadros para garantir a fidelidade da máscara.

Verifique manualmente aleatoriamente 10% dos quadros aos quais a máscara foi aplicada para criar uma receita de aprimoramento que elimina regiões indesejadas em detritos. Clique com o botão direito do mouse na pasta de receitas de aprimoramento e clique em novo. Uma nova receita de aprimoramento deve ser exibida no campo de visão original.

Mova o mouse sobre os ícones na barra de ferramentas para identificar o botão do módulo de aprimoramento de alternância localizado à direita da imagem e clique nele. Selecione o menu suspenso de rotulagem. Selecione a rotulagem para conectados selecione a rotulagem para dois conectados.

Uma nova barra de tarefas deve ser exibida. Pegue a máscara inicial da receita de segmentação e arraste-a para a caixa de entrada. A barra agora deve exibir o número da máscara de entrada.

Arraste o ícone com o número da máscara de entrada para o ícone zero da máscara. Encontre o tamanho mínimo na barra de tarefas e ajuste o número até que apenas a região de interesse seja exibida. Certifique-se de clicar em executar para cada teste de ajuste.

Quando o ajuste do tamanho mínimo for satisfatório, clique na receita de aprimoramento anterior na parte inferior da tela, selecione salvar na receita. O software agora solicita a substituição da receita selecionada e selecione sim local. Verifique a receita de ampliação usando o mesmo procedimento da segmentação de verificação pontual.

Se estiver satisfeito com as receitas de segmentação e aprimoramento, continue a criar o modelo de medição. Para começar a selecionar, crie um modelo de medição na barra de ferramentas à direita. Na janela de medição, selecione mover o cursor sobre a figura da célula de clip-art.

Segure a tecla control e selecione a célula na seção de morfologia, desmarque o parâmetro padrão e verifique o parâmetro da área. Em seguida, saia da janela do modelo. Selecione o ícone.

Crie uma receita de medição. Renomeie a receita. Mover para e selecionar a guia do modelo No canto superior direito, arraste e solte o modelo de medição criado anteriormente na janela de medição.

Clique em sim para continuar na janela de receita de medição, selecione mapeamentos de canal. Em seguida, a célula inteira seleciona mapeamentos de máscara. Em seguida, selecione a opção de célula inteira Para máscara aprimorada, selecione a receita de medição na guia de receita.

Na janela principal, selecione o ícone salvar na janela da receita de medição. Em seguida, feche a janela Próximo fechar e reabrir o campo de visão. Clique com o botão direito do mouse na pasta da lista de receitas e clique em novo, arraste as receitas na ordem do aplicativo necessário para a lista de receitas, selecione bloquear lista de receitas e execute as receitas sequencialmente nos dados de vídeo usando o Adobe Photoshop.

Cada 20º quadro das mesmas colônias foi analisado. Abra manualmente um quadro de uma imagem de colônia no Adobe Photoshop. Clique na ferramenta varinha mágica na barra de ferramentas.

Clique na área ao redor da colônia para que todo o campo seja coberto, exceto a região da colônia. Certifique-se de que a linha pontilhada ao redor da colônia se encaixe bem na periferia da colônia e não dentro dela. Se a linha pontilhada não estiver ao redor da periferia, altere o valor de tolerância na barra de ferramentas superior de acordo.

Clique em editar no modo de máscara rápida na barra de ferramentas e clique na colônia para que a colônia seja selecionada. Vá para a janela, abra o menu e clique em histograma. O cache deve ser definido como um.

Se o cache for dois, clique na exclamação do ponto de expressão para alterar o cache para um. Registre o valor do pixel em uma planilha. Repita o processo acima para cada 20º quadro.

Os dados coletados usando o software Photoshop e CL quant podem ser plotados juntos. Nosso protocolo para quantificar o crescimento de colônias HESC demonstra uma aplicação de bioinformática de vídeo a um problema biológico. Aqui mostramos um gráfico comparando o aumento no tamanho da colônia ao longo de 48 horas, conforme determinado usando o software CL quant e o Adobe Photoshop.

O gráfico mostra cinco colônias diferentes, cada uma analisada por ambos os pacotes de software. Cada colônia é representada por uma cor diferente. As linhas sólidas foram derivadas usando o software sail quant, enquanto as linhas pontilhadas foram coletadas usando o Photoshop.

O gráfico dos dados brutos mostra que ambos os métodos de medição estão em boa concordância para explicar o fato de que as colônias têm um tamanho inicial diferente. Esta figura mostra os dados replotados como o aumento percentual no tamanho da colônia. As taxas de crescimento são semelhantes, independentemente do tamanho inicial da colônia e ambas as medidas de análise fornecem resultados semelhantes.

O gráfico a seguir exibe as médias dos dados de variação percentual anteriores no crescimento da colônia HESC. Este gráfico mostra claramente uma boa concordância entre a análise feita usando bioinformática de vídeo e Adobe Photoshop. Acabamos de mostrar como medir o crescimento de colônias de células-tronco embrionárias humanas usando ferramentas de bioinformática de vídeo.

Ao fazer este procedimento usando microscopia de contraste de fase, certifique-se de incluir o halo ao redor da colônia para uma seleção precisa da colônia pelo software. Também é importante lembrar que outros métodos de cultura, incubação e coleta de vídeo podem ser usados no lugar do protocolo que demonstramos. Uma vez que as receitas são desenvolvidas e validadas, eles realizarão análises muito mais rapidamente e com menos variação experimental do que a análise manual.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.