Análise do genoma de Aminoacylation (carregamento) Níveis de tRNA Usando Microarrays

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar as alterações relativas nos níveis de carregamento de TRNA. Isso é alcançado isolando o RNA em pH baixo antes e após o tratamento, a fim de obter TRNA com níveis de carregamento intactos. Como segundo passo, o RNA é submetido a um tratamento de oxidação com periodato, o qual permite a determinação dos níveis relativos de carregamento.

A seguir, ligue as amostras a um oligonucleotídeo fluorescente e hibridize em um microarranjo para medir as alterações nos níveis de ligação decorrentes do carregamento de A-T-R-N-A, obtendo-se os resultados. As alterações no nível genômico de CHO no carregamento de TRNA com base na tecnologia de microarranjo de TRNA. Olá, sou John Zai do laboratório de DRT Pan do departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade de Chicago.

Hoje vou mostrar um procedimento para isolar e medir o tRNA carregado ao nível genômico. Utilizamos isso para medir alterações no carregamento de tRNA durante estresses em nosso laboratório. Então, vamos começar.

Para isolar a carga total em tRNA, comece cultivando no mínimo o equivalente a 30 OD 600 de células de levedura, o que deve produzir 30 microgramas de RNA total. Pelaque as células em uma centrífuga de bancada. Re-suspenda as células em uma solução tampão de lise. Adicione um volume igual de acetato de sódio, fenol clorado saturado e clorofórmio, e vortexe por 30 segundos, seguido por repouso no gelo por pelo menos 30 segundos.

Repita a vórtex e o picotamento mais duas vezes. Centrifugue a amostra a 18.600 RFC por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova a camada aquosa e realize outra extração com fenol clorofórmico saturado com acetato após a segunda extração.

Precipite o RNA adicionando 2,7 volumes de etanol e centrifugue a 18.600 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Re-suspenda os pellets de RNA em solução tampão de lise e, em seguida, precipite com etanol uma segunda vez. Finalmente, re-suspenda o RNA em uma solução contendo acetato tamponado 10 milimolar e 1 milimolar de EDTA para tratamento subsequente.

A amostra pode ser armazenada de forma estável a menos 80 graus Celsius por cerca de duas semanas a mais. O armazenamento não é recomendado, pois alguns TNA carregados começarão a decair antes da marcação com as etiquetas oligonucleotídicas fluorescentes S3 ou SCI cinco. O TRNA total é submetido a um tratamento de oxidação com paraidiodobenzoato, que permite a determinação dos níveis relativos de carregamento, misturando-se o RNA total com 0,066 micromolar de cada padrão de eco irna e acetato tamponado 100 milimolar na presença de paraidiodobenzoato de sódio 50 milimolar; para a amostra de TRNA controle que não será oxidada, utiliza-se cloreto de sódio 50 milimolar no lugar do paraidiodobenzoato de sódio.

Incube as reações por 30 minutos à temperatura ambiente; após 30 minutos, interrompa a reação adicionando glicose até uma concentração final de 100 milimolares e incubando à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a interrupção da reação, realize uma troca de tampão utilizando uma coluna giratória G 25 para remover qualquer restante de prorato de sódio das amostras. Precipite as amostras adicionando acetato tamponado até uma concentração final de 133 milimolares de cloreto de sódio, até uma concentração final de 66 milimolares, e 2,7 volumes de etanol.

Em seguida, deci, isole as amostras de tRNA por Resus, suspendendo-as em cloreto de tris 50 milimolar HCL e incubando a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, neutralize a reação adicionando um volume igual de acetato tamponado 50 milimolar e cloreto de sódio 100 milimolar, precipitando com 2,7 x volumes de etanol. Re suspenda o pellet de RNA em água a cerca de um micrograma por microlitro.

Após verificar a qualidade do RNA das amostras controle e oxidadas por eletroforese em géis de agarose, podemos prosseguir com a marcação fluorescente para ligar as etiquetas oligonucleotídicas fluorescentes ao tRNA. Combine 0,1 micrograma por microlitro de RNA com oligonucleotídeos contendo SI três ou SI cinco a quatro micromolar, tampão da ligase 1, 15% de DMSO, 0,5 unidades por microlitro de ligase T4 de DNA e fosfatase de levedura; incube a 16 graus Celsius por mais de 16 horas. Após a ligação, misture as amostras com quatro volumes de acetato de potássio e cloreto de potássio e, em seguida, extraia com um volume igual de fenol-clorofórmio. Após a extração da fase aquosa, precipite as preparações de RNA com etanol. Por fim, ressuspenda os pellets de RNA em água até cerca de 0,1 micrograma por microlitro antes da hibridização. Incube as lâminas de microarranjo, óleo e água destilada por um a dois minutos para remover oligonucleotídeos não ligados.

Em seguida, combine as cinco amostras marcadas do S3 ou SCI com 140 microlitros de tampão de hibridização contendo DNA de esperma de salmão numa concentração final de 140 microgramas por mililitro e poli A numa concentração final de sete D microgramas por mililitro, e execute um programa de hibridização em um hibridizador automático de matrizes. Recomendamos fortemente o uso de uma máquina automática de hibridização para trabalhos com TRNA, já que a hibridização manual produz alto fundo. Ao finalizar o programa de hibridização, lave manualmente as lâminas com a solução de lavagem três, agitando suavemente em um tubo cônico de 50 mililitros por três a cinco minutos.

Lave as lâminas pelo menos duas vezes em tubos previamente envolvidos com papel alumínio. Seque as lâminas centrifugando em baixa velocidade por cinco a 10 minutos para obter resultados ideais. As lâminas devem ser escaneadas imediatamente após a secagem.

As lâminas podem ser escaneadas duas a três vezes sem degradação perceptível na qualidade da imagem. Resultados representativos de uma amostra de RNA total adequadamente isolada e sua análise são mostrados aqui. Esta amostra apresenta um espectro muito limpo, com uma razão OD260/OD280 próxima a dois, sem contaminação detectável por proteínas ou fenol quando analisada em géis de agarose a 1%. Tanto as amostras oxidadas quanto as controle devem apresentar uma banda forte de RNA, com outras possíveis bandas de ácidos nucleicos variando entre organismos.

Se uma amostra for visivelmente mais fraca do que outras amostras, ou se for observado deslocamento difuso, as amostras não devem ser usadas para microarranjos. Os microarranjos devem apresentar um fundo muito baixo, que é uma ordem de grandeza inferior à sonda de TRNA mais fraca. Acabei de mostrar como isolar e determinar os níveis relativos de carregamento de TRNA ao realizar este procedimento.

É importante lembrar-se de manter seus reagentes livres de nucleases, especialmente durante as etapas de oxidação e dilatação. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.