Name: Análise do genoma de Aminoacylation (carregamento) Níveis de tRNA Usando Microarrays (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a analisar níveis de carregamento de tRNA em Saccharomyces cerevisiae usando microarrays. Este método permite medir mudanças no carregamento de tRNA em resposta a estresses celulares.

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O trabalho de fermento no laboratório Pan foi financiado por uma doação da Ajinomoto, Inc. Japão e National Institutes of Health Training Grant T32GM007183-33. Agradecemos ao Dr. Ronald Wek na Escola de Medicina da Universidade de Indiana para a colaboração a longo prazo sobre os projetos de levedura. Agradecemos também a Dra. Kimberly Dittmar para o desenvolvimento do método de carregamento tRNA microarray.

Parte 1: Isolamento de tRNA cobrados total de <ol><li> Células sedimento em uma centrífuga de mesa em 2000 RFC por 5 minutos. O equivalente a 1 600 OD de células deve produzir pelo menos 1μg de RNA total e um mínimo de 30 mg é recomendado para o procedimento. </li><li> Ressuspender as células em solução tampão de lise constituído por 0,3 M tampão acetato de Na + (pH 4,5) e 10 mM EDTA. Vortex com igual volume de acetato de Na +-saturada de fenol / clorofórmio (pH 4,5) três vezes para cada 30 s. Certifique-se sempre manter as amostras em gelo entre vórtex. Acetato de tampão pode ser preparada a partir de NaOAC e HOAc enquanto saturada de acetato de fenol / clorofórmio pode ser preparado pela mistura de 1 parte 5 M tampão acetato (pH 4,5) com 9 partes de fenol / clorofórmio. Nota: o isolamento do RNA total é realizada sob condições levemente ácidas e no gelo para evitar deacylation de tRNA carregado. </li><li> Centrifugar a 18.600 RFC por 15 minutos a 4 ° C. Remover a camada aquosa e executar a nova extracção de acetato saturada de fenol / clorofórmio. </li><li> Após a segunda extração precipitar o RNA, adicionando volumes de etanol e 2,7 x centrifugação a 18.600 RFC por 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Pellets ressuspender RNA em solução tampão de lise e precipitado com etanol pela segunda vez. </li><li> Finalmente, ressuspender o RNA em uma solução contendo 10 mM de acetato tamponado (pH 4,5) e 1 mM EDTA para posterior tratamento. A amostra pode ser armazenada de maneira estável a -80 ° C por cerca de duas semanas. Prolongar o armazenamento não é recomendado como alguns tRNA carregado vai começar a deacylate. </li></ol> Parte 2: Elaboração de Normas de tRNA <ol><li> Calor E. padrões coli tRNA em 10,5 M a 85 ° C em 45 mM Tris-Cl pH 7,5 por 2 minutos. Pegue o tubo e deixe em temperatura ambiente por 3 minutos. </li><li> Adicionar MgCl 2 a uma concentração final de 20 mM e incubar a 37 ° C por 5 minutos. </li><li> Adicione a mistura de reacção sintetase para a reação final contém 5 mM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitol, 1,5 mM ATP, 1 mM espermina, 1 mM dos respectivos aminoácido, e 4,2 unidades / mL E. coli mix sintetase aminoacil-tRNA. Incubar a 37 ° C por 15 minutos. </li><li> Adicionar um volume igual de 0,5 M de acetato tampão (pH 4.5) e extrair com acetato saturada de fenol / CHCl 3 em pH 4.5. </li><li> Precipitar os padrões tRNA com volumes de etanol e 2,7 x centrifugação a 18.600 RFC por 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as normas em 50 mM tampão acetato (pH 4,5) com 1 mM EDTA e armazenar a -80 ° C por até um mês. </li></ol> Parte 3: Cy3/Cy5 rotulagem de tRNA <ol><li> Para a amostra tRNA cobrado incubar RNA total a uma concentração de 0,1 g / mL com 0,066 mM cada E. coli tRNA padrões (ie pmole 0,67 mg por cada padrão de RNA total) e 100 mM de acetato tamponado (pH 4,5) na presença de 50 mM NaIO4 por 30 minutos em temperatura ambiente. Para controlar o uso total da amostra tRNA 50 mM NaCl no lugar de NaIO4. Lembre-se de diluir o RNA apenas com soluções tamponadas para preservar a carregar. </li><li> Para matar a reação de glicose para adicionar 100 mM e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> , A fim de remover qualquer NaIO4 restante da amostra realizar uma troca de buffer usando uma coluna de spin G25. Para melhores resultados equilibrar a primeira coluna, executando 200 mM tampão acetato tamponado (pH 4,5) por ele antes de aplicar a sua amostra. </li><li> Precipitar a amostra pela adição de acetato tamponado (pH 4,5) para uma concentração final de 133 mM e NaCl para uma concentração final de 66 mM e 2,7 x volumes de etanol. Ocasionalmente, uma segunda precipitação podem ser necessários para as amostras oxidadas. Isso é necessário somente se o pellet parece significativamente diferente do pellet controle da mesma amostra. Por exemplo, um pellet significativamente maior ou mais difusa. Se uma precipitação etanol de segunda é necessária ressuspender pellet em 50 mM de acetato pH 4,5 e 200 mM NaCl antes da adição de etanol. </li><li> Para as amostras deacylation tRNA são suspensas em 50 mM Tris-HCl (pH 9) e incubados a 37 ° C por 30 min. A reação é neutralizado pela adição de igual volume de acetato 50 mM tampão (pH 4,5) e 100 mM NaCl. Precipitado com 2,7 x volumes de etanol. Após precipitação, o RNA é ressuspenso em água a ~ 1 mg / mL. Tanto o controle e as amostras oxidadas devem ser executados em gel de agarose para verificar a qualidade RNA. </li><li> Para anexar etiquetas fluorescentes oligo para o tRNA 0,1 mcg / mL de RNA deacylated é incubada em 1x tampão ligase, DMSO 15%, 4 mM Cy3 ou Cy5 contendo oligonucleotides, 0,5 unidades / mL DNA ligase T4, e leveduras exo-fosfatase (5.000 unidades / mL) a 16 ° C durante a noite (mais de 16 h). O exo-fosfatase é necessário apenas para as amostras obtidas a partir de leveduras e pode ser omitted se esse protocolo é utilizado para E. coli ou amostras humanas. </li><li> Após ligadura amostras são misturadas com 4 volumes de 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, e então extraído com um volume igual de clorofórmio fenol /. Após a extracção da fase aquosa, os preparativos estão RNA precipitado com etanol e ressuspenso em água a cerca de 0,1 mcg / mL. </li><li> Ligadura eficiência pode ser avaliada através da execução de 5-10% das amostras em gel de poliacrilamida 12% contendo uréia 7M e visualizado com um scanner gel fluorescente. Esta análise PAGE também é útil para determinar a quantidade de oxidado e amostras de controlo necessários para a hibridização microarray. Um resultado bom ligadura deve mostrar ~ 10% ou mais do oligonucleotídeo Cy3/Cy5 contendo sendo ligada ao tRNA. Para amostras com eficiência rotulagem bom, 0,1-0,5 mg RNA total por amostra é utilizada para a hibridização matriz. </li></ol> Parte 4: Hibridação e Análise do Microarray <ol><li> Antes de slides microarray de hibridização são fervidas em água destilada por 1-2 minutos para remover oligonucleotides desacoplado. </li><li> Cy3/Cy5 amostras rotuladas são combinados com 140 mL de tampão de hibridação e DNA de esperma de salmão para uma concentração final de 140 mg / ml e poli (A) para uma concentração final de 70 mcg / ml. </li><li> Um programa de hibridação, (tabela 1), é executado em uma variedade hybridizer automática. TRNA para o trabalho, é altamente recomendável que uma máquina automática de hibridização ser usado desde a hibridização produz manual de fundo de alta. </li><li> Depois que o programa está completo manualmente lavar as lâminas com solução de Lavar 3 pelo menos duas vezes agitando em um tubo de 50 ml por 3-5 minutos. </li><li> Slides pode ser secas por centrifugação a baixa velocidade, a menos de 200 RFC, por 5-10 minutos. É importante manter o desliza para fora da luz desde a exposição à luz alvejarão o fluoróforos. </li><li> Após as lâminas são secas que devem ser verificados imediatamente para melhores resultados, se necessário, eles podem ser salvos por vários dias em um lugar seco e escuro à temperatura ambiente. Slides podem ser digitalizados 2-3 vezes sem degradação perceptível na qualidade da imagem. </li></ol> Parte 5: Resultados Representante Quando isolados adequadamente a amostra de RNA total, deve produzir um espectro muito limpo, com uma 260 OD: OD relação de perto de 2 280. Não deve haver nenhuma proteína ou contaminação detectável fenol. Quando executado em gel agarose 1%, uma banda tRNA forte deve ser observado com outros possíveis bandas de ácido nucléico variando entre organismos. Após a oxidação de uma banda tRNA limpas devem ser observados. Se uma amostra é visivelmente mais fraco do que outras amostras ou manchas é observada, as amostras não devem ser usadas para microarrays. Microarrays devem ter fundo muito baixa, que é uma ordem de magnitude menor do que a sonda mais fraco tRNA. Elevado ruído de fundo é geralmente devido a problemas durante as etapas de lavagem. Isto normalmente pode ser corrigido através da preparação de soluções de lavagem fresca e lavar bem todos os equipamentos e tubulação para remover SDS residual e precipitado. <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Detalhes </td></tr><tr><td> O-ring condicionado </td><td> 75 ° C, 2 min </td></tr><tr><td> Apresentar amostra </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> Exemplo de desnaturar </td><td> 90 ° C, 5 min </td></tr><tr><td> Hibridização </td><td> 60 ° C, 16h </td></tr><tr><td> Lavar uma </td><td> 50 ° C, 10s fluxo segurar 20s </td></tr><tr><td> Lavar 2 </td><td> 42 ° C, 10s fluxo segurar 20s </td></tr><tr><td> Lavar 3 </td><td> 42 ° C, 10s fluxo segurar 20s </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Protocolo de hibridação

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos um método para determinar simultaneamente os níveis relativos de carga de todos os tRNAs em escala genômica. O protocolo aqui apresentado foi otimizado para S. cerevisiae, e também tem sido utilizado com sucesso para medir perfis de carga tRNA em E. coli e culturas de células humanas. Ele pode ser modificado para acomodar qualquer organismo com seqüências do genoma conhecido (permitindo a anotação de todos os genes tRNA), desde que tRNA cobrados total pode ser obtida.

<table><tbody><tr><td>Colunas Microspin G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Phe&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Tyr&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Lys&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; aminoacil-tRNA sintetases</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>Ligase de DNA T4</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>Estação Hyb4</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner GenePix 4000B</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise do genoma de aminoacylation (carregamento) níveis de trna usando microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, ou carga, os níveis podem mudar rapidamente dentro de uma célula em resposta ao ambiente [1]. Mudanças nos níveis de carregamento tRNA em células procariotas e eucariotas levar a regulação de translação que é um dos principais mecanismos celulares de resposta ao estresse. Exemplos familiares são a resposta rigorosa em<em&gt; E. coli</em&gt; Eo Gcn2 via resposta ao estresse em leveduras ([2-6]). Trabalhos recentes na<em&gt; E. coli</em&gt; E<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Têm mostrado que os padrões de tRNA carga são extremamente dinâmica e depende do tipo de stress experimentado pelas células [1, 6, 7]. A natureza altamente dinâmico, variável de tRNA de carregamento torna essencial para determinar mudanças nos níveis de tRNA de carregamento em escala genômica, a fim de elucidar totalmente resposta celular a variações ambientais. Nesta revisão, apresentamos um método para medir simultaneamente os níveis relativos de carga de todos os tRNAs em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;. Enquanto o protocolo aqui apresentado é para o fermento, este protocolo tem sido aplicado com sucesso para determinar níveis de carga em relação em uma ampla variedade de organismos, incluindo<em&gt; E. coli</em&gt; E culturas de células humanas [7, 8].

Nós descrevemos um método para análise de microarray para determinar os níveis aminoacylation relação de todos os tRNAs de<em&gt; S. cerivisiae.</em

Análise do genoma de Aminoacylation (carregamento) Níveis de tRNA Usando Microarrays

Os níveis de aminoacilação, ou carregamento, do tRNA podem alterar-se rapidamente dentro de uma célula em resposta ao ambiente[1]. Mudanças nos níveis de carregamento do tRNA em ambos...

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar as alterações relativas nos níveis de carregamento de TRNA. Isso é alcançado isolando o RNA em pH baixo antes e após o tratamento, a fim de obter TRNA com níveis de carregamento intactos. Como segundo passo, o RNA é submetido a um tratamento de oxidação com periodato, o qual permite a determinação dos níveis relativos de carregamento.A seguir, ligue as amostras a um oligonucleotídeo fluorescente e hibridize em um microarranjo para medir as alterações nos níveis de ligação decorrentes do carregamento de A-T-R-N-A, obtendo-se os resultados. As alterações no nível genômico de CHO no carregamento de TRNA com base na tecnologia de microarranjo de TRNA. Olá, sou John Zai do laboratório de DRT Pan do departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade de Chicago.Hoje vou mostrar um procedimento para isolar e medir o tRNA carregado ao nível genômico. Utilizamos isso para medir alterações no carregamento de tRNA durante estresses em nosso laboratório. Então, vamos começar.Para isolar a carga total em tRNA, comece cultivando no mínimo o equivalente a 30 OD 600 de células de levedura, o que deve produzir 30 microgramas de RNA total. Pelaque as células em uma centrífuga de bancada. Re-suspenda as células em uma solução tampão de lise. Adicione um volume igual de acetato de sódio, fenol clorado saturado e clorofórmio, e vortexe por 30 segundos, seguido por repouso no gelo por pelo menos 30 segundos.Repita a vórtex e o picotamento mais duas vezes. Centrifugue a amostra a 18.600 RFC por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova a camada aquosa e realize outra extração com fenol clorofórmico saturado com acetato após a segunda extração.Precipite o RNA adicionando 2,7 volumes de etanol e centrifugue a 18.600 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Re-suspenda os pellets de RNA em solução tampão de lise e, em seguida, precipite com etanol uma segunda vez. Finalmente, re-suspenda o RNA em uma solução contendo acetato tamponado 10 milimolar e 1 milimolar de EDTA para tratamento subsequente.A amostra pode ser armazenada de forma estável a menos 80 graus Celsius por cerca de duas semanas a mais. O armazenamento não é recomendado, pois alguns TNA carregados começarão a decair antes da marcação com as etiquetas oligonucleotídicas fluorescentes S3 ou SCI cinco. O TRNA total é submetido a um tratamento de oxidação com paraidiodobenzoato, que permite a determinação dos níveis relativos de carregamento, misturando-se o RNA total com 0,066 micromolar de cada padrão de eco irna e acetato tamponado 100 milimolar na presença de paraidiodobenzoato de sódio 50 milimolar; para a amostra de TRNA controle que não será oxidada, utiliza-se cloreto de sódio 50 milimolar no lugar do paraidiodobenzoato de sódio.Incube as reações por 30 minutos à temperatura ambiente; após 30 minutos, interrompa a reação adicionando glicose até uma concentração final de 100 milimolares e incubando à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a interrupção da reação, realize uma troca de tampão utilizando uma coluna giratória G 25 para remover qualquer restante de prorato de sódio das amostras. Precipite as amostras adicionando acetato tamponado até uma concentração final de 133 milimolares de cloreto de sódio, até uma concentração final de 66 milimolares, e 2,7 volumes de etanol.Em seguida, deci, isole as amostras de tRNA por Resus, suspendendo-as em cloreto de tris 50 milimolar HCL e incubando a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, neutralize a reação adicionando um volume igual de acetato tamponado 50 milimolar e cloreto de sódio 100 milimolar, precipitando com 2,7 x volumes de etanol. Re suspenda o pellet de RNA em água a cerca de um micrograma por microlitro.Após verificar a qualidade do RNA das amostras controle e oxidadas por eletroforese em géis de agarose, podemos prosseguir com a marcação fluorescente para ligar as etiquetas oligonucleotídicas fluorescentes ao tRNA. Combine 0,1 micrograma por microlitro de RNA com oligonucleotídeos contendo SI três ou SI cinco a quatro micromolar, tampão da ligase 1, 15% de DMSO, 0,5 unidades por microlitro de ligase T4 de DNA e fosfatase de levedura; incube a 16 graus Celsius por mais de 16 horas. Após a ligação, misture as amostras com quatro volumes de acetato de potássio e cloreto de potássio e, em seguida, extraia com um volume igual de fenol-clorofórmio. Após a extração da fase aquosa, precipite as preparações de RNA com etanol. Por fim, ressuspenda os pellets de RNA em água até cerca de 0,1 micrograma por microlitro antes da hibridização. Incube as lâminas de microarranjo, óleo e água destilada por um a dois minutos para remover oligonucleotídeos não ligados.Em seguida, combine as cinco amostras marcadas do S3 ou SCI com 140 microlitros de tampão de hibridização contendo DNA de esperma de salmão numa concentração final de 140 microgramas por mililitro e poli A numa concentração final de sete D microgramas por mililitro, e execute um programa de hibridização em um hibridizador automático de matrizes. Recomendamos fortemente o uso de uma máquina automática de hibridização para trabalhos com TRNA, já que a hibridização manual produz alto fundo. Ao finalizar o programa de hibridização, lave manualmente as lâminas com a solução de lavagem três, agitando suavemente em um tubo cônico de 50 mililitros por três a cinco minutos.Lave as lâminas pelo menos duas vezes em tubos previamente envolvidos com papel alumínio. Seque as lâminas centrifugando em baixa velocidade por cinco a 10 minutos para obter resultados ideais. As lâminas devem ser escaneadas imediatamente após a secagem.As lâminas podem ser escaneadas duas a três vezes sem degradação perceptível na qualidade da imagem. Resultados representativos de uma amostra de RNA total adequadamente isolada e sua análise são mostrados aqui. Esta amostra apresenta um espectro muito limpo, com uma razão OD260/OD280 próxima a dois, sem contaminação detectável por proteínas ou fenol quando analisada em géis de agarose a 1%. Tanto as amostras oxidadas quanto as controle devem apresentar uma banda forte de RNA, com outras possíveis bandas de ácidos nucleicos variando entre organismos.Se uma amostra for visivelmente mais fraca do que outras amostras, ou se for observado deslocamento difuso, as amostras não devem ser usadas para microarranjos. Os microarranjos devem apresentar um fundo muito baixo, que é uma ordem de grandeza inferior à sonda de TRNA mais fraca. Acabei de mostrar como isolar e determinar os níveis relativos de carregamento de TRNA ao realizar este procedimento.É importante lembrar-se de manter seus reagentes livres de nucleases, especialmente durante as etapas de oxidação e dilatação. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Ribossomas desempenham um papel central na síntese de proteínas. Polyribosome (polysome) fracionamento por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose permite a determinação direta da eficiência de tradução de mRNAs individuais em uma escala de todo o genoma. Além disso, este método pode ser usado para a análise bioquímica de ribossomas e factores associados--polissomas como acompanhantes e moléculas de sinalização.

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