Este protocolo é um trecho de Chiu et al., Ensaio da atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e parâmetros do sono em Drosophila, J. Vis. Exp.(2010).
1. Carregando moscas em tubos de atividade e sistema de monitoramento de atividade locomotora
- Antes de carregar as moscas nos tubos de atividade, ligue as incubadoras que serão usadas para abrigar os monitores de atividade. Ajuste a temperatura usando os controles da incubadora e defina o regime claro/escuro usando o controlador de luz do sistema DAM OU o próprio sistema de controle de luz da incubadora de acordo com o projeto experimental desejado. O tempo necessário para carregar as moscas nos tubos de atividade deve ser suficiente para que a temperatura se estabilize.
- Anestesie as moscas com dióxido de carbono.
- Use um pincel fino para transferir suavemente uma única mosca para um tubo de atividade.
- Pegue o meio de um único pedaço de fio com cerca de meia polegada com uma pinça fina e insira o fio na extremidade não alimentar do tubo de atividade para tampar a abertura e evitar que a mosca escape durante o experimento, ao mesmo tempo em que permite o fluxo de ar para o tubo. Alternativamente, tampas de plástico com pequenos orifícios (Trikinetics, Inc.) podem ser usadas para fechar a abertura.
- Certifique-se de que os tubos sejam colocados de lado até que a mosca desperte, caso contrário, existe o risco de a mosca ficar presa na comida.
- Insira os tubos nos monitores de atividade. Com o modelo mais novo e compacto dos monitores Trikinetics (Trikinetics DAM2 e DAM2-7), é necessário segurar os tubos no lugar com elásticos para garantir que o feixe infravermelho passe pelo tubo na posição central.
- Coloque os monitores de atividade nas incubadoras e conecte-os ao sistema de coleta de dados por meio dos fios telefônicos. Verifique usando o software de coleta do DAM System para certificar-se de que todos os monitores estejam conectados corretamente e que os dados estejam sendo coletados de cada um deles. O monitor emite feixe de luz infravermelha no centro de cada tubo de atividade de vidro. A atividade locomotora das moscas é registrada como dados binários brutos, onde "um" é registrado cada vez que o feixe infravermelho é quebrado ou um 'zero' é registrado no qual o feixe infravermelho não é quebrado.
2. Desenho Experimental para Registro de Dados para Determinação da Periodicidade e Amplitude Circadiana
- As moscas são sincronizadas e arrastadas expondo-as ao regime de luz/escuridão (LD) e temperatura desejado por 2-5 dias completos. A condição de arrastamento mais comumente usada é um ciclo claro/escuro de 12 horas de luz/12 horas de escuridão (12:12 LD) a 25 °C. Esta condição padrão geralmente aceita é essencialmente baseada no pensamento de que Drosophila se originou de locais afro-equatoriais. Ao estudar os ritmos circadianos, há alguma fraseologia com a qual é preciso se familiarizar. Relevante para este protocolo, o tempo em que as luzes se acendem na incubadora é definido como tempo zeitgeber 0 (ZT0) e todos os outros horários são relativos a esse valor (por exemplo, em um ciclo LD 12:12, ZT12 é o tempo em que as luzes são desligadas). Sob condições padrão de LD 12:12, Drosophila melanogaster do tipo selvagem normalmente exibe dois surtos de atividade; um centrado em torno de ZT0 denominado pico "matinal" e outro em torno de ZT12 denominado pico "noturno" (Figura 1A). As crises da manhã e da noite são controladas pelo relógio endógeno, mas também há respostas de "sobressalto" que são explosões transitórias de atividade em resposta às transições claro/escuro. Dois dias de arrastamento é o mínimo e pode ser usado, por exemplo, em telas grandes que consomem mais tempo e são voltadas para medir períodos de corrida livre na escuridão constante (veja abaixo, etapa 2). No entanto, se você estiver interessado em estudar os padrões de atividade durante um ciclo diário claro-escuro, é preferível manter as moscas por 4-5 dias em LD para obter mais dados. Essencialmente, aumentar o número de moscas ou o número de dias de LD na análise final de dados (por exemplo, dados de pool dos últimos dois dias de atividade locomotora de LD) gerará perfis e medições de atividade diurna mais confiáveis (por exemplo, tempo de pico da manhã ou da noite). Além disso, a distribuição diária da atividade varia em função da duração do dia (fotoperíodo) e da temperatura. Uma das principais razões para alterar o fotoperíodo ou a temperatura do padrão é se alguém quisesse estudar como os padrões de atividade diária sofrem adaptação sazonal (por exemplo, Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). Drosophila também pode ser arrastada para ciclos diários de temperatura (por exemplo, Glaser e Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et al., Neurônio (2009)). Ciclos de temperatura que variam em apenas 2-3 °C são suficientes para arrastar os ritmos de atividade.
- Os ritmos de atividade locomotora de corrida livre são medidos em condições constantes de escuridão e temperatura após o término do período de aprisionamento (veja acima, etapa 1). A configuração para o ciclo de luz pode ser alterada a qualquer momento na fase escura no último dia de LD, de modo que o dia subsequente do experimento represente o primeiro dia de DD. Sete dias de coleta de dados DD são suficientes para calcular o período circadiano e a amplitude (por exemplo, potência ou força do ritmo) das moscas. Em geral, um tamanho de amostra de pelo menos 16 moscas é necessário para obter períodos de corrida livre confiáveis para um determinado genótipo. Mesmo que alguém esteja interessado apenas em medir a atividade diurna, ainda é melhor medir os períodos de corrida livre das moscas em DD, pois mudanças no período endógeno podem alterar a distribuição diária da atividade em LD. Por exemplo, moscas com longos períodos endógenos geralmente exibem picos noturnos tardios em LD (por exemplo, consulte Figura 2).
- Na conclusão do experimento, os dados binários brutos coletados usando o software do sistema DAM são baixados em um dispositivo portátil de armazenamento de dados, por exemplo, chave USB.
- Os dados binários brutos são processados usando o DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) e somados em compartimentos de 15 e 30 minutos ao analisar parâmetros circadianos ou em compartimentos de 1 a 5 minutos ao analisar parâmetros de sono/repouso. Atualmente, cinco minutos contíguos de inatividade é a definição padrão de sono/repouso em Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho e Sehgal, Métodos Enzymol., (2005)).
- Existem muitas maneiras diferentes de analisar os dados coletados no sistema DAM, mas forneceremos apenas os métodos usados rotineiramente em nosso laboratório. O Microsoft Excel é usado para atribuir genótipos a diferentes grupos de amostras. Software FaasX (M. Boudinot e F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, França) ou Insomniac (programa baseado em Matlab; Leslie Ashmore, Universidade de Pittsburgh, PA) são usados para examinar parâmetros circadianos (por exemplo, período e potência) ou sono/repouso (por exemplo, porcentagem de sono, duração média do período de descanso), respectivamente.
