Por que a determinação da IC50 é crítica antes da escalada de dose?

O estabelecimento da IC50 basal por meio do ensaio MTT fornece a concentração de referência para iniciar a escalada de dose em 1/10 da IC50, garantindo que a pressão seletiva seja aplicada sem citotoxicidade imediata. Isso permite o desenvolvimento gradual de resistência ao longo do tempo, em vez de morte celular aguda.

Como a saída do ensaio MTT informa o desenvolvimento de resistência?

O ensaio MTT mede a produção de formazano a partir da atividade da redutase mitocondrial em células viáveis, sendo a densidade óptica a 570 nm proporcional ao número de células; a resistência é confirmada quando as células mantêm viabilidade em concentrações crescentes de afatinibe que inicialmente inibiram o crescimento.

O que permite a replicação confiável do desenvolvimento de linhagens celulares resistentes?

A escalada progressiva da dose em subconfluência, com aumentos de concentração de 10-20% a cada passagem, fornece um protocolo padronizado de pressão seletiva que pode ser replicado entre laboratórios para gerar modelos isogênicos resistentes.

Por que os requisitos de replicação são essenciais para a colaboração multifuncional?

O desenvolvimento consistente de resistência entre réplicas garante que os fenótipos observados sejam geneticamente determinados e não estocásticos, permitindo uma transição confiável entre as equipes de descoberta, desenvolvimento de ensaios e pré-clínicas para estudos de validação de alvos.

Qual análise estatística é necessária para confirmar o desenvolvimento de resistência?

A resistência é confirmada pela comparação das curvas de viabilidade derivadas do ensaio MTT entre células parentais e células com dose escalonada, exigindo teste de significância estatística (por exemplo, análise de deslocamento da IC50) para demonstrar a redução da sensibilidade ao fármaco ao longo do tempo.

Escalonamento de dose: um método para desenvolver resistência a medicamentos em células cancerígenas

JoVE Encyclopedia of Experiments

Pesquisa sobre o Câncer

0 vistas • 4:17 min • April 30th, 2023

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- Os inibidores de tirosina quinase, TKI, bloqueiam a ligação do receptor de quinase ao ATP, impedindo a fosforilação. Comece com o plaqueamento de células cancerígenas em meios de crescimento. Permita que eles atinjam densidade favorável e transfira as células para vários poços. Após o crescimento noturno, dispense diferentes concentrações de drogas em vários poços e deixe as células crescerem pela duração desejada. Adicione MTT, um corante solúvel em água, para medir a viabilidade celular. As enzimas mitocondriais convertem o MTT em formazan roxo insolúvel dentro das células vivas.

Pare a reação adicionando um agente solubilizante adequado e meça o formazano espectrofotometricamente. Este método é chamado de ensaio MTT. Plote um gráfico de células vivas indicadas por formazan em relação às concentrações de drogas. Calcule a concentração inibitória, IC₅₀, encontrando a concentração do medicamento que mata 50% das células usando o software.

Em seguida, cultive as células cancerígenas no meio de crescimento e distribua-as em três placas diferentes. Depois que as células atingirem a subconfluência, adicione 1/10 de diluição da concentração de IC₅₀. Permita que as células cresçam e realize o ensaio MTT. Repita esse processo com o aumento da dosagem do medicamento. As células cancerígenas desenvolvem lentamente resistência aos TKIs devido a mutações na sequência de proteínas.

O protocolo a seguir mostra o desenvolvimento de resistência ao afatinibe em células PC9 por escalonamento de dose.

- Para determinar a concentração apropriada de resistência ao afatinibe, cultive células PC9 em meio de crescimento em uma placa tratada com cultura de células de 10 centímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Ressuspenda as células PC9 em uma concentração de 4 vezes 10 a 4 células por mililitro de meio de crescimento e semeie as células a 50 microlitros de suspensão de células por poço em uma microplaca de 96 poços. Após uma incubação noturna na incubadora de cultura de células, trate as células com 50 microlitros de solução de afatinibe por poço em seis repetições das concentrações indicadas. E após uma incubação de 96 horas na incubadora de cultura de células, adicione 15 microlitros de corante MTT a cada poço.

Após quatro horas na incubadora de cultura de células, adicione 100 microlitros de solução de parada de solubilização a cada poço e retorne a placa à incubadora durante a noite. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica em 570 nanômetros em um leitor de microplacas. Para exposição contínua ao afatinibe, cultive células PC9 em placas P100 contendo 10 mililitros de meio de crescimento até que as células atinjam a subconfluência.

Transferir as culturas subconfluentes para três novas placas P100 de 9 mililitros de meio de cultura por placa de cultura inicial e devolver as células à incubadora de cultura de células. Na manhã seguinte, adicione 0,1 nanomolar ou 1/10 da metade da concentração inibitória máxima de afatinibe a cada conjunto de três placas de cultura. Quando as células tratadas com afatinibe se tornarem subconfluentes, use uma pipeta de 1 mililitro para misturar completamente as culturas e transfira 1 mililitro de células de cada placa para 9 mililitros de meio de crescimento fresco em novas placas P100.

Adicione concentrações 10% a 20% mais altas de afatinibe às novas culturas, aumentando a concentração de afatinibe por escalonamento gradual da dose cada vez que as culturas atingirem a subconfluência em um período de 10 a 12 meses. Quando uma concentração de afatinibe de 1 micromolar for atingida, execute o ensaio de MTT conforme demonstrado para confirmar que as células desenvolveram resistência ao afatinibe.