Name: Quantificação em situ da Missa das células beta pancreáticas em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda a quantificar células beta pancreáticas em camundongos usando imagem virtual de fatia e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar a distribuição e massa das ilhotas para pesquisa em diabetes.

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O estudo é apoiado por EUA Public Health Service Grant DK-081527, 072473 e DK-DK-20595 para a Universidade de Chicago Diabetes Centro de Pesquisa e Treinamento (Core modelos animais), e um presente da Fundação Família Kovler.

Parte 1: Preparação de Amostras <ol><li> Colocar um mouse sob um microscópio de dissecação, remover o pâncreas inteiro junto com o duodeno eo baço ainda ligado, e colocar os órgãos numa lâmina de vidro pré-pesados. Remove o duodeno, cortando suas tecido conjuntivo ao longo do lado onde é ligado ao pâncreas. Cortar e remover o baço e excesso de gordura sobre o pâncreas até que o pâncreas é completamente isolado no slide. (Gordura pancreática é distinguível por sua cor branca, como diferenciada da cor ligeiramente mais escura e curtidor de tecido pancreático.) </li><li> Coloque uma lamela (tampa de vidro grande 50x75mm; padrão tampa de vidro 25x75mm) sobre o pâncreas para que ele seja totalmente coberto. Use um peso (por exemplo, um livro pesado) para achatar o pâncreas entre a lâmina ea sua capa. Dependendo do peso, achatando o pâncreas leva aproximadamente cinco minutos. </li><li> Tire o peso. Se o pâncreas está bem achatado contra o slide, coloque-o em paraformaldeído 4% (PFA) a 4 ° C durante a noite. De manhã, retire as lamelas e bem expor o pâncreas inteiro para PFA durante o dia (08/06 horas). Se o órgão não está bem fixo, deixe-o permanecer no PFA mais, possivelmente durante a noite. Transferir as lâminas para o recipiente com 1% Triton x-100 em tampão fosfato salino (PBS) durante a noite. No dia seguinte, transferir os slides para o recipiente de sacarose saturada por 1-2 dias. Em seguida, transferir os slides a um recipiente de glicerol 100% até que o tecido é eliminado, o que permite a resolução ideal de sinais fluorescentes; limpeza de tecidos leva dias cerca de 1-3. (Os sinais fluorescentes podem persistir por semanas e até meses, mas de imagem deve ser realizada logo após o tecido é liberado para melhor resolução). </li><li> Loja do pâncreas em uma área escura e fria, a fim de preservar o órgão e seus sinais fluorescentes. </li></ol> Parte 2: Imagem e quantificar a área das células beta no pâncreas intacta <ol><li> Utilizando uma pinça ou luvas, pegue a deslizar para fora do recipiente com 100% de glicerol. Preparar os slides para imagens por limpando glicerol em excesso e exclusivamente a limpeza da parte de trás da tampa de vidro com etanol. </li><li> Abra o software StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT) e selecione a lente objetiva 2x para ratos imagem pancreata mais de três semanas em lâminas de vidro grande, ou a lente objetiva de 10x para os ratos imagem pancreata menos de três semanas pressionado entre duas lamínulas 25 milímetros. Visualize a imagem, colocando-o a viver de imagem (Image → Imagem Live). Selecionar um tempo de exposição que mostra claramente a GFP-tagged células-beta. (Underexposing a imagem exclui ilhotas menores e beta-células, enquanto a superexposição da imagem cria falsos sinais adicionais.) </li><li> Clique em qualquer lugar na tela para estabelecer um ponto de referência e prossiga para desenhar um contorno ao redor do pâncreas inteiro. Iniciar o processo Slice Virtual (Imagem → Adquirir Slice Virtual). Determinar e selecionar o melhor plano focal ou seja, o avião com o maior número de ilhotas visível e concentrados e células-beta no eixo Z, deslocando o botão de foco. Uma vez escolhido, StereoInvestigator captura automaticamente a imagem exibida na tela. Com o estágio motorizado, o recurso Slice Virtual seqüencialmente capta cada painel óptico como uma imagem distinta dentro do contorno desenhada (Fig. 1A) e, em seguida, combina todos eles como uma imagem incorporada (Figura 1B). Slice imagem virtual usa uma configuração de epifluorescência ou seja, campo amplo filtros que permite que a câmera para capturar todos os sinais presentes em uma certa profundidade, incluindo aqueles que não perfeitamente em foco, de modo que o Slice finais Virtual é uma imagem bidimensional integrado que não é um máximo projeção a partir da reconstrução tridimensional do pâncreas inteiro. Tempo de varredura média Virtual Slice é de 30 min por amostra, mas pode demorar até uma hora por um pâncreas grande. </li><li> Depois de salvar a imagem, começam a sua análise, abrindo a imagem com ImageJ. Quando a imagem termina de carregar e aparece na tela, abrir e executar a macro análise Virtual Slice ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1970/Supplementary_material%201.pdf">Material Suplementar 1</a> ). </li><li> Siga as instruções passo-a-passo fornecidas pela macro. Eliminar os artefatos indesejados criado por dispersão de luz com a "Magic Wand" e "Select Area" ferramentas. Verifique e subtrair de fundo desnecessária da imagem. Determine o raio da maior ilhota com a "Line" ferramenta para que o recurso de Bola Rolando que se seguiu pode efetivamente remover a luz autofluorescência e dispersos. Teste e selecionar a mais adequada "Threshold Low" para capturar os sinais fluorescentes de pequenas ilhas e grupos de células-beta (&lt;3x10 M 4 2). Teste e selecionar a mais adequada "Threshold High" para capturar os sinais fluorescentes de ilhotas. Executar a quantificação da Slice Virtual, que irá medire produzir uma lista de área de ilhotas, perímetro, circularidade e diâmetro de Feret. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1A.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1A"> Figura 1A Virtual de análise de imagem Fatia de toda a distribuição das células beta no pâncreas um adulto intacto Imagens de cada um dos painéis de óptica de um pâncreas do rato macho em 10 semanas tomadas no âmbito de um objectivo 2x. As imagens incluem toda a distribuição das ilhotas, mesmo pequenos grupos de células-beta (&lt;10 células). <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1B.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1b"> Figura 1B análise de imagem Virtual Fatia de toda a distribuição das células beta no pâncreas um adulto intacto Uma fatia unificada virtual com o pâncreas dorsal à direita e do pâncreas ventral à esquerda. Barra de escala é de 5 mm. Resultados representante Preparação proficiente de um pâncreas para imagens Slice Virtual permitirá uma quantificação efectiva de todos os GFP-tagged células beta do pâncreas em um todo como uma imagem Slice Virtual com ilhotas claras e distintas. Imagem Slice sucesso Virtual do pâncreas todo in situ fornece os meios para examinar e quantificar as células-beta, não só a área da ilhota individual e total, mas também distribuição de tamanho de ilhotas, a análise regional, e padrões de crescimento também. Enquanto ImageJ mantém a capacidade para detectar todas as células beta-simultaneamente na análise de imagens Slice Virtual, ele também pode controlar o que as células-beta para quantificar, restringindo a análise a determinados tamanhos de ilhotas (por área ou o diâmetro), ou por localização. A análise padrão exclui artefatos por exemplo, os restos menores do que uma única célula beta-(&lt;170 M 2) e registros da área, perímetro (a distância em torno de uma área), a circularidade (um grau de circularidade, onde 1.0 representa um círculo perfeito), Feret e diâmetro (a maior distância dentro de uma área) para cada ilhota detectado. Análise Slice Virtual é capaz de aumentar a fatia de imagens virtuais através do emprego de segmentação Watershed, que distingue e separa ilhotas sobreposição em ilhotas individuais de acordo com suas formas. A análise ainda produz uma série de imagens detalhadas, o que inclui máscaras das imagens em ambos baixa e alta intensidade (Fig. 1C), um esboço de todas as ilhotas presumido, que, individualmente, sejam numerados e listados em uma tabela de informação correspondente (Fig. . 1D), ea imagem Slice originais Virtual (Figura 1B). Nota que o viés potencial técnico na escolha de valores de limiar pode distorcer a quantificação dos ilhéus, incluindo luz gratuita em torno de grandes estruturas, ou reduzindo o número total de ilhotas, os sinais fracos, especialmente a partir de pequenas partículas. <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1C.jpg" alt="Figura 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1c"> Figura 1C Virtual de análise de imagem Fatia de toda a distribuição das células beta no pâncreas um adulto intacto Uma máscara das partículas fluorescentes na fatia virtual. Códigos de cores: [1] azul: baixa intensidade de fluorescência; [2] verde: fluorescência intensidade intermediária, e [3] red: fluorescência de alta intensidade. <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1D.jpg" alt="Figura 1d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1D"> Figura de análise de imagens 1D Virtual Fatia de toda a distribuição das células beta no pâncreas um adulto intacto Quantificação de ilhotas individuais / grupos de células-beta. Note que cada ilhéu (incluindo pequenos aglomerados de células-beta) é numerado, com as suas informações detalhadas em um gráfico correspondente. Quatro parâmetros foram tomadas para cada estrutura: (1) área (2); perímetro; (3) circularidade: um grau de circularidade, onde o número 1.0 representa um círculo perfeito, e (4) de diâmetro Feret: a maior distância dentro de uma área. Note que # exibe a resolução 706 análises com uma área de apenas algumas células-beta. Segmentação Watershed detecta grupos de ilhotas adjacentes, como o mostrado, e de forma adequada os distingue como ilhotas distintos (ilhotas 1554, 1555 e 1556). <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1E.jpg" alt="Figura 1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1e"> Figura 1E Virtual de análise de imagem Fatia de toda a distribuição das células beta no pâncreas um adulto intacto 3-dimensional gráfico da análise fatia virtual, com eixos de área, perímetro e diâmetro de Feret. Cada ponto representa uma ilhota.

<ol><li>Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+formation+during+the+neonatal+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Islet formation during the neonatal development in mice.</a> PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).</li>
<li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li>
<li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li>
<li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A análise de imagens Slice Virtual de ilhotas e células beta no pâncreas aglomerados intacto fornece uma visão em grande escala de toda a distribuição das ilhotas. Desenvolvimentos e mudanças na distribuição total de ilhotas ao longo do tempo pode assim ser estudados e comparados. Um exemplo é demonstrado em nossa análise de formação de ilhotas pancreáticas (1). Uma análise abrangente da pancreata ratos neonatal em momentos diferentes (P1-P21) demonstrou que ilhotas são formadas por fissão. Enquanto a proliferação de cé...

<table><tbody><tr><td>Pinceta</td><td>Miltex Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>F.S.T.</td><td>14001-13</td><td>01n2</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>F.S.T.</td><td>14072-10</td><td>02s5</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro grande</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71862-01</td><td>75x51x1,2 mm</td></tr><tr><td>Cobertura de vidro grande</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260462</td><td>50x75 mm</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25x75x1,0 mm</td></tr><tr><td>Cobertura de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-458-5M</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>Cobertura de vidro</td><td>Erie Scientific</td><td></td><td>círculo de 25 mm</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murinos MIP-GFP</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação em situ da missa das células beta pancreáticas em camundongos

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Rastreamento alterações de populações de células específicas na saúde e na doença é um objetivo importante da pesquisa biomédica. O processo de proliferação de monitorização das células beta pancreáticas e crescimento das ilhotas é particularmente desafiador. Nós desenvolvemos um método para capturar a distribuição das células beta no pâncreas intacta de camundongos transgênicos com fluorescência marcadas beta-células com uma macro escrita para ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). Após dissecção pancreática e limpeza de tecidos, o pâncreas inteiro é capturado como uma fatia virtual, após o que a GFP-tagged células-beta são examinados. A análise inclui a quantificação do total das células beta das ilhotas número área, e distribuição de tamanho com referência aos parâmetros e locais específicos para cada ilhota e para pequenos grupos de células-beta. Toda a distribuição das ilhotas podem ser plotados em três dimensões, e as informações a partir da distribuição do tamanho e da forma de cada ilhota permite uma comparação quantitativa e qualitativa das mudanças na área das células beta em geral num ápice.

O protocolo a seguir descreve o processo de dissecção pancreática para imagens fatia virtual, e posterior quantificação de todos os GFP-tagged células beta no pâncreas inteiro.

Quantificação em situ da Missa das células beta pancreáticas em camundongos

Rastrear mudanças em populações celulares específicas na saúde e na doença é um objetivo importante da pesquisa biomédica. O processo de monitoramento pancreático...

Compreender a proliferação das células beta pancreáticas e o crescimento dos ilhotas é um aspecto importante da pesquisa sobre diabetes. Neste artigo em vídeo, é demonstrada a imagem e análise de um pâncreas inteiro de camundongo utilizando camundongos com células beta que expressam GFP; o pâncreas é removido de um camundongo eutanasiado e achatado sobre uma lâmina de vidro. O tecido pancreático é clareado mediante tratamento sequencial com paraformaldeído, Triton X, sacarose e glicerol, utilizando microscopia fluorescente.Uma imagem ou corte virtual do pâncreas é adquirida. Em seguida, a imagem é analisada para determinar o número, tamanho e distribuição das ilhotas dentro do pâncreas. Olá, sou German Kilimnik do laboratório do Dr. RA, do Departamento de Medicina da Universidade de Chicago.Sou Abraham Kim, também do Laboratório HAR. Hoje vamos mostrar um procedimento para a visualização e quantificação de todas as células beta no pâncreas de um camundongo. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a estrutura, o desenvolvimento e a formação das ilhotas pancreáticas em camundongos.Então vamos começar. Inicie este procedimento aplicando etanol 95% na pele do cam

in-situ-quantification-of-pancreatic-beta-cell-mass-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

O objetivo deste protocolo é aplicar ressonância magnética com contraste dinâmico (DCE-MRI) para xenoenxertos de tumores pancreáticos ortotópicos em camundongos. A DCE-MRI é um método não invasivo para analisar a microvasculatura em um tecido-alvo e útil para avaliar a resposta vascular em um tumor após uma nova terapia.

Contraste Dinâmico aprimorada Ressonância Magnética de um Modelo de câncer de pâncreas Orthotopic Rato

Aqui, apresentamos metodologia para gerar e administrar compostos de microesferas de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) carregadas de interesse para ilhotas de camundongos intactas em cultura com subsequente análise de imunofluorescência da proliferação de células β. Este método é adequado para determinar a eficácia de mitógenos candidatos a β células.

Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Usando biodegradável poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

Descrevemos um protocolo para a implantação guiada por ultrassom de linhas de células de adenocarcinoma ductal pancreática derivada de urina diretamente no local do tumor nativo. Esta aproximação conduziu aos tumores pancreatic detectáveis pela exploração do ultra-som dentro de 2-4 semanas da injeção, e reduziu significativamente a semeadura da pilha do tumor da proporção na parede peritoneal em comparação à implantação ortotópica cirúrgica.

Implantação ortotópica guiada por ultrassom do Adenocarcinoma Ductal Pancreático murine

Este protocolo descreve a geração cirúrgica de tumores pancreatic ortotópicos e a digestão rápida de tumores pancreatic recentemente isolados do murine. Após a digestão, populações de células imunes viáveis podem ser usadas para análise a jusante, incluindo a estimulação ex vivo das células T para detecção intracelular de citocina por citometria de fluxo.

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

Este estudo apresenta a aplicação de fatias de tecido pancreático vivo ao estudo da fisiologia da ilhota e interações ilhotas-células imunes.

Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo

Este protocolo descreve dois métodos para a análise quantitativa da mitofagia em células β pancreáticas: primeiro, uma combinação de corantes específicos para mitocôndrias permeáveis a células e, segundo, um repórter de mitofagia codificado geneticamente. Essas duas técnicas são complementares e podem ser empregadas com base em necessidades específicas, permitindo flexibilidade e precisão na abordagem quantitativa do controle de qualidade mitocondrial.

Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas

A administração intraperitoneal de medicamentos é uma abordagem não invasiva segura e eficaz para induzir lesão pancreática. Este estudo comparou cinco protocolos distintos de injeção intraperitoneal em camundongos para induzir graus variados de lesão pancreática e estabeleceu um modelo de lesão pancreática grave para investigar as alterações patológicas e estratégias de tratamento para pancreatite aguda grave (SAP).

Preparando um modelo de camundongos de pancreatite aguda grave por meio de uma combinação de injeção intraperitoneal de ceruleína e lipopolissacarídeo

Descrevemos um método para utilizar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) de camundongos por meio de citometria de fluxo para transferência de células adotivas. Este protocolo tem como objetivo verificar a citotoxicidade específica de TILs contra tumores em um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico, fornecendo informações sobre o desenvolvimento de terapias celulares adotivas para câncer de pâncreas.

Isolamento baseado em citometria de fluxo e avaliação terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor em um modelo de câncer de pâncreas em camundongo

Este estudo utiliza marcadores de morte celular e apoptose baseados em fluorescência multicoloração combinados com microscopia confocal para avaliar a apoptose induzida por citocinas e a morte específica de β células em ilhotas pancreáticas. Revela mudanças espaciais e temporais na morte celular e apoptose em resposta a estímulos extracelulares.

Tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Aprenda a quantificar células beta pancreáticas em camundongos usando imagem virtual de fatia e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar a distribuição e massa das ilhotas para pesquisa em diabetes.

Quantificação em situ da Missa das células beta pancreáticas em camundongos

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