Name: A zona subventricular En face: Coloração Wholemount e Fluxo ependimárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T16:22:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Aprenda a técnica de wholemount para estudar as paredes do ventrículo lateral e analisar o fluxo ependimário usando microesferas fluorescentes em camundongos. Este método revela a neurogênese na zona subventricular.

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Trabalho apoiado pelo NIH conceder HD-32116, da Família Sandler Apoio Foundation, The John Bowes Fundo de Células-Tronco, MEXT, MHLW e HFSP. ZM apoiado pela Fundação Carlos Baldoceda e Krevans UCSF Fellowship. AA-B. detém a Heather e Melanie Muss cadeira dotada.

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<li>Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li>
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<li>Mirzadeh, Z., Han, Y. G., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+organize+ependymal+planar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cilia organize ependymal planar polarity.</a> J Neurosci. 30, 2600-2610 (2010).</li>
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<li>Merkle, F. T., Mirzadeh, Z., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+organization+of+neural+stem+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain.</a> Science. 317, 381-384 (2007).</li>
<li>Young, K. M., Fogarty, M., Kessaris, N., Richardson, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+stem+cells+are+heterogeneous+with+respect+to+their+embryonic+origins+and+neurogenic+fates+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone stem cells are heterogeneous with respect to their embryonic origins and neurogenic fates in the adult olfactory bulb.</a> J Neurosci. 27, 8286-8296 (2007).</li>
<li>Waclaw, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc+finger+transcription+factor+Sp8+regulates+the+generation+and+diversity+of+olfactory+bulb+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The zinc finger transcription factor Sp8 regulates the generation and diversity of olfactory bulb interneurons.</a> Neuron. 49, 503-516 (2006).</li>
<li>Kohwi, M., Osumi, N., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6+is+required+for+making+specific+subpopulations+of+granule+and+periglomerular+neurons+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pax6 is required for making specific subpopulations of granule and periglomerular neurons in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 25, 6997-7003 (2005).</li>
<li>Kohwi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subpopulation+of+olfactory+bulb+GABAergic+interneurons+is+derived+from+Emx1-+and+Dlx5%2F6-expressing+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A subpopulation of olfactory bulb GABAergic interneurons is derived from Emx1- and Dlx5/6-expressing progenitors.</a> J Neurosci. 27, 6878-6891 (2007).</li>
<li>Hack, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+fate+determinants+of+adult+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal fate determinants of adult olfactory bulb neurogenesis.</a> Nat Neurosci. , (2005).</li>
<li>Ventura, R. E., Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+radial+glia+generate+olfactory+bulb+interneurons+in+the+postnatal+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dorsal radial glia generate olfactory bulb interneurons in the postnatal murine brain.</a> J Neurosci. 27, 4297-4302 (2007).</li>
<li>Kelsch, W., Mosley, C. P., Lin, C. W., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mammalian+precursors+are+committed+to+generate+neurons+with+defined+dendritic+projection+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct mammalian precursors are committed to generate neurons with defined dendritic projection patterns.</a> PLoS Biol. 5, e300(2007).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+centrosome+inheritance+maintains+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric centrosome inheritance maintains neural progenitors.</a> Nature. 461, 947-955 (2009).</li>
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A maioria dos estudos de neurogênese em zonas ventricular e subventricular têm contado com técnicas clássicas de corte para examinar a microanatomia e relacionamentos celular nestas regiões. Aqui nós descrevemos uma técnica alternativa, usada pela primeira vez para analisar a rede de cadeias migratórias dos neuroblastos gerados no SVZ 1, então utilizado para estudo da regeneração da população progenitora SVZ seguintes anti-mitótico tratamento 6, e, mais recentemente utilizado para estudar a apical precisa basal e interações célula-célula de adulto SVZ células-tronco neurais 2,3,4. Curiosamente, esta técnica revelou que as células-tronco neurais, ou células de tipo B1, do SVZ adultos fazem parte de um neuroepitélio misturado com não-diferenciada dividindo células ependimárias. En face-imagem usando wholemounts mostrou que este neuroepitélio mista tem arquitetura pinwheel constituído das terminações apical de células do tipo B1, rodeados de grandes superfícies apicais das células ependimárias 4. Esta análise en-cara esclareceu a nossa compreensão da linhagem de células-tronco neurais no cérebro embrionárias e adultas como consistindo de células com terminações apical na superfície do ventrículo e processos basal entrar em contato com um nicho vascular. Essas descobertas teria sido quase impossível utilizando técnicas clássicas de corte. Wholemounts também facilitar a identificação de células-tronco neurais através de seu processo de ventrículo-contactando apical. Como marcadores mais específicos para estas células-tronco são encontradas, wholemounts será parte integrante de identificar e analisar o comportamento das células-tronco neurais. Wholemounts das paredes do ventrículo lateral também apresentar a perspectiva ideal para estudar a polaridade planar de células ependimárias. Células ependimárias são células que revestem os ventrículos multiciliated que a função de impulsionar CSF de forma coordenada. Com a técnica wholemount, o epitélio toda ependimárias é exposta en-face e pode ser manchado e estudado de forma abrangente a partir do seu anterior para posterior e dorsal com as fronteiras ventral. Além disso, ensaios realizados em fluxo ependimárias intensamente dissecado, wholemounts viver robustamente demonstrar o fluxo planar polarizada gerados por cílios ependimárias. Trabalhos recentes usando abordagens wholemount descobriu determinantes celulares dessa polaridade planar ependimárias 5. Curiosamente, estudos wholemount também sugeriram que gerou um fluxo de ependimárias-CSF estabelece gradientes de chemorepellents que guiam a migração dos neurônios jovens na SVZ 7. Abordagens Wholemount que inicialmente identificou a rede de cadeias migratórias neuronal são, portanto, continuar a fornecer insights sobre os mecanismos que regulam a migração em cadeia. Análise da VZ e SVZ por wholemount imagem acrescenta uma nova abordagem para os dois futuros estudos e uma forma de esclarecer nossa compreensão dos estudos existentes. Por exemplo, um estudo recente sugere que as células-tronco neurais no SVZ adultos foram CD133 + / CD24-células em contato com o 8 ventrículo. Com base em suas imunocoloração em seções, esses autores afirmaram que essas células foram uma subpopulação de células ependimárias multiciliated. No entanto, em nosso estudo utilizando a abordagem wholemount, o que dá uma visão mais abrangente de todo o epitélio ependimárias, descobrimos que todas as células ependimárias expressar CD24 eo único ventrículo entrar em contato com as células que foram CD133 + / CD24-se um subconjunto do tipo B1 células 4. Além disso, a técnica wholemount promete ser útil em futuros estudos examinando a organização mosaico recentemente descrito de células-tronco neurais no cérebro adulto 9. Vários estudos têm mostrado que as células-tronco neurais no cérebro adulto não são uma população homogênea, mas são regionalmente especificada e, normalmente, produzem apenas subtipos específicos de interneurônios bulbo olfatório. Estes estudos têm proposto que diferentes subpopulações de células-tronco neurais pode ser distinguido, quer pela expressão dos fatores de transcrição específicos 10,11,12,13,14 e / ou por sua localização regional ao longo das extensões dorsal-ventral e antero-posterior do parede lateral 9,15,16. Como mais marcadores moleculares do subpopulações regional específico de células-tronco adultas neurais são identificados, imagem wholemount deve fornecer uma visão abrangente do parcelation destes domínios progenitor diferentes ao longo da parede ventricular. A dissecção wholemount e técnicas de imagem aqui apresentados também podem ser usados ​​para analisar as paredes ventricular no embrião. A dissecção da parede lateral é realizada embrionárias, passo-a-passo, da mesma maneira. Existem apenas pequenas diferenças no nível de dificuldade, os ventrículos embrionárias são relativamente maiores tornando a dissecção mais fácil, mas o tecido é mais macio fazendo a manipulação mais difícil. Em particular, uma exposição similar do ventrículo lateral pode ser usado em EmbryOS para dissecar a parede cortical do ventrículo para estudar a neurogênese cortical. Evidências recentes sugerem que a herança assimétrica centrossoma mantém glia radial na superfície ventricular durante a neurogênese cortical 17. En-face radial glial imagem de superfícies apical pode fornecer insights sobre como centrossomas dentro dessas células em divisão são assimetricamente herdada. Como a maioria das técnicas, especialmente aquelas que envolvem destreza precisa, o domínio requer prática. Há, no entanto, alguns elementos na dissecção que são fundamentais para obter melhores resultados: 1) de iluminação ajustar a iluminação da amostra para criar sombras fornece o contraste de valor inestimável durante a dissecção do tecido que é outra forma relativamente homogênea, 2) usando o fórceps como dois pinos de insetos a pinça nesta técnica nunca são usadas para comprimir juntos ou pegar o tecido, mas são usados ​​como pinos manobrável que podem ser continuamente reajustada para estabilizar o tecido durante o corte, 3) um balanço de retração gentil e corte a faca não deve só serão utilizadas para cortar, mas também para fornecer retração gentil para separar as paredes medial e lateral, lembrando que a maioria desta dissecção é realmente realizado pela retração gentil com apenas corte intermitente.

a zona subventricular en face: coloração wholemount e fluxo ependimárias

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

As paredes dos ventrículos laterais contêm a maior região germinal no cérebro adulto de mamíferos. A zona subventricular (SVZ) nessas paredes é um sistema modelo estudado extensivamente para a compreensão do comportamento das células-tronco neurais e regulação da neurogênese adulta. Tradicionalmente, estes estudos basearam-se em técnicas clássicas de corte para análise histológica. Aqui nós apresentamos uma abordagem alternativa, a técnica wholemount, que fornece uma visão completa e en face desta região germinal. Em comparação com seções, wholemounts preservar a citoarquitetura completa e relações celular dentro do SVZ. Esta abordagem revelou recentemente que o adulto de células-tronco neurais, ou células B1 tipo, fazem parte de um neuroepitélio misturado com diferenciados células ependimárias que revestem os ventrículos laterais. Além disso, esta abordagem tem sido utilizada para estudar a polarização planar de células ependimárias e do fluxo de líquido cefalorraquidiano que geram no ventrículo. Com evidências recentes de que células-tronco adultas neurais são uma população heterogênea que é regionalmente especificado, a abordagem wholemount provavelmente será uma ferramenta essencial para a compreensão da organização e divisão em parcelas deste nicho de células-tronco.

As paredes ventrículo lateral contêm a maior região germinal no cérebro adulto de mamíferos. Tradicionalmente, os estudos sobre a neurogênese na região têm contado com técnicas clássicas de corte para análise histológica. Aqui nós apresentamos uma abordagem alternativa, a técnica wholemount, que fornece uma visão completa e en face desta região germinal.

A zona subventricular En face: Coloração Wholemount e Fluxo ependimárias

As paredes dos ventrículos laterais contêm a maior região germinativa no cérebro de mamíferos adultos. A zona subventricular (SVZ) nestas paredes é uma ...

Olá, eu sou Zaman. Sou Arturo Alvarez-Buylla. Estamos aqui hoje no laboratório de Arturo, parte do Departamento de Neurocirurgia e do Centro Eli e Edythe Broad de Medicina Regenerativa e Pesquisa em Células-Tronco, e vamos mostrar como preparamos preparações completas das paredes dos ventrículos laterais.Esses preparos completos podem ser usados fixados para imunomarcação ou como preparações vivas para analisar o fluxo peniano. A técnica de preparo completo que Mann vai ilustrar para vocês hoje foi desenvolvida ao longo dos anos no laboratório e aperfeiçoada para estudar toda a parede dos ventrículos laterais, incluindo as células penianas e a atividade germinativa subjacente na zona subventricular, onde se localizam as células-tronco neurais. Essa técnica foi originalmente desenvolvida por Fiona Dutch e posteriormente aperfeiçoada por HIE Victor e Casu Moto.Nenhum deles está mais no laboratório. Os seguintes diagramas ilustram como preparar uma montagem inteira da parede lateral do ventrículo lateral. O cérebro é primeiramente dividido em dois hemisférios.Um corte coronal é feito posteriormente para expor o hipocampo e a seção transversal mostrada aqui em roxo. A parede medial, que recobre o hipocampo e é mostrada em roxo, é então destacada da parede lateral, que recobre o *stray aum* e é mostrada em rosa. As duas paredes serão afastadas uma da outra como ao abrir um livro, e a parede medial será removida, deixando a parede lateral exposta.A primeira seção deste vídeo aborda a dissecação em montagem inteira, mas essa pode não ser a primeira etapa. Cronologicamente, se houver planos de analisar um fluxo peniano, consulte o protocolo escrito para obter detalhes. Antes de cada dissecação, certifique-se de que todas as ferramentas estejam estéreis e à mão. Coloque uma placa de dissecação de seis centímetros com meio L-15 Leibovitz a 37 graus Celsius sob um microscópio estereoscópico de dissecação fluorescente e coloque um cérebro de camundongo recém-dissecado na placa sob o microscópio estereoscópico.Use a pinça fina para dissecar e remover os bulbos olfativos. Use uma faca de punção para dividir o cérebro em seus dois hemisférios. Corte na orientação coronal na extremidade posterior de um dos hemisférios.Para expor o hipocampo cordal e sua seção transversal, insira a faca de punção no pequeno espaço ventricular entre o córtex e o hipocampo e corte para liberar o córtex no ponto em que se conecta dorsalmente ao hipocampo. Remova uma fatia em forma de cunha do córtex no canto e use pinças finas para lentamente destacá-lo do hipocampo. Continue a destacar o córtex conforme ele envolve a borda ventral do hipocampo.Use uma faca de dissecação para soltar o hipocampo das partes ventrais do córtex. Use a faca e uma pinça fina para retrair o hipocampo para longe do córtex. Prossiga cuidadosamente em direção anterior sem danificar as paredes dos ventrículos.As duas paredes devem abrir para longe uma da outra. Como um livro com uma faca, corte as partes do córtex que sobressaem da parede lateral. Para visualizar melhor esta superfície à medida que a resistência à retração aumenta, duas incisões adicionais terão de ser feitas.Um dorsalmente, onde as paredes medial e lateral se encontram, e um corte semelhante ventralmente. Use pequenos movimentos da faca de punção para fazer esses cortes. Esses cortes adicionais permitem que a parede medial seja retratada ainda mais para revelar a porção anterior do ventrículo.Ajuste a iluminação de modo que as sombras revelem a junção entre as paredes medial e lateral, como um vale entre as duas paredes. Use a faca para cortar exatamente no vale, removendo o tálamo e qualquer córtex que esteja sobreposto.O monte com orifício deve ser usado imediatamente para uma análise de fluxo peniano. Se for necessário dissecar os montes com orifício para imunomarcação, muitos deles podem ser dissecados em uma única sessão, desde que sejam imersos no fixador à medida que forem sendo concluídos. A próxima seção do vídeo demonstrará como realizar ensaios do fluxo de fluido gerado pelos cílios das células ependimárias.Utilizando microesferas fluorescentes. O fragmento fresco da parede lateral dissecado é primeiro fixado ao recipiente de dissecação com dois alfinetes entomológicos. Em seguida, a ponta de uma micropipeta de vidro preenchida com microesferas fluorescentes é abaixada sobre a superfície do espécime em preparação inteira, e as microesferas fluorescentes são suavemente depositadas sobre a superfície durante a aquisição de imagens em lapso de tempo.O vídeo registra o movimento dos microesferas no ensaio de fluxo anexo. Uma micropipeta de vidro deve ser preparada antes da dissecação em preparação inteira, conforme descrito na parte escrita deste protocolo. A micropipeta pronta deve ter uma conicidade suave e gradual e um bisel de 45 graus com diâmetro interno de aproximadamente 100 micrômetros.Complete o interior da pipeta com óleo mineral por ação capilar até cerca da metade. Insira um êmbolo revestido com graxa de vácuo na extremidade traseira da pipeta. Em seguida, empurre-o para avançar o menisco do óleo até a ponta da pipeta.Fixe a pipeta com êmbolo a um micromanipulador em um braço ajustável. Carregue a pipeta pela frente com uma solução contendo 50% de microesferas fluorescentes, 5% de glicerol e 45% de água. Disseque recentemente uma lâmina com orifício conforme mostrado anteriormente e transfira-a com o lado do ventrículo voltado para cima para um recipiente de dissecação limpo contendo água a 37 graus Celsius.No meio Leitz, imobilize o suporte com orifício na placa de dissecação utilizando dois alfinetes entomológicos no tálamo e no córtex dorsal anterior. Coloque a base do braço fixo que segura o micromanipulador ao lado do microscópio estereoscópico, mantendo o braço elevado para evitar quebrar a agulha da micropipeta. Mergulhe a ponta da micropipeta em um tubo com meio para remover micropartículas da superfície externa da ponta.Tendo cuidado para não quebrar a ponta. Posicione a ponta das pipetas sobre a superfície dorsal da parede lateral e abaixe o braço para trazer a ponta da pipeta logo acima da superfície do tecido. Foque em um campo de visão que compreenda a metade anterior do preparado montado, e comece a gravar as imagens desejadas.Use o êmbolo para ejetar aproximadamente cinco litros das microesferas sobre a superfície do orifício do suporte. Após a quantidade inicial de esferas ter sido removida da superfície por um fluxo penal, use o êmbolo para ejetar rodadas adicionais de cinco nanolitros de microesferas. O fluxo, a direção e a velocidade podem ser analisados utilizando o vídeo gravado.A última seção deste vídeo demonstra como os montes de folículos são imunomarcados e montados sobre lâminas para imagem confocal. Montes de folículos recém-dissecados são inicialmente transferidos para uma placa de 24 poços e fixados por imersão em paraformaldeído. Em seguida, realizam-se uma série de incubações com anticorpos primários e, posteriormente, com anticorpos secundários conjugados a fluoróforos, com lavagens intercaladas.Após a coloração, os preparados completos são subdissecados para separar apenas a fina camada da parede lateral que contém a zona subventricular do restante do preparado completo, que inclui o estrato estromal subjacente e o córtex. Esse pequeno fragmento fino e plano de tecido é então transferido para uma lâmina e coberto com lamínula para fixar os preparados completos para imunocoloração. Uma placa de 24 poços contendo paraformaldeído 4% e Triton X-100 0,1% sobre gelo.Em uma cabine de exaustão química, imerja suavemente o monte com orifício dissecado, com o lado do ventrículo voltado para cima, em um poço da placa. Fixe a amostra durante a noite a quatro graus Celsius, aspire o fixador e utilize uma pipeta de transferência para lavar cuidadosamente o monte com orifício uma vez com XPBS contendo 0,1% de Triton X-100, três vezes por cinco minutos cada. Em todos os passos que envolvam manipulação de líquidos, pipete suavemente junto à parede do poço para evitar virar o monte com orifício e danificar o tecido.Adicione uma solução bloqueadora contendo Triton X e soro normal de cabra a 10% em 1x PBS, usando até 2% de Triton X, dependendo da profundidade necessária de penetração do anticorpo. Incube o preparo inteiro na solução bloqueadora por uma hora. À temperatura ambiente, remova a solução bloqueadora.Adicione os anticorpos primários diluídos na solução bloqueadora e incube a quatro graus Celsius por 24 ou 48 horas, dependendo do antígeno-alvo. Lave com duas lavagens rápidas de um XPBS com Triton X, seguidas por três lavagens de 20 minutos cada à temperatura ambiente. Adicione os anticorpos secundários diluídos na solução bloqueadora e incube a quatro graus Celsius pelo mesmo período de tempo utilizado para o anticorpo primário, lavando da mesma forma que para os anticorpos primários. A próxima série de etapas demonstra como dissecar apenas a parede lateral do restante do espécime inteiro como um único espécime plano, que então pode ser montado para imagens de alta resolução.Retorne o monte do orifício de imunomarcação com o ventrículo voltado para cima para um recipiente de dissecação limpo contendo uma XPBS sob o microscópio estereoscópico, movendo-se de posterior para anterior. Use uma lâmina de dissecção para remover o córtex dorsal e o corpo caloso branco subjacente, a fim de visualizar a interface entre a zona subventricular e o estriado. Em seguida, faça um corte horizontal longo na face ventral do monte inteiro.Use pin&ccedil;as finas para posicionar o tecido nesta nova borda plana de modo que a superf&iacute;cie dorsal esteja voltada para cima. A zona subventricular &eacute; uma faixa fina de tecido homogeneamente rosa, enquanto o estriado &eacute; infiltrado por cord&otilde;es de mat&eacute;ria branca. Use as pin&ccedil;as como dois pinos na AUM para fixar o tecido sem danificar a parede ventricular.Começando anteriormente. Use o bisturi para iniciar cuidadosamente o corte entre o estriado e a zona subventricular. É importante manter os cortes paralelos à superfície ventricular e preservar a espessura do tecido dissecado.À medida que a zona subventricular afina posteriormente, remova cuidadosamente todos os tecidos circundantes dos fragmentos montados que não fazem parte da parede ventricular. O fragmento montado deve ter uma espessura uniforme entre 200 e 300 micrômetros.Use uma pinça para levantar a pequena porção de tecido por baixo e transfira-a para uma lâmina de microscópio. Aplique meio de montagem, seguido por uma lamínula. Tente não introduzir bolhas de ar.Armazene as lâminas em posição plana em um porta-lâminas a quatro graus Celsius por um a dois dias para permitir que as lamínulas assentem antes da obtenção das imagens das amostras. A seguir, alguns resultados representativos para imunomarcação em montagem inteira e ensaios de fluxo apendicular. A primeira imagem é uma vista de baixa ampliação de uma marcação em montagem inteira para double cottin, um marcador de neuroblastos que demonstra a rede de cadeias de neurônios jovens em migração na zona subventricular adulta.A seguir, há outra imagem com baixa ampliação de um preparado em montagem de furo corado para KI 67 em verde e vasos sanguíneos em vermelho, ilustrando a interação próxima recentemente descrita entre células em divisão e a vasculatura na zona subventricular, com maior aumento. A próxima imagem mostra uma imagem confocal da superfície ventricular, com a superfície apical das células que revestem o ventrículo delineada pela coloração em verde para beta-catenina e os corpos basais dessas células marcados pela gamatubulina em vermelho. A última imagem com alta ampliação é uma projeção máxima de um empilhamento confocal obtido a partir de uma coloração em montagem inteira para GFAP, mostrando a longa fibra basal positiva para GFAP das células do tipo B1 da ZVS para analisar o fluxo, a direção e a velocidade do LCR na superfície ventricular.Quadros consecutivos de filmes de fluxo de apêndices podem ser combinados em uma única imagem composta. Essas imagens compostas mostram a posição de microesferas individuais em diferentes momentos enquanto percorrem o apêndice ou a superfície. A seguir, há um exemplo de como os resultados se apresentam quando completos.Você acabou de ver como preparar montagens inteiras da zona subventricular da parede lateral do ventrículo lateral. Isso fornece uma visão em montagem inteira de toda a parede e permitiu diversas descobertas ao longo dos anos, incluindo a observação de que esta região ventricular é organizada como uma rede de vias para migração em cadeia. Também nos permitiu estudar como o fluxo de líquido deste painel de serviço passa sobre esta parede e, indiretamente, sugeriu formas pelas quais essas células orientam sua migração através dessa extensa rede de vias.Mais recentemente, esta técnica permitiu-nos descobrir que a zona subventricular é organizada como rodas de pino, com as células-tronco no núcleo dessas rodas, revelando o posicionamento apical das células-tronco dentro dessa estrutura. Como o preparo em montagem inteira permite uma perspectiva completa dessa zona ventricular, fornece uma visão que cortes histológicos não conseguem oferecer, e por essa razão, estamos disponibilizando-o para todos, pois deverá ser útil para muitos outros estudos. Existem algumas chaves importantes a lembrar ao preparar montagens inteiras que melhorarão suas dissecações.O primeiro é ter uma iluminação adequada, ajustando-a para projetar sombras sobre o suporte do orifício. Isso proporcionará contraste e mostrará onde você deve fazer os cortes. O segundo é usar a pinça como dois pinos móveis.Você não deve usar a pinça para comprimir ou levantar o tecido. Em vez disso, utilize-a como dois pinos móveis que fixarão o tecido enquanto você realiza o corte. A terceira técnica consiste em usar uma combinação de retração geral e corte.Como você observa nas dissecações, muito pouco corte de tecido é realmente realizado. A maior parte da dissecação é feita por retração geral durante a segunda etapa da dissecação, quando você está removendo a parede lateral do restante do espécime inteiro.A coisa mais importante é orientar seus cortes em um plano paralelo ao plano da superfície ventricular. Isso garantirá que você tenha uma espessura única de anterior a posterior ao longo da parede lateral. E isso também garantirá que, ao realizar imagens confocais de alta resolução, todas as imagens fiquem nítidas em um único plano.Esperamos que este vídeo seja útil para seus estudos. Boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Circuitos neurais são topograficamente organizados em compartimentos funcionais específicas com perfis moleculares. Aqui, apresentamos os passos práticos e técnicos para revelar topografia cérebro global usando uma abordagem de coloração imuno-histoquímica wholemount versátil. Nós demonstrar a utilidade do método utilizando o citoarquitetura bem compreendida e os circuitos de cerebelo.

Imuno-histoquímica para Topografia Wholemount cerebrais, Complexo

Um método para carregar subventricular zona (SVZ) de células com corantes de cálcio indicador de actividade de cálcio gravação é descrito. A SVZ pós-natal contém células hermeticamente embalados, incluindo as células progenitoras neurais e neuroblastos. Ao invés de usar o carregamento banho foi injetado o corante por pressão dentro do tecido, permitindo uma melhor difusão de corante.

Preparação de fatias agudas zona subventricular for Imaging Cálcio

Usando exames de ressonância magnética (humana), software de imagem 3D e análise imuno-histológica, documentamos alterações nos ventrículos laterais do cérebro. O mapeamento longitudinal 3D das alterações do volume do ventrículo lateral e a caracterização das alterações celulares periventriculares que ocorrem no cérebro humano devido ao envelhecimento ou doença são então modelados em camundongos.

Modelagem 3D do lateral ventrículos e histológica Caracterização do Tecido Periventricular em humanos e mouse

Aqui descrevemos um procedimento baseado no uso de partículas lentivirais para a modificação genética de longo prazo de células-tronco neurais e/ou suas células ependimárias adjacentes no nicho neurogênico ventricular-subventricular adulto que permite a análise separada de efeitos celulares autônomos e não autônomos, dependentes de nicho em células-tronco neurais.

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Aqui nós apresentamos um protocolo baseado em microscopia para imagens de alta resolução e uma reconstrução tridimensional do mouse unidade neurovascular e barreira hemato - encefálica usando seções flutuantes de cérebro. Este método permite a visualização, análise e quantificação das organelas intracelulares no BBB.

De alta resolução de imagem latente Confocal da barreira sangue - cérebro: geração de imagens, reconstrução 3D e quantificação de Transcytosis

O objetivo deste protocolo é isolar microvasos de várias regiões do sistema nervoso central de vertebrados lissencefálicos e girofálicos.

Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

Este artigo apresenta um protocolo passo-a-passo para a implantação direta de cânula na cisterna magna dos suínos.<br...

Implantação direta de cânula na Cisterna Magna dos Porcos

Este protocolo descreve uma abordagem eficiente e reprodutível para estudos histológicos cerebrais do camundongo, incluindo perfusão, seção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem.

Imunostaining flutuante livre de cérebros de rato

A dissecção crio-seção permite a preparação fresca e congelada do maior nicho neurogênico do cérebro murino para análise profunda de proteome quantitativo. O método é preciso, eficiente e causa perturbação mínima do tecido. Portanto, é ideal para estudar o microambiente molecular desse nicho, bem como outros órgãos, regiões e espécies.

Dissecção crio-seção da zona subependímal adulta para análise proteome quantitativa precisa e profunda

O plexo coroide (PC), um tecido pouco estudado em neurociência, desempenha um papel fundamental na saúde e doença do sistema nervoso central. Este protocolo descreve uma técnica de microdissecção para isolamento do CP e o uso de microscopia eletrônica de varredura para obter uma visão global de sua estrutura celular.

Microdissecção e Visualização por Microscopia Eletrônica de Varredura de Montagem Completa do Plexo Coroide de Camundongos

Um método para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras de oligodendrócitos do cérebro de ratos vivos é apresentado aqui em detalhes experimentais. Permite múltiplas coletas dessas células dos mesmos animais sem comprometer seu bem-estar.

Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos

Aprenda a técnica de wholemount para estudar as paredes do ventrículo lateral e analisar o fluxo ependimário usando microesferas fluorescentes em camundongos. Este método revela a neurogênese na zona subventricular.

A zona subventricular En face: Coloração Wholemount e Fluxo ependimárias

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