Extração de DNA a partir do Micróbios Gut da térmita (Zootermopsis Angusticollis) e Visualizing micróbios do intestino

Aqui, sua reação a esse ambiente não é, não é única. A maioria das pessoas, mesmo os não cientistas, fica bastante impressionada. Sim. Pelo, A diversidade e complexidade.

Olá, meu nome é Eric Matson e sou pós-doutorando no Departamento de Engenharia Ambiental e Científica aqui no Instituto de Tecnologia da Califórnia. Meu trabalho sob a direção do professor Jared Ledbetter se concentra nas interações microbianas e na diversidade de espécies que habitam o intestino posterior dos cupins. Em particular, estamos interessados em algumas das vias bioquímicas que acontecem e, especialmente, no processo de agenesia ace, pelo qual esses micróbios consomem gases hidrogênio e CO2 e os convertem em acetato, que é um nutriente chave do metabolismo energético do hospedeiro cupim.

Eu e outros no laboratório desenvolvemos conjuntos de primers direcionados para poder entrar e avaliar as principais enzimas nessa via. Mas, para fazer isso, é necessário gerar amostras de DNA limpas da comunidade comunitária, DNA, a fim de usar como alvos para esse processo. Então, hoje eu queria demonstrar como dissecamos as espécies de cupins de que estamos falando, extraímos o DNA do intestino posterior e depois o purificamos e o usamos posteriormente para investigações.

Hoje vamos nos concentrar em uma espécie de cupim, em particular chamada Zo Opsis Nevadensis. Este é um cupim de madeira úmida da Califórnia coletado localmente aqui, e é uma espécie bastante grande, o que torna muito fácil fazer as dissecações e extrações. Ok, então hoje eu já preparei alguns dos suprimentos que precisaremos para o procedimento.

Uma das primeiras coisas de que precisamos é de uma certa quantidade de gelo para resfriar os insetos que serão dissecados. Eu também pré-resfriei um pouco de tampão TE, e isso contém um composto que ajudará a estabilizar o DNA assim que for liberado das células aqui. Eu tenho frascos estéreis pré-carregados com contas de silicato de zircônia de zircão.

Estas são contas de 0,1 milímetro e há cerca de meio grama ou mais aqui. Isso é o que realmente faremos, cisalhamento mecânico. E então eu tenho alguns reagentes envolvidos no procedimento de lise e purificação.

Aqui eu tenho uma garrafa contendo 1% de polivinila PolyOne ou PVPP no tampão. O PVPP é importante para remover ácidos húmicos das preparações de DNA, o que pode inibir nossa análise de PCR dos resultados. E então eu tenho um pouco de sulfato de ECCO de sódio, que é um surfactante que usaremos para ajudar a extrair e interromper as células.

E então, para fazer a dissecação dos cupins, tudo o que precisamos é de uma pinça estéril. Eles têm pontas bastante finas e é disso que usaremos para remover as trilhas intestinais. E, finalmente, para fazer o cisalhamento mecânico, temos um dispositivo de batida de abelha aqui que gira em, em, em RPMs muito altas e, junto com as esferas de silicato de zircônia zir, fará a ruptura mecânica das células.

Então, depois de coletarmos os cupins no campo, nós os trazemos de volta aqui para o laboratório. A maioria dos cupins de madeira úmida da Califórnia com os quais trabalhamos são muito propensos à dessecação. Portanto, um dos avanços que fizemos neste laboratório é incorporar o uso de câmaras com umidade controlada, como esses tanques de peixes de 10 galões.

Aqui dentro, coletamos as colônias individuais e as mantemos separadas nelas, nessas caixas. E na base do tanque estão basicamente recipientes que possuem diferentes soluções salinas. Este em particular contém uma solução de fosfato de potássio, que mantém a umidade relativa em torno de 95 a 96%, o que é perfeito.

E, com essas condições, tivemos os cupins realmente se reproduzindo em cativeiro, porém, quando queremos ir e realmente fazer um experimento, coletamos frescos do campo. Mas nesta caixa você pode ver um pouco da madeira da qual eles se alimentam. Este é apenas Ponderosa ou Jeffrey Pine que coletamos no, no local do, ninho de cupins.

E há uma série de diferentes moldes de cupins, incluindo os reprodutores masculinos e femininos. A maior parte da colônia é composta de cupins operários com o número de elencos de soldados também. Curiosamente, os soldados têm mandíbulas de partes bucais projetadas para defender a colônia e não para comer madeira.

E então eles dependem dos cupins operários para alimentá-los também. E então você pode ver nesta caixa tanto os cupins operárias quanto os soldados, bem como alguns filhotes que eclodiram recentemente dos ovos. Bem, em cativeiro aqui.

Então, eu selecionei cinco cupins operários do grupo que acabei de mostrar a vocês. E comecei resfriando-os no gelo aqui. Para me preparar para a dissecação, vou usar essas pinças e trabalhar com a ajuda de um escopo de dissecação, e espero que você possa ver o grande volume intestinal que poderemos remover de cada um desses indivíduos.

Basta virar o cupim de costas e com uma pinça, você segura a ponta da cabeça e com a outra, tudo o que você faz é beliscar. Apenas na ponta do abdômen aqui. E com um pólo, você deve ver o trato intestinal sendo removido do organismo. Okey.

E você pode ver que o grande volume, cerca de 30% 40% do peso do inseto, na verdade, está contido nesse ambiente. E você pode ver que ele está dividido em várias seções. Temos os quatro intestinos e depois o intestino médio, e então esse soco no intestino traseiro, que é a câmara muito grande que contém a maior parte da comunidade microbiana que realiza as fermentações.

Então, aqui eu removi as entranhas de cinco cupins operários. E agora o próximo passo é estabilizar os ácidos nucléicos contidos na comunidade aqui em uma solução de tampão gelado. Neste ponto, eles podem ser congelados a menos 20 graus Celsius se você estiver trabalhando em campo.

Ou podemos continuar direto com o procedimento de extração. Mas todas as células e, e e o material de DNA ainda estão contidos no intestino. E eu vou colocá-los em 100 microlitros de tampão.

Ok, antes de realmente começar a extração das amostras intestinais, preciso preparar o tampão que vou usar para interromper as células e tecidos. Então, a esse tubo que eu já tenho cerca de meio grama de contas de zircão, vou adicionar PVPP 700 microlitros disso. Este é o tampão de 1% e 50 microlitros de uma solução de 20% de SDS.

É importante ressuspender o PVPP antes de adicioná-lo, pois é insolúvel em tampões aquosos. Neste ponto, estamos prontos para adicionar o fenol à amostra, então vou usar uma pipeta para adicionar cerca de 500 microlitros ou mais. Okey. E com isso, estamos prontos para começar a extração. Sim.

Com o fenol adicionado, estamos prontos para adicionar a amostra intestinal que dissecamos do cupim anteriormente, então isso ajuda a macerar um pouco os tecidos. Isso tende a tornar a transferência um pouco mais fácil. E agora, com o fenol adicionado, estamos prontos para começar a interrupção mecânica com o dispositivo de beading de contas.

A técnica que vamos usar é de três ciclos em velocidade máxima, 30 segundos, seguidos de 30 segundos no gelo. É importante incorporar o passo no gelo para resfriar a amostra, pois ela tende a aquecer por causa do atrito. Então, vou inserir a amostra no dispositivo de contas aqui, e vou por 30 segundos. Okey.

No final do procedimento, você deve ver que a maior parte do tecido foi homogeneizada. Deve haver muito poucos aglomerados restantes, e você verá que é, tem uma aparência meio espumante, provavelmente por causa do SDS lá. Neste ponto, estamos prontos para centrifugar e, em seguida, iniciar a purificação de extração real do próprio DNA desta amostra.

Agora que interrompemos mecanicamente as células, vamos centrifugar o material insolúvel. Faremos isso colocando a centrífuga e usando 8.000 vezes a gravidade por um minuto. E agora o que esperamos ver é a maior parte do material solúvel coletado perto do fundo do tubo.

E o que nos interessa é a solução aquosa no topo. E é isso que realmente adicionaremos ao kit de extração de DNA KaiGen seguindo o procedimento para lisado bruto. Agora que temos nossa centrífuga de amostra, vamos pegar 200 microlitros por preparação do sobrenadante e vamos extrair o DNA apenas usando o kit A-D-N-E-Z KaiGen usando o protocolo indicado para lisado bruto.

Agora temos os 200 microlitros de amostra de intestino, e vou continuar usando o kit kyogen d easy usando o protocolo indicado para lisado bruto. Sempre que fazemos uma extração intestinal, é sempre uma boa ideia verificar o estado do conteúdo intestinal. Então, fazemos isso dissecando um cupim e apenas certificando-se de que ele seja representativo de coisas que vimos no passado.

Na verdade, faremos isso visualmente observando as células dessa comunidade microbiana. Apenas na ponta do abdômen aqui. E com um poste, você deve ver o trato intestinal.

Portanto, esta é apenas uma solução salina tamponada que corresponde muito de perto à composição do fluido intestinal real do cupim. E eu vou macerar isso um pouco e depois adicioná-lo à lâmina do microscópio e vamos dar uma olhada. Ok, agora estamos prontos para olhar para isso no microscópio.

Sim, isso parece muito bom. Intestino de cupins. Existem representantes de todos os três domínios reconhecidos da vida.

Existem protozoários eucarióticos, organismos de metanfetamina e também bactérias. E nosso laboratório está predominantemente preocupado com a população bacteriana neste ambiente. Ou seja, os SPI kes neste tipo particular de cupins estão entre os membros bacterianos mais dominantes da comunidade.

E nossa pesquisa atual mostra que, de fato, eles se envolvem em grande parte na cetogênese redutora de CO2. Então, esses são apenas vários tipos diferentes de protozoários, e acredita-se que eles participem, ou seja, na decomposição primária da madeira. Portanto, acredita-se que eles contenham xin AEs e celulase que permitem que suas enzimas acessem esses polímeros de madeira.

E, e então eles, eles os fermentam em monômeros de mono açúcar e, e, e polímeros que são posteriormente decompostos por outros membros da comunidade. E esses protozoários também produzem acetato, mas, mas um de seus subprodutos é hidrogênio e CO2 e esse hidrogênio e CO2 novamente é, é o que é usado ou consumido pelas populações de aceto neste ambiente. E aqui você pode ver um enxame de protozoários, provavelmente ao lado de uma espécie muito grande de truque e infa lá.

É um dos maiores organismos no intestino do cupim. À medida que você desce e realmente olha para as áreas que não contêm essas grandes células de protozoários, você verá que o fundo é esse tipo de fluido intersticial que também é carregado com spi, keets e outras células bacterianas. E então, você sabe, a complexidade não diminui mesmo nesses espaços.

Uma das coisas que devo salientar é que o volume típico do soco no intestino traseiro, como o que vimos aqui, é de dois a cinco microlitros, dependendo do tamanho do cupim. E então a preparação de montagem úmida que eu fiz aqui realmente representa pelo menos uma diluição de um a 20 desse ambiente. E então, na verdade, essas espécies estão compactadas em muito, muito mais densamente no intestino intacto real do que o que está representado aqui.

Então isso lhe dá uma ideia da densidade e da diversidade da vida neste, neste ambiente. Então, hoje eu mostrei como isolamos o DNA do intestino do cupim com essas amostras purificadas. Agora poderemos aplicar os conjuntos específicos de primers direcionados.

Ou seja, vamos olhar para genes para formar uma desidrogenase, monóxido de carbono desidrogenase e síntese formal de tetra hidrofolato, que são três dos conjuntos de primers que nosso laboratório desenvolveu. Estamos interessados em estudar a diversidade e as características específicas da sequência de vários desses genes diferentes para este ambiente. Então, isso envolverá a amplificação da PCR dos diferentes genes, clonando-os, sequenciando-os e construindo inventários de genes.

Com base nos resultados, podemos aprender algo sobre a natureza de algumas dessas interações e, especificamente, como essas vias são construídas nesses diferentes microrganismos por meio desse processo.