Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

Modulação magnética BIOSENSING ou MMB é uma nova técnica para a detecção de moléculas biológicas. Aqui, um ensaio de prova de princípio é mostrado no qual a interleucina oito é detectada quando a interleucina oito, também chamada de IL oito, é adicionada a uma mistura de reação contendo esferas magnéticas revestidas com anticorpos pelo anticorpo anti IL oito inatado e estreptococos marcados com fluorescência din. Um sanduíche molecular é criado ligando efetivamente a molécula fluorescente ao grânulo magnético.

A reação é colocada em um campo magnético vete e alternado. Os gradientes são aplicados através de dois pólos eletromagnéticos, que manobram as contas em movimento oscilatório. O movimento periódico das proteínas fluorescentes ligadas ao grânulo dentro e fora de um feixe de laser ortogonal produz um sinal fluorescente que é coletado por A PMT e modulado por demonstração.

Usando um amplificador de bloqueio, o movimento das esferas pode ser visualizado usando Uma câmera CCD no lugar do movimento síncrono PMT é visto em amostras onde as esferas magnéticas foram ligadas a proteínas fluorescentes via IL oito. Olá, sou Adia do Laboratório de Óptica Não Linear e Laser do Departamento de Eletrônica Física da Universidade de Telaviv. Eu sou NoGo do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Illinois em Chicago, e sou Marcelo Erlich do Departamento de Pesquisa Celular e Imunologia da Universidade de Tel Aviv.

Hoje mostraremos um método para detecção homogênea rápida de ensaios biológicos usando um sistema de biossensoriamento de modulação magnética. Estamos usando esse procedimento em nosso laboratório para detectar proteínas específicas e sequências de DNA em baixas concentrações. Então vamos começar.

Comece este procedimento configurando e rotulando um tubo para cada reação, incluindo uma amostra alvo e uma amostra de controle não-alvo. A cada tubo, adicione os seguintes componentes do ensaio de citocinas bioplex Precision Pro, um a um, detecção de esferas magnéticas acopladas IL oito anticorpo estreptavidina PE e IL oito. Alvo. Aumente o volume para 100 microlitros com tampão de ensaio e agite por 30 minutos em um agitador orbital compacto.

Depois que as amostras forem agitadas por 30 minutos em temperatura ambiente, coloque-as diretamente nas cubetas para análise. Usando o sistema MMB, cubetas transparentes com lenço de limpeza de lentes e etanol 70%. O instrumento usado para análise consiste em um laser de frequência dupla de 488 nanômetros usado como fonte de luz de excitação direcionada usando um divisor de feixe dicróico de 562 nanômetros em uma lente objetiva de microscópio.

A lente objetiva do microscópio focaliza o laser em um feixe de 27 micrômetros em um tubo de vidro de silicato BO de 400 micrômetros de largura. A luz emitida é filtrada espectralmente usando dois filtros passa-banda sucessivos detectados por um fotomultiplicador ou PMT e modulada por meio de um amplificador de bloqueio. Um modulador de corrente caseiro é usado para fornecer uma onda quadrada sucessivamente a cada eletroímã.

A amplitude deve ser de 1,4 amperes com uma frequência de um a seis hertz, pois os grânulos entram e saem do feixe de laser duas vezes a cada ciclo. A frequência de demodulação no amplificador lockin é de dois a 12 hertz. Inicie o sistema girando a chave laser de 488 nanômetros para a posição ligada e ligando a energia.

Em seguida, defina a potência do laser para o mínimo, cerca de quatro a seis miliwatts. Ligue o osciloscópio e, em seguida, ligue o PMT. Em seguida, coloque o sample vete entre os dois pólos eletromagnéticos.

Use o estágio rotacional do veterinário para garantir que o feixe de laser passe pelo veterinário e não atinja as paredes do veterinário. Use o estágio de translação XY, Z do vete para alterar sua posição em relação à lente objetiva e aos pólos eletromagnéticos. Para otimizar o acoplamento da luz fluorescente no detector, o vete deve ser posicionado ligeiramente atrás da linha dos postes.

Agora defina o osciloscópio para medição de rastreamento de tempo. Defina o controle de ganho PMT para 0.5 parafusos. Em seguida, ligue o modulador de corrente e defina a frequência para três hertz.

Aguarde 30 segundos para permitir a agregação e condensação dos grânulos. As esferas magnéticas começarão a oscilar movendo-se perto da frente do tubo. Quando o feixe de laser atinge as esferas oscilantes, uma cintilação de luz laser refletida deve ser vista nas contas.

Observe que as contas se movem mais rápido à medida que a modulação da corrente é aumentada e mais lenta à medida que diminui. A posição dos grânulos no tubo pode ser ajustada usando os estágios controlados por micrômetro. Para mover os pólos, o movimento do cordão pode ser visualizado usando uma câmera CCD que é colocada em vez do PMT.

O osciloscópio detecta o sinal periódico das contas acopladas fluorescentes registra o traço de tempo do osciloscópio. Os dados salvos podem ser analisados usando misturas de reação MATLAB com e sem IL oito foram testados por MMB. Em todas as reações com o alvo, as contas formaram um único agregado denso que se moveu para dentro e para fora do feixe de laser em sincronia.

No entanto, sem o alvo, as contas eram menos agregadas e seu movimento era menos unido. Aqui, o relógio de modulação de pólo mostrado em amarelo e o sinal de saída PMT mostrado em magenta representam a frequência de modulação para cada pólo em dois hertz. Portanto, a frequência de demodulação está em quatro hertz, como teoricamente esperado.

Quando as esferas passam pelo feixe de laser, o PMT detecta a luz fluorescente e há um pico na tensão de saída do PMT quando o sinal PMT e o relógio de modulação dupla são alimentados ao amplificador de bloqueio. O detector de fase sensível a sincronização e os resultados com alta tensão. As duas cores indicam duas varreduras diferentes na mesma concentração alvo.

As linhas pretas representam a média de cada sinal. O amplificador de bloqueio não detectou nenhum sinal quando a amostra de controle foi testada. O amplificador de bloqueio não forneceu nenhum sinal bloqueado para este caso.

Este fato, juntamente com a diferença visual na agregação, sugere que o sistema MMB e a diferença nas medições de rastreamento de tempo do sinal de saída PMT podem identificar claramente a presença do alvo ILH. Acabamos de mostrar como detectar moléculas biológicas de forma rápida e homogênea usando modulação magnética. Biossensoriamento com IL oito como exemplo.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de seguir os procedimentos de segurança do laser. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.