Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

A BIOSENSORES de modulação magnética ou MMB é uma técnica nova para a detecção de moléculas biológicas. Aqui é apresentado um ensaio de prova de princípio no qual a interleucina oito é detectada quando a interleucina oito, também chamada de IL oito, é adicionada a uma mistura de reação contendo microesferas magnéticas revestidas com anticorpos por meio de anticorpo anti-IL oito e estreptavidina marcada com fluoróforo. Um sanduíche molecular é criado, ligando efetivamente a molécula fluorescente à microesfera magnética.

A reação é colocada em um vete e em um campo magnético alternado. Gradientes são aplicados por meio de dois polos eletromagnéticos, que movimentam as esferas em um movimento oscilatório. O movimento periódico da esfera com proteínas fluorescentes, entrando e saindo de um feixe de laser ortogonal, produz um sinal fluorescente que é coletado por um PMT e demodulado.

Utilizando um amplificador com detecção por transposição de fase, o movimento das microesferas pode ser visualizado com uma câmera CCD no lugar do movimento síncrono do PMT, observado em amostras onde as microesferas magnéticas foram ligadas a proteínas fluorescentes por meio da IL-8. Olá, sou Adia do Laboratório de Óptica Não Linear e Laser do Departamento de Eletrônica Física da Universidade de Telaviv. Sou NoGo do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Illinois em Chicago, e sou Marcelo Erlich do Departamento de Pesquisa Celular e Imunologia da Universidade de Telaviv.

Hoje vamos mostrar um método para detecção homogênea rápida de ensaios biológicos utilizando um sistema de biossensoriamento com modulação magnética. Estamos utilizando este procedimento em nosso laboratório para detectar proteínas específicas e sequências de DNA em baixas concentrações. Então, vamos começar.

Inicie este procedimento preparando e rotulando um tubo para cada reação, incluindo uma amostra-alvo e uma amostra controle não alvo. Em cada tubo, adicione os seguintes componentes do ensaio de citocina Bio-Plex Precision Pro, um a um: microesferas magnéticas acopladas, anticorpo de detecção IL-8, estreptavidina-PE e IL-8.Target. Complete o volume até 100 microlitros com tampão de ensaio e agite por 30 minutos em um agitador orbital compacto.

Após as amostras terem sido agitadas por 30 minutos à temperatura ambiente, coloque-as diretamente em cubetas para análise. Utilizando o sistema MMB, limpe as cubetas transparentes com tecido para limpeza de lentes e etanol 70%. O instrumento utilizado para análise consiste em um laser de 488 nanômetros, duplicado em frequência, usado como fonte de luz de excitação, direcionado por um divisor de feixe dicróico de 562 nanômetros até uma lente objetiva de microscópio.

A lente objetiva do microscópio focaliza o laser em um feixe com diâmetro de 27 micrômetros dentro de um tubo de vidro silicato BO com 400 micrômetros de largura. A luz emitida é filtrada espectralmente por meio de dois filtros de banda sucessivos, detectada por um fotomultiplicador ou PMT e demodulada utilizando um amplificador com detecção por sincronismo. Um modulador de corrente caseiro é utilizado para aplicar uma onda quadrada sucessivamente a cada eletroímã.

A amplitude deve ser de 1,4 ampères com uma frequência de um a seis hertz, já que as microesferas entram e saem do feixe de laser duas vezes a cada ciclo. A frequência de desmodulação no amplificador lock-in é de dois a 12 hertz. Inicie o sistema girando a chave do laser de 488 nanômetros para a posição ligada e ligando a alimentação.

Em seguida, ajuste a potência do laser ao mínimo, aproximadamente quatro a seis miliwatts. Ligue o osciloscópio e, depois, ligue o PMT. Em seguida, posicione a lâmina da amostra entre os dois polos eletromagnéticos.

Utilize o estágio rotacional do vete para garantir que o feixe a laser atravesse o vete sem atingir as paredes do vete. Utilize os estágios de translação XY e Z do vete para alterar sua posição em relação à lente objetiva e aos polos eletromagnéticos. Para otimizar o acoplamento da luz fluorescente ao detector, o vete deve ser posicionado ligeiramente atrás da linha dos polos.

Agora configure o osciloscópio para medição de rastreamento temporal. Ajuste o controle de ganho do PMT para 0,5 volts. Em seguida, ligue o modulador de corrente e defina a frequência para três hertz.

Aguarde 30 segundos para permitir a agregação e condensação das microesferas. As microesferas magnéticas começarão a oscilar, movendo-se próximo à frente do tubo. Quando o feixe de laser atingir as microesferas oscilantes, deve-se observar um cintilar da luz laser refletida pelas microesferas.

Observe que as esferas se movem mais rapidamente quando a modulação da corrente é aumentada e mais lentamente quando é diminuída. A posição das esferas no tubo pode ser ajustada utilizando estágios controlados por micrômetro. Para mover os polos, o movimento das esferas pode ser visualizado usando uma câmera CCD colocada no lugar do PMT.

O osciloscópio detecta o sinal periódico proveniente das microesferas conjugadas com fluorescência e registra o traçado temporal do osciloscópio. Os dados salvos podem ser analisados usando MATLAB. Misturas reacionais com e sem IL oito foram ensaiadas por MMB. Em todas as reações com o alvo, as microesferas formaram um único agregado denso que se movia para dentro e para fora do feixe a laser em sincronia.

No entanto, na ausência do alvo, as microesferas apresentaram menor agregação e seu movimento foi menos coordenado. Aqui, o sinal do relógio de modulação do polo mostrado em amarelo e o sinal de saída do PMT mostrado em magenta representam a frequência de modulação para cada polo em dois hertz. Portanto, a frequência de desmodulação é de quatro hertz, conforme esperado teoricamente.

Quando as microesferas passam pelo feixe de laser, o PMT detecta a luz fluorescente e há um pico na tensão de saída do PMT quando o sinal do PMT e o relógio de dupla modulação são enviados ao amplificador com detecção por sincronismo. O detector de fase sensível garante a sincronização e resulta em alta tensão. As duas cores indicam dois diferentes varredores na mesma concentração-alvo.

As linhas pretas representam a média de cada sinal. O amplificador com detecção por captação não detectou nenhum sinal quando a amostra controle foi testada. O amplificador com detecção por captação não forneceu nenhum sinal captado para este caso.

Esse fato, juntamente com a diferença visual na agregação, sugere que o sistema MMB e a diferença nas medidas de rastreamento temporal do sinal de saída do PMT podem identificar claramente a presença do alvo ILH. Acabamos de mostrar como detectar rapidamente e de forma homogênea moléculas biológicas utilizando modulação magnética. Biossensoriamento com IL oito como exemplo.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de seguir os procedimentos de segurança para laser. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.