Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar precursores de oligodendrócitos a partir de células-tronco embrionárias por meio de uma série de etapas de cultura ao longo de 30 dias. Isso é conseguido primeiro gerando corpos embrionários a partir de células ES de camundongos para iniciar a diferenciação celular. Como segunda etapa, os corpos embrionários são tratados com as pequenas moléculas, ácido retinóico e morfina pura, que induzem a diferenciação direcionada das células em uma liga.

Precursores de cita. Como terceira etapa, os corpos embrionários são desagregados em células únicas após mais 22 dias. Em cultura, aproximadamente 80% das células são OPCs.

Em seguida, os OPCs derivados de MESC são transduzidos com vírus bao carregando a subunidade NAV 1.2 para gerar resultados de OPCs de pico que mostram a expressão do marcador OPC e as propriedades de pico desses OBCs derivados de MESC com base em microscopia de imunofluorescência e registros eletrofisiológicos. Olá, sou Pong Chiang, do laboratório do Dr.Ing no Departamento de Biologia Celular e Anatomia Humana da Universidade da Califórnia em Davis. Também somos afiliados ao Hospital Shriners para Crianças do Norte da Califórnia.

Olá, sou o frasco Raj, também do laboratório Deng. Hoje mostraremos um procedimento para diferenciação de células-tronco de emron de camundongo em células precursoras de genocídio. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as propriedades de precursores de oligodendrócitos de células-tronco embrionárias, a fim de gerar células com melhor potencial terapêutico.

Então vamos começar. Hoje, células precursoras de oligodendrócitos ou OPCs serão geradas a partir da linhagem de células-tronco embrionárias de camundongo OG two GFP. Essas células-tronco embrionárias precisam ser passadas a cada três dias para mantê-las saudáveis em uma densidade ideal e evitar a diferenciação espontânea. Passagem.

As células ESS quando estão a 70% de confluência sob uma capela de fluxo laminar. Remova o meio sobre a cultura. Enxágüe com PBS e tripsina nos olhos com dois mililitros de pré-aquecimento.

Uma x viagem LE expressa por cinco minutos a 37 graus Celsius. Pare a reação e ressuspenda as células em quatro mililitros de meio celular MES. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e pelete-as a 1000 RP por cinco minutos.

Ressuspenda em placa média MESL, um décimo das células sobre uma camada confluente de alimentadores de metanfetamina irradiados em meio celular MES. Após três dias, as células ES são aproximadamente 70% confluentes e estão prontas para serem passadas ou suspensas para formar corpos embrionários para induzir corpos embrionários e iniciar a diferenciação Tripsina colônias de células ES de camundongo como antes e, em seguida, ressuspender as células em substituição de soro knockout ou meio KSR. Conte as células em um hemo TER, dilua a suspensão em KSR.

Médio para 15.000 células por placa de mililitro três mililitros em cada poço de uma cultura de placa de seis poços de fixação ultrabaixa. As células suspensas a 37 graus Celsius por quatro dias. Troque o meio completamente a cada dois dias.

A partir do quarto dia, substitua o meio diariamente no quarto dia Suplemente o KSR com ácido retinóico 0,2 micromolar no quinto dia suplemente com ácido retinóico e um primor micromolar fome no sexto e sétimo dias. Alimente os corpos embrionários em dois meios, suplementados com ácido retinóico 0,2 micromolar e uma fome de primor micromolar. Após oito dias em cultura, a maioria dos corpos embrionários expressa GFP e está pronta para ser desagregada com tripsina nos olhos e contar as células como antes.

Em seguida, suspenda-os em 3,5 vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro. Em meio OPC, reflate três mililitros da suspensão em meio OPC. Usando placas de 60 milímetros revestidas com poliornitina aproximadamente todas as semanas, as células se tornarão confluentes e se parecerão com esta passagem para as células como antes com uma tripsinização de três minutos.

30 dias após a suspensão original do resus. No meio KSR, as células mostram características de células precursoras de oligodendrócitos para gerar OPCs de pico. Use OPCs derivados de ESL de camundongo que estejam entre 50 e 70% confluentes.

Troque o meio por um XPBS para enxaguar as células. Para introduzir sódio com retenção de tensão. Subunidade alfa do canal 1.2.

Usamos o kit de canal de sódio MAM traseiro. Misture um mililitro do componente MAM traseiro A com quatro mililitros de um XPBS. Remova o enxágue PBS e adicione o componente diluído.

A incubar a 37 graus Celsius por duas horas. Substitua o agente de memória traseira por um meio OPC aprimorado com os componentes B e C, conforme descrito no kit. Instruções incubar por mais duas horas a 37 graus Celsius.

Após a incubação, substitua o meio aprimorado por meio OPC fresco. Após mais 24 horas de cultura, os OPCs derivados de ESL podem ser testados para picos neste momento. O EBS não mostra nenhuma fluorescência GFP.

Os EBS mostram forte expressão de GFP e estão prontos para cultura de desagregação por cerca de 30 dias após a suspensão original do resus. No meio KSR, a maioria das células é imunopositiva para a coloração NG dois, o que é consistente com a expressão de GFP. No entanto, ao contrário dos OPCs cerebrais, esses OPCs derivados de células MES não disparam potenciais de ação mesmo quando as células foram despolarizadas para zero milivolts.

Após a introdução da subunidade NAV 1.2 por transdução viral, essas OPCs derivadas de células MES ficam excitadas e disparam potenciais de ação. Acabamos de mostrar como diferenciar células-tronco embrionárias de camundongos em OPCs e gerar OPCs de pico por transdução viral. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de armazenar o ácido retinóide por morfina e FGF dois corretamente e sempre usar alíquotas novas, descartar qualquer ácido retinóide extra após o uso.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.