Name: Estabelecer xenoenxertos tumor intracraniano Cérebro com posterior análise do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem Bioluminescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-13T17:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprenda a estabelecer xenoenxertos intracranianos de tumores cerebrais em camundongos atímicos usando células modificadas com luciferase. Este método permite monitorar o crescimento tumoral e a resposta à terapia por meio de imagem de bioluminescência em tempo real.

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1. Preparação de células tumorais. Células para xenotransplantes tumorais do cérebro humano pode ser obtida quer a partir de tumores propagada como crescimentos subcutânea em camundongos atímicos, ou de cultura de células. Utilização de ambas as fontes de células é discutido abaixo, juntamente com a demonstração de um método para implante de células. Para preparar células de tumores subcutâneos para transferência para o compartimento intracraniano, tumor extirpado flanco são colocados em placas de cultura, onde o tecido é inicialmente picada com um bisturi e, em seguida mecanicamente interrompidos por pipetagem repetitiva para criar uma suspensão total de células 1. A suspensão total da célula é então passado através de uma malha de nylon 70 mM filtro para produzir uma suspensão de células único adequado para injeção intracraniana. A suspensão celular é centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos a 4 ° C, eo sobrenadante aspirado antes de ressuspender o pellet celular em um volume adequado de soro livre de mídia para obter uma concentração de trabalho final (veja abaixo). Para preparar linhas celulares estabelecidas para a implantação intracraniana, as células são colhidas por monocamadas trypsinizing, ou através da recolha de culturas em suspensão neurosphere, seguida de centrifugação e ressuspensão das células conforme indicado acima 2. O número de células injetadas é variável dependente da localização neuroanatômica da injeção. Para injectáveis ​​supratentorial rotineiramente injetar 3-5 x 10 5 células em 3 mL de soro livre de media (DMEM), enquanto que para brainstem injeções 3, sómente 5 x 10 4 células são injetadas em 0,5 mL. Injetando volumes maiores do que o recomendado pode resultar em refluxo de células tumorais através do trato agulha, com exofíticas resultante (Figura 1), em vez de o crescimento do tumor intracraniano. Após a retirada de amostra para injeção intracraniana, a suspensão de células restantes devem ser colocados no gelo, com conteúdo misturado com freqüência para manter a concentração adequada ao completar estabelecimento tumor intracraniano entre os membros de uma série de injeção. 2. O implante de células tumorais Note, todos os procedimentos descritos abaixo foram analisados ​​e aprovados pelo Uso de Animais Institucional e Comitê de Cuidados na Universidade da Califórnia em San Francisco. <ol><li> A área cirúrgica deve ser preparado por pulverização todas as superfícies com um desinfectante, como solução de clorexidina 2%. Depois de usar o desinfetante, o seguinte material deve ser colocado na área cirúrgica: <ul><li> Almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do rato </li><li> Duas pequenas placas de Petri, um contendo peróxido de hidrogênio 3% e uma contendo clorexidina a 2% </li><li> Swabs estéreis gaze e algodão </li><li> Estéril bisturis descartáveis </li><li> Grampeador cirúrgico autoclavado </li></ul></li><li> Para anestesia um anestésico injetado deve ser usado, normalmente uma mistura de cetamina-xilazina. </li><li> Uma vez que um rato é anestesiado, o couro cabeludo é preparada limpando várias vezes com um pedaço de gaze estéril embebida em solução de clorexidina. Pomada deve ser aplicada para manter a umidade adequada durante o procedimento. Utilizando um escalpelo esterilizado, completa uma incisão sagital sobre o osso parieto-occipital, cerca de um centímetro de comprimento. A superfície exposta do crânio é então limpo com um cotonete embebido em uma solução de 3% de peróxido de hidrogênio. O bregma deve ser aparente neste ponto (ver vídeo). </li><li> As coordenadas para injeção de células tumorais irá variar de acordo com o site desejado para o estabelecimento tumor. A seguir representa o processo que usamos para o estabelecimento tumor intracerebral 2 em uma localização neuroanatômica em que pacientes com tumor cerebral muitas experiência em desenvolvimento de tumor. Outros locais de interesse em pesquisa tumor no cérebro incluem a ponte, para a modelagem anatômica do tronco cerebral tumores 3, e injeções subdural para a modelagem de localização de tumores das meninges 4. Antes da injeção das células tumorais, use uma agulha estéril 25 afiada para perfurar o crânio de 2 mm à direita do bregma e 1 mm anterior à sutura coronal, criando assim uma abertura para a injeção de células tumorais (ver vídeo). Este procedimento funciona bem para ambos os camundongos e ratos (22 agulha para ratos). </li><li> Antes da elaboração células dentro da seringa, misture o conteúdo da suspensão celular tocando com o dedo. Carregar a seringa com a quantidade desejada de suspensão celular, tomando cuidado para evitar a criação de bolhas de ar. A parte externa da seringa deve ser limpo com um algodão embebido em álcool para limpar o exterior livre de quaisquer células aderentes, o que ajudará a prevenir estabelecimento tumor extra e crescimento (Figura 1A). Para garantir que a profundidade de injeção adequado é atingido, usar um bisturi para cortar três milímetros fora da ponta de uma ponta pipetteman P20. Esta seção da ponta pode ser colocada sobre a seringa e vai agir para limitar a profundidade da injeção, e ainda irá garantir que a tip da agulha da seringa é 3mm da parte inferior do crânio. Coloque a seringa perpendicular ao crânio e no buraco criado anteriormente, e injecte lentamente a suspensão de células (uma suspensão 3μL deve ser injectado ao longo de um período de 1 minuto). Um ângulo inadequado de inserção seringa pode resultar em injeção intraventricular de células e disseminação da coluna posterior (Fig. 1B: Direita) Ao completar a injecção, deixe a agulha no lugar por mais um minuto, em seguida, lentamente retirar (ver vídeo): estes passos ajudará a reduzir refluxo de células tumorais. </li><li> Como uma alternativa para a abordagem sem ajuda ou free-mão para implante de células do tumor intracraniano 5, pode-se usar uma moldura estereotáxica pequeno animal (F painel de visão geral esquemática), que geralmente promove local de injeção mais consistente, mas à custa de quantidades substanciais de tempo processual. Em nossa experiência, dois equipe cirúrgica pode injetar cerca de 60 ratos / hora quando se utiliza a abordagem à mão livre, que a taxa máxima de injeção com um quadro de pequenos animais estereotáxica é de aproximadamente 15 ratos / hora. Expediente processual é uma consideração importante ao injetar grandes séries de ratos, e ajuda a reduzir o tempo em que as células tumorais, a ser injetado, são deixados no gelo. </li><li> Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio 3% e seco com um cotonete estéril seco. Aplicar cera de osso estéril para o buraco. Usando uma pinça, tirar o couro cabeludo em conjunto sobre o crânio e grampos para fechar. Para a cura ideal, o couro cabeludo deve ser grampeado com a derme de cada lado do couro cabeludo contra os outros (baixo contra baixo). O couro cabeludo grampeado deve ser limpo com solução de clorexidina, e buprenorfina, em seguida, administradas por injecção subcutânea no pós-operatório alívio da dor. </li><li> Monitorar todos os ratos pós-operatório até que se tornem ambulantes e manter atividade normal. Normalmente, o tempo de recuperação é de cerca de 30 minutos. </li></ol> 3. Monitoramento bioluminescência do crescimento tumoral <ol><li> Fundo. Imagem de bioluminescência (BLI) é baseado na oxidação da luciferina [d-(-) -2 - (60-hidroxi-20-benzothiazolyl)-thiazone-4-carboxílico] na presença de oxigênio e trifosfato de adenosina (ATP). Esta reação é catalisada pela enzima luciferase, que converte energia química em fótons com emissão resultante da luz. Células humanas podem ser modificados para expressar luciferase (veja abaixo), com apenas luciferase células que expressam capaz de emitir luz na presença do substrato luciferina. Há luminescência de fundo mínimo de animais tratados com hosts luciferina, de modo que há uma muito favorável relação sinal-ruído para detectar as emissões de luminescência da luciferase modificados células tumorais, permitindo o monitoramento altamente sensível do crescimento do tumor e resposta terapêutica in vivo. Além disso, luciferase e seu substrato, a luciferina, foram mostrados para ser não-tóxico para células de mamíferos, e temos observado nenhuma diferença funcional entre células que expressam em relação a luciferase correspondentes células não modificado. Luciferina atravessa facilmente as membranas celulares e da barreira hemato-encefálica após intraperitoneal (ip) ou injecção intravenosa (iv) em ratos, permitindo que imagens de cada compartimento que contém luciferase modificados células. O nível de emissão de fótons e do espectro da luz emitida luciferase modificados células é suficiente para penetrar nos tecidos de animais de pesquisa de pequeno porte, como camundongos e ratos, e pode ser detectado externamente com câmeras de baixa luminosidade de imagem. O caráter não-invasivo de imagem de bioluminescência permite a monitorização repetida de crescimento do tumor e resposta terapêutica em indivíduos animal individual. </li><li> Fontes de células devem ser implantadas de forma estável modificado para firefly expressão luciferase. Como fontes de células podem ser comprados ou produzidos em laboratórios individuais usando lentivírus que foram construídos para a expressão constitutiva da luciferase. Recomendamos fortemente o uso de células modificadas com lentivírus codificação luciferase, em vez de plasmídeo, para garantir a expressão celular estável de luciferase in vivo, que é necessário para imagens de luminescência quantitativa para fornecer indicação precisa de mudanças na carga tumoral para assuntos individuais dos animais que são repetidamente imaged durante o curso de um experimento. </li><li> Monitoramento BLI. Recomendamos a realização de imagem de bioluminescência quantitativos (qBLI) 1x-2x por semana, começando uma semana após a injeção das células tumorais. Nosso qBLI seja efectuada utilizando os IVIS Lumina imagem estação (Caliper Life Sciences), e nossos resultados indicam dados semelhantes são obtidos em usar o Lumina IVIS, o IVIS 150, ou o IVIS estação de imagens 200. Em preparação para a imagem latente, os ratos são, simultaneamente, anestesiados com cetamina / xilazina e luciferina administrados (D-Luciferina sal de potássio, 150 mg / kg, Caliper Life Sciences), através de injeção intraperitoneal, com camundongos imaged 12 minutos após a injeção. A farmacocinética da luciferina indicam que o tempo entre a administraçãoconcentração de luciferina e determinação da luminescência célula deve ser entre 10-15 minutos após a injeção de luciferina, a fim de obter de emissão de luminescência máxima e maior sensibilidade de detecção. O período de tempo selecionados dentro do intervalo de tempo de 10-15 minutos deve ser mantida o mais constante entre os animais que estão sendo fotografada. É extremamente importante para manter a consistência no período de tempo entre a injeção de luciferina ea obtenção de leituras de BLI. Regiões de interesse abrangendo a área intracraniana de sinal são definidos usando software Vivendo Imagem (Figura 2), e os photons/s/sr/cm2 total (fótons por segundo por esterradiano por centímetro quadrado) são registados (ver vídeo). </li><li> Análise de dados. Considerando o crescimento do tumor e resposta terapêutica são monitorados em animais individuais, recomendamos os grupos de tratamento de pelo menos 8 para aumentar a certeza estatística de conclusões sobre a resposta do tumor, ou a falta dela, à terapia. Com relação aos resultados apresentando qBLI, as leituras de luminescência são convertidos para valores normalizados dividindo-se luminescência cada rato s, obtidos durante e após a conclusão do esquema terapêutico, com a sua luminescência de pré-tratamento correspondente máxima de leitura 6,7. Para análise de sobrevivência, o estimador Kaplan-Meier 8 é usado, ea partir do qual as curvas de sobrevivência são gerados, e os valores médio de sobrevida determinada. Diferenças entre as curvas de sobrevida são comparadas através de um teste de log-rank 9. </li><li> Recuperação do cérebro para a análise posterior de tumor tratados e não tratados. Após a eutanásia animal, o cérebro do rato deve ser rapidamente retirado (ver vídeo), e ou colocado em formol para posterior análise da morfologia do tumor e imuno-histoquímica, ou deveria ser montado em outubro para o congelamento da amostra. </li></ol> 4. Resultados representante No exemplo mostrado na Figura 3A, camundongos que receberam injeção de células de tumor intracraniano foram monitorados por luminescência intracraniana até sucessivos valores de luminescência significa indicou crescimento tumoral progressivo, e em que a terapia foi iniciada tempo (início seta cinza no dia 34: erlotinib administrada diariamente a 150 mg / kg, até a eutanásia necessário). Valores de luminescência para cada rato estão definidas para um valor normalizado de 1 no tempo do início da terapêutica, com leituras de luminescência subseqüentes para cada rato normalizado para o valor final de pré-tratamento de imagem. Como exemplo, um mouse com uma leitura de luminescência finais de pré-tratamento de 2,0 x 10 7 fótons / seg no dia 34, cuja luminescência aumentou para 6,0 x 10 7 fótons / seg no dia 38, teria um dia 38 de luminescência valor normalizado de 3,0. A média de bioluminescência normalizado e correspondente erro padrão para os grupos controle e tratamento são plotados para cada tempo de imagem. Neste exemplo, uma diferença significativa na luminescência normalizado dizer é aparente no primeiro ponto imagem em tempo posterior ao início do tratamento (dia 38), com a diferença de luminescência média de grupo mostrando aumento em momentos subseqüentes. Na maioria dos casos, atividade anti-tumoral de terapia, como indicado por qBLI, é acompanhada por uma diferença significativa na sobrevida correspondente (ie, p &lt;0,05), como é o caso aqui (Figura 3B). Painéis 3C e 3D mostram hematoxilina &amp; eosina adjacentes e anti-EGFR cortes corados de cérebro de camundongo obtido no momento da eutanásia, após a colocação do cérebro ressecado em formalina e posterior inclusão em parafina para corte. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Indicações de erros de injeção intracraniana. A) o crescimento do tumor exofítico (extracraniana) (círculo vermelho) pode ser causada por uma injeção muito grande volume, suspensão de células residuais anexado à seringa, ou de retirar a seringa muito rapidamente após a injeção das células tumorais. B) A injeção de células tumorais para os ventrículos pode causar disseminação do tumor espinhal (mouse para a direita), em contraste com adequadamente injetado células tumorais, o sinal para que permaneça no local da injeção (mouse para a esquerda). <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representações de calor mapa de imagem de bioluminescência intensidade para ratos representante de controle (esquerda) e tratamento (direita) grupos de um experimento de resposta terapêutica. A imagem viva software pode ser configurado para definir regiões de interesse (círculos vermelhos), ou operadores de instrumento pode definir as regiões de interesse manualmente. Para a utilização de imagens como estas para a construção de figura, recomendamos que o operador de instrumento mostra imagens de mapa de calor usando a mesma faixa de bioluminescência mapa de calor (parte superior da figura), para fornecer uma representação visual do grau de diferença entre a bioluminescência assuntos animal. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Bioluminescência, sobrevivência e análise de tecido tumoral a partir de um experimento no qual a resposta terapêutica é evidente. A Plot) de leituras bioluminescência significa para o controle de ratos e grupo de tratamento, com erro padrão indicado para cada ponto de imagem. B) Gráfico de Sobrevivência para os ratos mesmo, p-valor determinado através da utilização de log-rank 7. C) seção H &amp; E manchada de cérebro de camundongos com tumor. D) seção EGFR manchado. E e F) ampliações de áreas indicadas a partir de painéis C e D, respectivamente, com painel E mostrando coloração negativa para a proteína PTEN supressor de tumor.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Ortotópico (intracraniana) cérebro estabelecimento xenoenxerto tumor fornece um microambiente apropriado 10 para o câncer do SNC de modelagem para ser testado para resposta terapêutica. Este tipo de modelagem, adicionalmente, fornece informações sobre o acesso terapêutica para o cérebro e tumor cerebral, que é criticamente importante para determinar se um agente experimental deve ser avançado para a avaliação de ensaios clínicos em pacientes. Porque a quantidade de tumor intracraniano xenoenxerto não podem ser diretamente medidos, como por pinças, acompanhamento longitudinal do crescimento do tumor intracraniano e resposta à terapia requer não-invasiva por imagem, com a nossa imagem de bioluminescência experiência indica como a abordagem mais prática para os experimentos, cujo principal objectivo está avaliando extensão da resposta do tumor à terapia. Quando os resultados de imagem de bioluminescência são combinados com análise de sobrevida de animais assunto, os dois conjuntos de dados oferecem uma abordagem poderosa e confiável para avaliar a eficácia terapêutica experimental. Finalmente, é extremamente importante que xenoenxertos tumor intracraniano cérebro são colhidos de indivíduos animais sacrificados, a fim de avaliar os efeitos morfológicos e moleculares da terapia, e para isso nós preferimos ressecção cérebro inteiro no momento da eutanásia, com a preservação do cérebro ressecado para análise posterior. Considerando que a apresentação anterior foi feita específicas para a investigação tumor no cérebro, os conceitos são certamente generalizáveis ​​a outros cânceres humanos que são passíveis de modelagem ortotópico em roedores.

<table><tbody><tr><td>Escalpelos descartáveis</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>No.21</td></tr><tr><td>Manta aquecida</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>Clorhexidina 2%</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio 3%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 25g</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Microsiringa fina de 10 µl da Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>20734</td><td></td></tr><tr><td>Grampeador cirúrgico e grampos</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Software Living Image</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1G</td><td>Sal de potássio</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecer xenoenxertos tumor intracraniano cérebro com posterior análise do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem bioluminescência

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Modelos de transplante usando células tumorais do cérebro humano têm servido uma função essencial em neuro-oncologia pesquisas por muitos anos. No passado, o procedimento mais comumente utilizado para o estabelecimento xenoenxerto humana tumor consistiu na coleta de células de frascos de cultura, seguida pela injeção subcutânea das células coletadas em camundongos imunocomprometidos. Considerando que esta abordagem ainda vê o uso freqüente em muitos laboratórios, tem havido uma mudança significativa de ênfase na última década para a criação xenoenxerto ortotópico, que, no caso de tumores cerebrais, requer a injeção de células tumorais em estruturas apropriadas neuroanatômicas. Porque estabelecimento xenoenxerto intracraniana elimina a capacidade de monitorar o crescimento do tumor através de medição direta, como por uso de pinças, a mudança de ênfase para ortotópico cérebro modelos xenoenxerto tumor exigiu a utilização de não-invasivos de imagem para avaliar a carga tumoral em animais hospedeiros. Dos métodos de imagem disponíveis atualmente, o monitoramento bioluminescência é geralmente considerada a oferecer a melhor combinação de sensibilidade, conveniência e custo. Aqui, iremos demonstrar os procedimentos para o estabelecimento ortotópico de tumor cerebral, e para monitorar o crescimento do tumor ea resposta ao tratamento ao testar terapias experimentais.

Luciferase modificados xenotransplantes tumorais humanos cerebral intracraniana pode ser estabelecida em camundongos atímicos, com posterior acompanhamento do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem de bioluminescência. Em combinação com a análise de sobrevivência, o monitoramento bioluminescência é uma ferramenta de pesquisa essencial para ensaios pré-clínicos de terapias sendo considerado para o tratamento de tumores cerebrais.

Estabelecer xenoenxertos tumor intracraniano Cérebro com posterior análise do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem Bioluminescência

Modelos de transplante utilizando células de tumores cerebrais humanos têm desempenhado uma função essencial na pesquisa em neuro-oncologia durante muitos anos. No passado, os mais...

Por muitos anos, os modelos de transplante utilizando células de tumores cerebrais humanos envolveram principalmente injeção subcutânea em camundongos imunocomprometidos. Recentemente, tem havido uma mudança em direção à injeção na estrutura anatômica apropriada: o cérebro.Neste artigo em vídeo, tumores intracranianos são induzidos em camundongos utilizando um método de injeção no qual é feito um orifício no crânio e uma agulha é usada para injetar células tumorais modificadas para imagem por bioluminescência. Após a cirurgia, a taxa de crescimento tumoral e a resposta ao tratamento são monitoradas. Com o uso de uma estação de imagem por bioluminescência, análise de sobrevida e análises histopatológica e de expressão proteica, os dados obtidos podem então ser utilizados para avaliar a eficácia de terapias experimentais para tumores cerebrais.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neuro-oncologia, como se o agente anti-tumoral pode acessar o cérebro. As implicações dessa técnica se estendem ao tratamento de tumores cerebrais em pacientes, pois estamos tratando tumores cerebrais humanos cultivados em um hospedeiro animal. Trabalhando sob uma capela de cultura de tecidos, prepare as células tumorais subcutâneas para transferência para o compartimento intracraniano.Primeiro, coloque os tumores excisados das laterais em placas de cultura de tecidos. Usando um bisturi, pique o tecido. Em seguida, com uma pipeta, desintegre mecanicamente o tecido para criar uma suspensão de agregados celulares.Em seguida, passe a suspensão de agregados celulares por uma peneira com filtro de malha de náilon de 70 micrômetros e colete-a em um tubo de fundo redondo. Repita este processo por um total de três vezes para produzir uma suspensão de células isoladas adequada para injeção intracraniana. Centrifugue a suspensão a 1000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius; após a centrifugação, aspire o sobrenadante e, então, ressuspenda os pellets celulares em um volume apropriado de meio livre de soro para obter uma concentração final de trabalho, como alternativa à desagregação de tumores subcutâneos.As células tumorais podem ser coletadas de culturas celulares contendo linhagens estabelecidas de tumor cerebral. Colete as células por tripsina em centrifugação.Após a centrifugação Resus, suspenda as células no volume apropriado de DMEM sem soro para injeções supratentoriais manualmente. Prepare três a cinco vezes 10 à quinta potência de células em três microlitros. Desinfete a área cirúrgica borrifando todas as superfícies com clorexidina 2%.Em seguida, coloque os seguintes materiais na área cirúrgica: um aquecedor para manter a temperatura corporal do camundongo, dois pequenos recipientes, um contendo peróxido de hidrogênio a 3% e outro contendo clorexidina a 2%, GREs estéreis e cotonetes, escalpelos descartáveis estéreis e um grampeador cirúrgico autoclavado.Uma vez que o camundongo tenha sido anestesiado com uma mistura de cetamina e xilazina, troque a área cirúrgica várias vezes utilizando compressas estéreis embebidas em clorexidina. Aplique mentol para manter umidade adequada durante o procedimento. Usando um bisturi estéril, realize uma incisão sagital sobre o osso paroocipital, com aproximadamente um centímetro de comprimento.Usando um cotonete embebido em solução de peróxido de hidrogênio a 3%, limpe a superfície exposta do crânio. Neste momento, o bgma deve estar aparente para criar uma abertura para a injeção de células tumorais. Utilize uma agulha estéril fina de 25 graus para perfurar o crânio.Dois milímetros à direita do bgma e um milímetro anterior à sutura coronal. Misture o conteúdo da suspensão celular batendo levemente. Carregue a seringa com a quantidade desejada de suspensão celular.Evite criar bolhas de ar. Limpe a parte externa da seringa com um cotonete de álcool para remover quaisquer células aderidas. Isso ajudará a prevenir o estabelecimento e crescimento de tumores extracranianos, conforme mostrado aqui, garantindo que a profundidade apropriada de injeção seja alcançada.Quando não estiver usando um aparelho estereotáxico para pequenos animais, utilize um bisturi para cortar três milímetros da extremidade pontiaguda de uma ponteira de pipeta P20. Coloque o segmento da ponteira sobre a seringa para limitar a profundidade da injeção, garantindo que a ponta da agulha da seringa fique a três milímetros da face inferior do crânio. Assim, o próximo passo do procedimento é, provavelmente, o aspecto mais difícil de todo o método ao realizar a injeção a seguir; alcançar a morte apropriada e a entrega correta é de extrema importância para garantir que o tumor seja estabelecido e cresça na localização correta do cérebro.A seguir, posicione uma seringa perpendicular ao crânio no orifício e injete lentamente a suspensão celular. Injetar volumes maiores do que o recomendado pode resultar em refluxo de células tumorais pelo trajeto da agulha, levando ao crescimento tumoral subcutâneo em vez de intracraniano. Como mostrado aqui, um ângulo inadequado de inserção da seringa pode resultar em injeção intraventricular das células e subsequente disseminação espinal, conforme demonstrado aqui ao finalizar a injeção.Deixe a agulha no lugar por mais um minuto, depois retire-a lentamente. Esses passos ajudarão a prevenir o refluxo tumoral. Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio a 3% e seque.Usando um cotonete estéril. Aplique cera óssea estéril no orifício usando pinça. Junte o couro cabeludo sobre o crânio com a derme de cada lado, pressionadas juntas, lado interno contra lado interno, e fixe com grampos.Em seguida, limpe o couro cabeludo usando clorexidina. Administre buprenorfina por injeção subcutânea para alívio da dor pós-operatória. Embora não mostrado aqui, a buprenorfina é rapidamente absorvida.Prossiga para injetar camundongos adicionais. Certifique-se de misturar as células entre as injeções para manter a concentração adequada entre os membros de uma série de injeções. Recomenda-se grupos de tratamento com pelo menos oito animais para ajudar a garantir resultados estatisticamente significativos.Monitore todos os camundongos no pós-operatório até que se tornem ambulantes e recuperem a atividade normal. Normalmente, o tempo de recuperação é de cerca de 30 minutos, iniciando uma semana após a injeção das células tumorais. A imagem de bioluminescência quantitativa ou QBLI deve ser realizada uma ou duas vezes por semana. Aqui.A QBLI é realizada utilizando a estação de imagem IVIS Lumina e o software Living Image versão 3.2. No menu iniciar do Windows, selecione o programa do software Living Image. Após a abertura do programa, clique no botão do sistema IVIS inicializado no painel de controle da câmera.Após a inicialização, a caixa de status de temperatura deve ficar verde, indicando que a câmera CCD está adequadamente resfriada. Coloque o camundongo anestesiado e injetado com luciferina na plataforma da câmara de imagem. Abra um dos arquivos salvos da sua sessão de imagem e altere a exibição dos dados de imagem de contagens para fótons. Para determinar os fótons por segundo do sinal alvo, selecione o ícone de círculo no menu suspenso de ROI.Uma região de interesse marcada como ROI deve aparecer ao redor do sinal-alvo. O sinal deve ser inserido em um arquivo Excel no qual o número do animal e o dia da aquisição de imagens são indicados. Repita esta sequência para todos os animais analisados durante sua sessão de aquisição de imagens.Uma vez que as contagens de fótons tenham sido determinadas para cada camundongo que foi submetido à imagem e os valores de fótons tenham sido transferidos para um arquivo Excel, converta as leituras de luminiscência em valores normalizados dividindo a luminiscência de cada camundongo obtida durante e após a conclusão do regime terapêutico pelo valor correspondente de luminiscência máxima pré-tratamento. Para realizar a análise de sobrevida utilizando o software Prism, use o estimador KAPLAN-Meier para gerar gráficos de sobrevida e estimar os valores medianos de sobrevida.As diferenças entre as curvas de sobrevida são comparadas utilizando um teste de log-rank. A eutanásia do animal deve ser realizada se o animal apresentar declínio significativo na saúde, especialmente se houver perda de peso superior a 20% do peso máximo. Após a eutanásia, remova rapidamente o cérebro do camundongo e, em seguida, coloque o cérebro em formalina para análise subsequente da morfologia tumoral e imuno-histoquímica.Este exemplo mostra os valores médios de luminiscência normalizada para camundongos que receberam terapia por injeção intracraniana de células tumorais com início de erlotinibe no dia 34. As barras de erro indicam o erro padrão. Uma diferença significativa na luminiscência normalizada média é evidente no primeiro ponto temporal de imagem após o início da terapia. A diferença na luminiscência média entre os grupos mostra aumento adicional em pontos temporais subsequentes na maioria dos casos.A atividade antitumoral induzida pela terapia, conforme indicado por QBLI, é acompanhada por uma diferença significativa correspondente na sobrevida. Como é o caso aqui, cortes corados com hematoxilina e eosina de cérebro de camundongo embebido em parafina mostram o padrão de distribuição das células tumorais. P 10 é um marcador frequentemente associado à resposta tumoral à inibição do EGFR. Aqui.Observa-se que os otins de células tumorais tratadas estão desprovidos de expressão de P 10, conforme indicado pela ausência de coloração marrom. Aqui, é mostrada uma seção do cérebro de camundongo incluído em parafina. Células tumorais cerebrais sensíveis ao inibidor de EGFR podem ser identificadas pela coloração marrom de EGFR.Como você viu, o aspecto mais desafiador deste procedimento é a injeção adequada das células tumorais. Qual é o próximo experimento que pode ser realizado usando esta abordagem, como investigar os efeitos do crescimento decorrentes de modificações genéticas nas células tumorais? Assim sendo, é isso.Espero que você tenha achado esta apresentação útil. Boa sorte com seus experimentos.

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Estabelecer xenoenxertos tumor intracraniano Cérebro com posterior análise do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem Bioluminescência (Vídeo) | JoVE Journal

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