Padronizada fotoestimulação com dispositivos Digital Micromirror para Investigar Integração dendríticas em pontos Branch

O objetivo geral deste procedimento é controlar padrões complexos de luz no tempo e no espaço para que possa ser usado para estimular os neurônios. Isso é feito posicionando primeiro um chip DMD em um plano de imagem conjugado apropriado no caminho óptico do microscópio. A segunda etapa do procedimento é iluminar adequadamente o DMD com uma fonte de luz intensa, como um laser.

A terceira etapa do procedimento é eliminar o efeito de manchas da iluminação coerente. A etapa final do procedimento é integrar uma interface gráfica do usuário para manipular o chip DMD. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que experimentos que antes eram difíceis de realizar agora podem ser concluídos com relativa facilidade por meio da lise multi-local do neurotransmissor da gaiola empregando o sistema DMD.

Olá, sou Michael Mohammed e o laboratório do Dr. Chaman Tang no Departamento de Neurologia da Universidade de Maryland. Hoje mostraremos um procedimento para gerar padrões complexos de eliminação em um microscópio óptico. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a integração dendrítica.

Então vamos começar. Este protocolo demonstrará a operação de um dispositivo de micro espelho digital ou sistema de iluminação DMD para neurociência experimental. Um DMD é um chip semicondutor óptico com várias centenas de milhares de espelhos móveis microscópicos dispostos em uma matriz retangular Em sua superfície, a posição de cada espelho corresponde ao pixel de uma imagem.

Cada espelho pode ser controlado individualmente para inclinar entre duas orientações. Na orientação desligada, a luz é direcionada para longe do eixo óptico da iluminação da amostra. Na orientação on, a luz é direcionada ao longo do eixo óptico.

O DMD é adequado para lise porque tolera luz UV muito intensa, gera altas taxas de contraste entre os pixels ligados e desligados e pode alternar entre os dois estados em dezenas de microssegundos. A aplicação de DMDs para pesquisa biomédica é auxiliada pelo amplo uso de software e hardware de manipulação de imagens e pelo interesse comercial no campo de exibição de imagens. Os componentes modulares são comercializados pela Texas Instruments como kits de descoberta DLP que fornecem os drivers eletrônicos de suporte para adaptar o DMD a um sistema microscópico.

Conceitos básicos sobre a óptica da microscopia precisam ser compreendidos. O microscópio fluorescente moderno básico consiste em um caminho de imagem e um caminho de iluminação. É composto por uma objetiva, um cubo de filtro e duas lentes de tubo distintas para o caminho de imagem e iluminação.

O microscópio foi projetado para ter posições conjugadas ao plano de imagem da amostra, onde os objetos em foco no plano da amostra também aparecerão em foco nesses planos de imagem conjugados. Um corolário desse conceito é que qualquer imagem brilhante criada no plano da imagem conjugada também seria projetada nitidamente no plano da imagem do espécime. Essa estratégia é usada para projetar um padrão de iluminação gerado por computador na amostra.

O feixe de laser serve como uma fonte de luz muito brilhante que iluminará o padrão implementado pelos micro espelhos nos chips DMD posicionados em um plano de imagem conjugado. O projeto de um sistema de iluminação DMD depende das luzes de excitação usadas para experimentos optogenéticos, que utilizam luz no comprimento de onda visível. O padrão iluminado pode ser trazido através do caminho da câmera.

Portanto, o chip DMD pode simplesmente ser montado em uma das duas portas de câmera de um módulo de porta de câmera dupla. Por outro lado, para experimentos que usam luz na faixa UV, como lise de compostos enjaulados, a luz deve ser trazida através do caminho de iluminação epi e um plano de imagem conjugado mais acessível deve ser criado. Isso ocorre porque a lente do tubo de imagem não foi projetada para transmissão UV.

Em vez disso, a lente do tubo de iluminação é utilizada para transmissão UV e executa um trabalho adequado na formação da imagem. Cada micro espelho no DMD pode alternar entre uma inclinação positiva e negativa de 12 graus em relação ao plano do chip. Dependendo da entrada digital que recebe do computador, o eixo de rotação está ao longo dos cantos diagonais de cada espelho, 45 graus em relação aos lados retangulares do chip.

A orientação da inclinação do espelho é designada por um triângulo dourado em um canto da superfície frontal do chip. A inclinação do micro espelho determina o alinhamento da inclinação e do azimute do feixe de iluminação de entrada. Para iluminar o DMD, primeiro configure o passo do feixe de iluminação para 24 graus do eixo perpendicular do chip DMD e configure o azimute para ser perpendicular ao eixo de rotação do espelho.

O alinhamento preciso do feixe é fundamental para uma operação eficiente. Para experimentos de lise. Use uma fonte de laser para gerar o feixe focalizável de alta intensidade necessário para uma rápida desencaixotamento.

Aqui, um laser ND triplicado com frequência de estado sólido bombeado por diodo quase contínuo é empregado, use um laser de potência relativamente alta porque apenas uma pequena fração da saída do laser é realmente entregue à amostra. Ao usar um sistema DMD, inicie a saída do laser em uma fibra multimodo para que possa ser facilmente posicionada e orientada ao longo do eixo correto para iluminar o DMD para fornecer uma solução para a mancha. Problema gerado a partir de iluminação coerente transmitir a luz através da fibra óptica.

A fibra é enrolada em torno de uma maca de fibra elétrica pazo que é acionada para oscilá-la em torno de 40 kilohertz. O alongamento microscópico da fibra é suficiente para mover o padrão de manchas muitas vezes durante a duração de milissegundos de cada pulso de fotoestimulação, eliminando efetivamente as manchas. Finalmente, a saída da fibra óptica é agrupada com uma objetiva de microscópio UV para iluminar os DMDs para coregistrar o pixel CCD com o software de imagem DMD que correlaciona espelhos DMD individuais a pixels específicos da câmera CCD de imagem foi escrita.

A interface gráfica do usuário dentro do software permite que o usuário atribua a orientação do espelho DMD que corresponde à região na imagem CCD com o mouse do computador usando a interface gráfica do usuário. Marque o local para estimulação fotográfica movendo o cursor sobre a imagem exibida na tela do computador e clique na região de interesse marcada para programar o armazenamento de padrões de entrega de luz. O padrão marcado na tela do computador como uma série de imagens separadas programa o tempo dos pulsos de laser para cada padrão espacial no software.

Isso se integrará ao programa de aquisição de dados P clamp. Finalmente, use o programa de aquisição de dados para coordenar o tempo da eletrônica DMD, o gating do laser e a aquisição do sinal elétrico patch clamped do neurônio alvo. Aqui, uma calibração da resolução do sistema óptico é mostrada.

O tamanho mínimo do ponto é mostrado medido a partir de um alvo fluorescente. A resolução fisiológica efetiva é medida pela amplitude do fluxo de corrente em função da fotoestimulação. Posição do ponto aqui, o glutamato enjaulado foi fotografado adjacente a um ramo dendrítico de dois micrômetros de diâmetro.

Como o local foi movido. Ortogonalmente, através do dite, as respostas elétricas à fotoestimulação de diferentes intensidades são ilustradas. As respostas de tensão clampeadas em função da intensidade da lise são mostradas.

A estimulação dendrítica distribuída pode ser facilmente implementada usando um sistema baseado em DMD. Aqui, a intensidade de entrada foi variada aumentando o número de pontos de estimulação de fotos marcados como círculos nos dois ramos dendríticos. A soma espacial pode ser não linear entre pontos de ramificação.

Torna-se cada vez mais super linear com amplitudes de entrada crescentes chegando nas duas portas para as ramificações. Esses resultados ilustram claramente a maneira não linear de soma entre os pontos de ramificação dendrítica. A superlinearidade é amplamente mediada por receptores NMDA e não por canais dependentes de voltagem.

Isso pode ser demonstrado como a aplicação de dois antagonistas NMDA A PV e MK 8 0 1 eliminam amplamente o comportamento não linear. Acabamos de mostrar o projeto básico e a operação de um sistema baseado em DMD para fotoestimulação padrão do tecido neural. O sistema pode ser adaptado para estimulação com luz visível, como a usada para experimentos optogenéticos.

Também pode ser adaptável para luzes UV próximas, como usado para lise de fóton único. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que, se uma luz em comprimento de onda inferior a 400 nanômetros for usada e a maioria das pessoas passar pelo caminho de iluminação epi, esse alinhamento preciso do feixe de iluminação dentro de alguns graus é crítico e que, se uma luz coerente for usada, as manchas devem ser efetivamente eliminadas. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.