Name: Modelos de mouse de leucomalácia periventricular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprenda a criar modelos de leucomalácia periventricular em camundongos P6 usando ligadura carotídea unilateral, hipóxia e lipopolissacarídeo. Este método permite estudar lesões de matéria branca e testar terapias potenciais.

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Este trabalho é, em parte suportado por concessões do National Institutes of Health (RO1 NS059043 e RO1 ES015988), Multiple Sclerosis Society Nacional, Fundação Roche para Anemia Research, Feldstein Fundação Médica e Hospitais Shriners para Crianças. Gostaríamos de agradecer ao Dr. David Prazer para suas sugestões. Este trabalho foi em parte suportado por concessões para WD de National Institutes of Health (RO1 NS059043 e RO1 ES015988), Sociedade Nacional de Esclerose Múltipla, e Hospitais Shriners para Crianças. Declaramos a inexistência de interesses concorrentes relacionados para este artigo.

Procedimentos detalhados de criação de lesão cerebral neonatal em ratos P6: <ol><li> Pós-natal do dia 6 (P6) ratos são anestesiados com refrigeração indireta sobre o gelo ao ponto de insensibilidade ao estímulo nocivo (anestesia profunda). </li><li> Após a limpeza da pele com álcool, uma incisão mediana ventral é feita no pescoço anterior. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, a bifurcação da artéria carótida comum direita é abordado por gentilmente retrair os músculos omo-hióideo e esternocleidomastóideo. </li><li> A fascia em torno da bainha carotídea é removido, eo ramo proximal interna isolada do nervo vago nas proximidades e gânglios simpáticos com um gancho. A artéria carótida interna é então cauterizados com uma ponta de cauterização. </li><li> Após a cauterização, a incisão na pele é suturada, eo animal é mantido quente até que esteja completamente desperto e depois voltou para a represa. </li><li> Uma hora após a ligadura, o animal é colocado em uma câmara selada infundido com nitrogênio, até um nível de 6,0% O 2 é atingido. O animal é então exposto a 35 min de hipóxia. </li><li> Após a exposição a hipóxia, o mouse se recupera em uma almofada de aquecimento (33 ° C) por 30 min e depois é devolvido à represa. Para a criação de lesão cerebral com hipóxia combinado / isquemia e infecção / inflamação, o animal é então injetado intraperitonealmente com 0,015 ml de lipopolissacarídeo (LPS, 1 mg / kg). </li><li> Quatro dias post-hypoxia/ischemia, os ratos são anestesiados com refrigeração indireta sobre o gelo até o ponto de indiferença a estímulos nocivos, então perfundidos com solução salina e, em seguida, paraformaldeído 4%. Cérebros são removidos e cryoprotected. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1951/1951fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Caracterização de lesão cerebral no modelo do rato hipóxica / isquêmica com coloração H &amp; E. Há necrose focal (setas) na substância branca cerebral ipsilateral (A) para a ligadura de carótida, em comparação com a matéria cerebral contralateral branco (B). Necrose focal ipsilateral e microinfartos são observadas no hipocampo (C) eo tálamo (D) no cérebro com lesão da substância branca cerebral ipsilateral. Resultados representante e números: Modelos do rato do PVL com hipóxia / isquemia e / ou infecção / inflamação são alcançados pela ligadura de carótida unilateral seguido pela exposição à hipóxia e injeção de LPS. Estamos definindo os modelos novo mouse como adequados modelos LPV. O estudo neuropatológico de cortes coronais corados com hematoxilina e eosina (H &amp; E) através da parte frontal do cérebro inteiro revela necrose focal na questão central branca do hemisfério cerebral ipsilateral à ligadura de carótida (Fig. 1A), com relativa preservação dos neurônios no o córtex cerebral sobrejacente comparação com a matéria cerebral contralateral branco (Figura 1B). Em matéria de necrose focal branco, existe um marcado aumento da celularidade composto de macrófagos e astrócitos reativos, como é característico de LPV focal humana. Na questão central contralateral branca, os núcleos são organizados em oligodendroglial fascicular-como feixes, essa arquitetura é completamente interrompido pela necrose focal no lado ipsilateral. De nota, também observamos necrose ipsilateral no hipocampo (Fig. 1C) eo tálamo (microinfartos focal) (Figura 1D) no cérebro com lesão da substância branca cerebral ipsilateral. PVL humana também não ocorre em completo isolamento que acompanham lesões massa cinzenta. A marca da PVL é o relativo, embora não seja completa, poupando do córtex cerebral que cobre o assunto feridos branco - um recurso que nós acreditamos que está presente em nossos modelos de mouse. <img src="/files/ftp_upload/1951/1951fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Escala de pontuação de 0-5 para avaliar lesão da substância branca pelo PAM ou O1 em modelos do rato de leucomalácia periventricular. Nossos modelos de rato mostram características de PVL, tanto a nível fenotípico e molecular. Temos usado a detecção imunocitoquímica da proteína básica da mielina (MBP) ou O1 antígeno para avaliar lesão, criaram uma escala padrão 0-5 para marcar a lesão da substância branca (Fig. 2), e caracterizaram a substância branca patologia (Fig . 3). Mais recentemente, um ensaio não-tendenciosa estereológica foi implementado para substituir o método semi-quantitativo inicial. Além disso, para testar efeitos correlatos de lesão da substância branca nos resultados funcionais, temos realizado testes comportamentais para a função motora. Temos demonstrado que os ratos apresentam déficits motores atacando P10-21 hipóxia seguintes / isquemia mais LPS em P6. Nós estabelecemos critérios de pontuação com uma escala de 0-4 para definir disfunção membro contralateral em ratos feridos no P10-21. Normalmente, os ratos normais pode scamper uma inclinação de 30 º (nota 4) e subir a 45 ° inclinação sem deslizar (escore de 3). Camundongos feridos têm notas mais baixas em correlação com os graus de lesão da substância branca. <img src="/files/ftp_upload/1951/1951fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Caracterização de lesão da substância branca pelo PAM ou O1 coloração e estrutura da mielina por microscopia eletrônica (EM). MBP e coloração O1 mostrar a perda de mielina na substância branca cerebral ipsilateral à ligadura, em comparação com substância branca contralateral. EM exame mostra axônios mielinizados na massa branca cerebral contralateral à ligadura e degenerou tecido na substância branca ipsilateral. Prevemos que o estabelecimento dos modelos novo mouse da LPV nos permitirá estudar mecanismos específicos de PVL-like lesão no cérebro imaturo. Iremos abordar patogênese usando linhagens de camundongos transgênicos para examinar o papel de moléculas individuais de interesse e avaliar as metas de neuroproteção.

<ol><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVolpe%2C+JJ+%22Neurology+of+newborn%22">Neurology of newborn</a>. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).</li>
<li>Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+periventricular+leukomalacia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Progress in periventricular leukomalacia.</a> Arch. Neurol. 65, 1291-1295 (2008).</li>
<li>Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor-mediated+oligodendrocyte+toxicity+in+periventricular+leukomalacia%3A+a+protective+role+for+topiramate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate.</a> J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Prejuízo para o desenvolvimento do cérebro leva a consequências devastadoras neurológicos. Surpreendentemente, o padrão de lesão cerebral perinatal é altamente dependente da idade. Em bebês nascidos a termo, que afeta predominantemente o córtex cerebral com perda neuronal característica. No entanto, em bebês prematuros, que afeta seletivamente substância branca cerebral com lesão importante para o desenvolvimento oligodendrócitos, um distúrbio chamado de leucomalácia periventricular (LPV). A magnitude do problema de lesão cerebral em bebês prematuros é extraordinário. Parto prematuro e de cuidados intensivos neonatal melhorou levaram a quase 90% de sobrevivência dos 13 milhões de bebês prematuros em todo o mundo (cerca de 56.000 nos Estados Unidos), nascido anual com um peso menor que 1500 gramas, ou seja, de muito baixo peso ao nascer. Aproximadamente 10% dos sobreviventes posteriormente apresentam paralisia cerebral e cerca de 50% têm déficit cognitivo e comportamental. PVL é o mais importante patologia cerebral paralisia cerebral subjacente em prematuros. Nenhuma terapia específica para PVL existe presentemente, em parte porque a patogênese não foi bem compreendida 1,2. Embora a etiologia da PVL é multifatorial, perinatal hipóxia / isquemia com infecção intra-uterina materna é pensado para ser uma causa primária de LPV. Um modelo de hipóxia / isquemia da LPV no rato em P7 foi previamente estabelecido 3. Este modelo é o único que se assemelha a PVL em prematuros. A principal característica deste modelo é seletiva substância branca patologia, em contraste com a maioria dos modelos de acidente vascular cerebral que são caracterizados por infarto massa cinzenta. No entanto, as limitações do modelo hipóxico-isquêmica no rato não deve ser menosprezada. Primeiro, a etiologia da PVL é frequentemente multifatorial. Além da inflamação hipóxia / isquemia, infecção materno-fetal / está fortemente associada a LPV. Assim, a inflamação hipóxia / isquemia e infecção / combinado provavelmente criar modelos mais PVL-like. A idade de roedores que melhor se correlaciona com o período de desenvolvimento humano de maior risco para lesões PVL (24-32 semanas de gestação) é pós-natal, porque a diferenciação oligodendroglial é predominantemente um evento pós-natal em roedores. Como é impossível produzir uma infecção materno-fetal / inflamação nas idades pós-natal, seria razoável para simular uma infecção numa fase pós-natal relevantes do desenvolvimento para criar um modelo do roedor da LPV. Temos procurado combinar a injeção de LPS com o modelo hipóxica / isquêmica em ratos em P6, para produzir mais clinicamente relevantes lesões LPV. Em segundo lugar, a abordagem de prova de conceito do ideal experimental para um papel causal de uma molécula requer o uso de camundongos transgênicos; manipulações genéticas são muito mais difíceis no rato do que no mouse. Assim, procuramos converter o nosso modelo experimental de PVL do rato para o mouse. Modelos do rato do PVL irá facilitar grandemente 1) o estudo da biologia da doença e patogênese disponíveis usando linhagens de camundongos transgênicos, 2) realização de testes de drogas para descobrir agentes candidato com potencial terapêutico; 3) testar a utilidade de células-tronco usando linhagens de camundongos imunodeficientes.

<table><tbody><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4130</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de hipóxia</td><td>BioSpherix</td><td>A-30274</td><td></td></tr><tr><td>Gancho cirúrgico</td><td>F.S.T.</td><td>10064-14</td><td></td></tr></tbody></table>

modelos de mouse de leucomalácia periventricular

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

Nós descrevemos um protocolo para o estabelecimento de modelos de ratos de leucomalácia periventricular (LPV). PVL é a forma predominante de lesão cerebral em bebês prematuros e de o antecedente mais comum de paralisia cerebral. PVL é caracterizada por lesão da substância branca periventricular com lesão oligodendroglial proeminente. Hipóxia / isquemia, com ou sem infecção sistêmica / inflamação são as principais causas de LPV. Nós usamos ratos P6 para criar modelos de lesão cerebral neonatal pela indução de hipóxia / isquemia, com ou sem infecção sistêmica / inflamação com ligadura de carótida unilateral seguido pela exposição à hipóxia, com ou sem injeção de lipopolissacarídeo endotoxina (LPS). Imunohistoquímica da proteína básica da mielina (MBP) ou O1 e exame de microscopia eletrônica mostram perda de mielina proeminente na matéria branca cerebral com dano adicional para o hipocampo eo tálamo. Estabelecimento de modelos do rato do PVL vai facilitar muito o estudo da patogênese da doença usando linhagens de camundongos transgênicos disponíveis, realização de testes de drogas de uma forma relativamente alto rendimento para identificar agentes terapêuticos candidato, e testes do transplante de células-tronco usando linhagens de camundongos imunodeficiência.

Nós estabelecemos modelos do rato de leucomalácia periventricular (LPV), a lesão cerebral predominante em prematuros caracterizada por lesões na substância branca periventricular. Hipóxia / isquemia com / sem infecção sistêmica são as principais causas de LPV. Ligadura da carótida unilateral e exposição a hipóxia com / sem injeção de lipopolissacarídeo cria PVL-como lesões em camundongos P6.

Modelos de mouse de leucomalácia periventricular

Descrevemos um protocolo para o estabelecimento de modelos murinos de leucomalácia periventricular (LPV). A LPV é a forma predominante de lesão cerebral em prematuros...

Para iniciar este procedimento, seis camundongos são anestesiados por meio de resfriamento indireto em gelo até o ponto de ausência de resposta a estímulos nocivos. Sob um microscópio estereoscópico, acessa-se a artéria carótida comum direita. Um gancho cirúrgico é utilizado para isolar a artéria carótida comum do nervo vago e dos gânglios simpáticos adjacentes.A artéria carótida comum é então cauterizada. Olá, sou Hin da esquerda de Bin do Departamento de Biologia Celular e Anatomia Humana da Universidade da Califórnia, Davis. Olá, sou Jennifer Plain.Também sou do Laboratório de um Ang. Hoje mostraremos a você o procedimento para criar um modelo murino de PVL por Perticular lulac. A forma predominante de lesão cerebral em recém-nascidos prematuros é caracterizada por paraventricular.Nós meta lesões. Utilizamos P seis camundongos para criar uma lesão semelhante à LPV por meio da ligadura unilateral da carótida e hipóxia com injeção concomitante de LPS. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a patologia da LPV.O estabelecimento de modelos murinos de LPV facilitará grandemente o estudo da patogênese da doença utilizando linhagens de camundongos transgênicos disponíveis. Esses modelos facilitarão a realização de ensaios com fármacos de maneira relativamente de alto rendimento, a fim de descobrir agentes terapêuticos candidatos, além de testar o transplante de células-tronco e linhagens de camundongos com imunodeficiência. Então, vamos começar.Antes da cirurgia para induzir lesão cerebral neonatal, realize uma compressão no pé para confirmar que o animal está completamente anestesiado. Limpe a pele ao redor do pescoço do camundongo P seis anestesiado com álcool. Em seguida, faça uma incisão ventral mediana no pescoço anterior.Sob um microscópio estereoscópico, retrair suavemente os músculos omo-hioide e esternocleidomastoideo para acessar a artéria carótida comum direita. Remover a fáscia ao redor da bainha carotídea. Em seguida, usar um gancho para isolar a artéria carótida comum do nervo vago e dos gânglios simpáticos próximos.Agora cauterize a artéria carótida comum após o cauterização. Feche a incisão na pele com cola tecidual. Use uma manta térmica para manter o animal aquecido até que esteja completamente acordado e, em seguida, devolva-o à mãe.Uma hora após a ligadura da carótida, coloque o camundongo em uma câmara selada infundida com nitrogênio até que um nível de 6% de oxigênio seja atingido. Exponha o animal a 35 minutos de hipóxia; após a exposição à hipóxia, permita que o camundongo se recupere em uma placa aquecida por 30 minutos e, em seguida, devolva-o à mãe para a indução de lesão cerebral com hipóxia, isquemia e infecção combinadas. A inflamação é induzida pela injeção inicial de 0,015 mililitros de lipopolissacarídeo, após a qual o animal é devolvido à mãe.Aqui estão alguns resultados representativos de modelos murinos de leucomalácia periventricular ou PVL. Primeiro, um exame neuropatológico de secções coronais coradas com hematoxilina e eosina em todo o prosencéfalo revela necrose focal na substância branca central do hemisfério cerebral ipsilateral à ligadura da carótida, na substância branca necrótica focal. Há um aumento acentuado da celularidade, composto por macrófagos e astrócitos reativos, característica típica da PVL humana focal na substância branca central contralateral.Os núcleos oligodendrogliais estão dispostos em feixes semelhantes a fascículos. Essa arquitetura é completamente interrompida pela necrose focal no lado ipsilateral. Em cérebros com lesão da substância branca cerebral ipsilateral, também são observadas necrose ipsilateral no hipocampo e microinfartos focais no tálamo.A seguir, a detecção imunocitoquímica da proteína básica da mielina MVP ou do antígeno O um é utilizada para avaliar a lesão. É mostrada aqui uma escala padrão para pontuação da lesão da substância branca utilizando uma escala de zero a cinco. A patologia da substância branca também é caracterizada pela coloração MVP ou O um e pela estrutura da mielina por microscopia eletrônica. As colorações MVP e O um mostram perda de mielina na substância branca cerebral do lado ipsilateral à ligadura em comparação com a substância branca contralateral.O exame de ME mostra axônios mielinizados na substância branca cerebral contralateral à ligadura e tecido degenerado na substância branca ipsilateral. Por fim, para testar os efeitos correlativos da lesão da substância branca sobre os desfechos funcionais, foram realizados testes comportamentais de função motora conforme mostrado neste gráfico. A pontuação comportamental baseada em um teste de escalada revela que camundongos expostos à hipóxia-isquemia sem LPS apresentam escores significativamente menores em comparação com camundongos controles normais P14.Além disso, camundongos expostos à hipóxia-isquemia com LPS apresentam escores significativamente mais baixos em comparação com camundongos Hi P14. Acabamos de mostrar como criar um modelo de camundongo de LVP por meio de hipóxia-isquemia com ou sem injeção intraperitoneal de A RPS.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de isolar a artéria carótida comum de outros tecidos antes da cauterização. Caso contrário, a lesão poderá ser excessivamente grave ou não ocorrer. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O modelo de oclusão intraluminal cerebral média em ratinhos é aqui apresentada. A extensão do enfarte cerebral é avaliada por uma pontuação neurológica e coloração com violeta de cresilo, a coloração de uma alternativa ao TTC, que oferece a grande vantagem de testar em paralelo marcadores de interesse muitos.

Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl

O vídeo demonstra o procedimento para criar um modelo de camundongo para estudar a lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal. Ele descreve as etapas para induzir cirurgicamente a isquemia e submeter o animal à hipóxia para exacerbar o dano cerebral. Por fim, mostra como avaliar as lesões cerebrais resultantes, garantindo que o modelo de camundongo esteja preparado para uma investigação científica mais aprofundada.

Estabelecendo um modelo de camundongo de lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal

Usando exames de ressonância magnética (humana), software de imagem 3D e análise imuno-histológica, documentamos alterações nos ventrículos laterais do cérebro. O mapeamento longitudinal 3D das alterações do volume do ventrículo lateral e a caracterização das alterações celulares periventriculares que ocorrem no cérebro humano devido ao envelhecimento ou doença são então modelados em camundongos.

Modelagem 3D do lateral ventrículos e histológica Caracterização do Tecido Periventricular em humanos e mouse

Apresentada é uma bateria concisa de testes motores neonatais em camundongos. Usando esses testes, os déficits motores neonatais podem ser demonstrados em uma variedade de distúrbios motores neonatais. Por ter um conjunto padronizado de testes, os resultados de diferentes estudos podem ser comparados, permitindo relatórios melhores e precisos entre os grupos.

Uma bateria de testes de motor em um Neonatal Rato Modelo de Paralisia Cerebral

Descrevemos um modelo de camundongo de malária cerebral experimental e mostramos como a patologia inflamatória e microvascular pode ser rastreada in vivo usando ressonância magnética.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

Este protocolo demonstra a indução da doença malformação cavernosa cerebral em um modelo do rato e usa contraste aprimorado micro computadorizada para medir carga de lesão. Esse método aumenta o valor dos modelos de rato estabelecida para estudar a base molecular e terapias potenciais para malformação cavernosa cerebral e outras doenças cerebrovasculares.

Indução e Micro-CT Imaging de malformações cavernosas cerebrais no modelo de Mouse

Descrito aqui é o modelo de derrame fototrombótico, onde um derrame é produzido através do crânio intacto induzindo a oclusão microvascular permanente usando iluminação laser após a administração de um corante fotossensível.

Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose

Apresentamos um modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando filhotes de ratos que mimetiza a patologia observada em humanos.

Modelagem da Hemorragia Intraventricular Neonatal Através da Injeção Intraventricular de Hemoglobina

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Este protocolo apresenta um modelo de camundongo modificado de lesão cerebral traumática leve repetitiva (rmTBI) induzida por um método de traumatismo cranioencefálico fechado (CHI). A abordagem apresenta uma janela de crânio afinado e percussão de fluido para reduzir a inflamação comumente causada pela exposição às meninges, juntamente com melhor reprodutibilidade e precisão na modelagem de rmTBI em roedores.

Modelo de camundongo modificado de lesão cerebral traumática leve repetitiva incorporando janela de crânio afinado e percussão fluida

Aprenda a criar modelos de leucomalácia periventricular em camundongos P6 usando ligadura carotídea unilateral, hipóxia e lipopolissacarídeo. Este método permite estudar lesões de matéria branca e testar terapias potenciais.

Modelos de mouse de leucomalácia periventricular

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