drosófila Monitor de Atividade (DAM): Um Método para Medir a Atividade Locomotora em Moscas

- O Drosophila Activity Monitor, ou DAM, contém tubos de atividade centralizados equipados com comida de mosca em uma extremidade e um mais próximo permeável ao ar na outra. Essa configuração acomoda moscas únicas durante experimentos que duram vários dias ou até semanas.

Coloque o DAM em um ambiente controlado, como uma incubadora, com temperatura, umidade e ciclo de luz definidos. Conduza o experimento em uma sala escura e, se necessário, use uma fonte de luz infravermelha para manusear o dispositivo, que, ao contrário da luz brilhante, não influencia o sistema circadiano da mosca.

Para registrar a atividade locomotora, conecte o aparelho a um sistema de computador que armazene as leituras dos detectores do DAM. Os componentes eletrônicos do DAM detectam continuamente a integridade de um feixe infravermelho que é emitido através do ponto médio de cada tubo e carregam dados periodicamente para o sistema de computador.

À medida que a mosca anda para frente e para trás dentro do tubo, ela cruza o feixe infravermelho. Essas interrupções são contadas pelo DAM ao longo do tempo para cada tubo e servem como uma medida da atividade da mosca.

No protocolo a seguir, usaremos o sistema DAM para estudar os ritmos circadianos em machos adultos de Drosophila.

- Antes de carregar as moscas nos tubos de atividade, ligue as incubadoras que serão usadas para abrigar os monitores de atividade. Ajuste a temperatura usando os controles da incubadora e defina o regime claro/escuro usando o controlador de luz do sistema DAM ou o próprio sistema de controle de luz da incubadora, de acordo com o projeto experimental desejado.

Em seguida, anestesie as moscas com dióxido de carbono. Em seguida, usando um pincel fino, transfira suavemente uma única mosca para um tubo de atividade. Pegue o meio de um único pedaço de fio com cerca de meia polegada com uma pinça fina e insira o fio na extremidade não alimentar do tubo de atividade para tampar a abertura e evitar que a mosca escape durante o experimento, ao mesmo tempo em que permite o fluxo de ar para o tubo.

Mantenha o tubo deitado de lado até que a mosca acorde para evitar que a mosca fique presa à comida. Insira os tubos nos monitores de atividade. Com o modelo mais novo e compacto dos monitores TriKinetics, é necessário manter os tubos no lugar com elásticos para garantir que o feixe infravermelho passe pelo tubo na posição central.

Por fim, coloque os monitores de atividade nas incubadoras e conecte-os ao sistema de coleta de dados por meio dos fios telefônicos. Verifique, usando o software de coleta do sistema DAM, se todos os monitores estão conectados corretamente e se os dados estão sendo coletados de cada um deles.

Agora que as moscas foram carregadas nos tubos de atividade e o sistema de monitoramento da atividade locomotora está pronto, os dados podem ser registrados. As moscas são sincronizadas e arrastadas expondo-as à luz/escuridão desejada, ou LD, e ao regime de temperatura por dois a cinco dias completos. A condição de arrastamento mais comumente usada é um ciclo claro/escuro de 12 horas de luz/12 horas de escuridão a 25 graus Celsius.

Para o estudo dos ritmos circadianos em relação a este protocolo, o tempo em que as luzes se acendem na incubadora é definido como tempo zeitgeber 0 e todos os outros tempos são relativos a esse valor. Sob condições padrão de LD 12:12, Drosophila melanogaster do tipo selvagem normalmente exibe dois surtos de atividade; um centrado em torno de ZT0, denominado pico da manhã, e outro em torno de ZT12, denominado pico da noite.

Os ritmos de atividade locomotora de corrida livre são medidos sob condições constantes de escuridão e temperatura após o período de arrastamento. A configuração para o ciclo de luz pode ser alterada a qualquer momento na fase escura no último dia de LD, de modo que o dia subsequente do experimento represente o primeiro dia de DD. Sete dias de coleta de dados DD são suficientes para calcular o período circadiano e a amplitude ou força do ritmo das moscas.

Em geral, um tamanho de amostra de pelo menos 16 moscas é necessário para obter períodos de corrida livre confiáveis para um determinado genótipo. Na conclusão do experimento, os dados binários brutos coletados usando o software do sistema DAM são baixados em um dispositivo portátil de armazenamento de dados, por exemplo, uma chave USB.

Os dados binários brutos são processados usando o DAM Filescan102X e somados em compartimentos de 15 e 30 minutos ao analisar parâmetros circadianos ou em compartimentos de 1 a 5 minutos ao analisar parâmetros de sono/repouso. Atualmente, cinco minutos contíguos de inatividade é a definição padrão de sono/repouso em Drosophila.