Ensaio de imunofluorescência: um método para identificar células tumorais capturadas em um fio médico

0 vistas4:32 min • April 30th, 2023

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- Pegue um fio funcionalizado com uma pequena porção de ouro revestida com um hidrogel acoplado a anticorpos de interesse. Mergulhe a parte dourada do fio em um frasco contendo células tumorais. Feche-o com uma rolha de arame e incube-o em um rotador de tubo. As células tumorais circulantes ou CTCs que exibem antígenos de superfície se ligam aos anticorpos no fio. Enxágue o fio mergulhando em frascos contendo solução salina tamponada com fosfato ou PBS e seque ao ar. Agora mergulhe o fio em uma solução de acetona para fixar as células desidratando-as.

Em seguida, insira suavemente o fio através de uma ponta P200 com a parte funcionalizada dentro dela. Encha a fita com um anticorpo conjugado com um fluorocromo para submergir o fio. Esses anticorpos marcados se ligarão aos seus respectivos antígenos presentes nas células. Sele a abertura com um filme de laboratório e incube durante a noite no escuro a 4 graus Celsius. Em seguida, lave o fio com PBS para remover quaisquer anticorpos não ligados. Coloque o fio em um suporte de fio e view sob um microscópio fluorescente. As CTCs ligadas por anticorpos fluorescem no fio. No protocolo a seguir, capturaremos CTCs em um fio médico e as identificaremos por coloração imunofluorescente.

- Para iniciar o experimento, ressuspenda todo o conteúdo de um frasco T75 que está a 80% de confluência em um frasco de 5 mililitros usando 4 mililitros de meio completo. Em seguida, remova o fio da embalagem de vidro. Mergulhe a parte dourada funcionalizada do fio no frasco, garantindo que a rolha do fio seja à prova d'água para um frasco de 5 mililitros. Sele o fio com filme de laboratório. Em seguida, incube o fio em um rotador de tubo por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a rotação, enxágue o fio três vezes em uma solução PBS dobrada usando três frascos limpos diferentes e espere o fio secar.

Após secar o fio ao ar por 10 minutos em um exaustor, fixe as células mergulhando o fio em solução de acetona 100% em um tubo de 5 mililitros por 10 minutos em temperatura ambiente. Certifique-se de que não haja vestígios de acetona na ponta funcionalizada. Seque o fio ao ar por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, em um tubo de 5 mililitros, lave o fio duas vezes em uma dobra PBS. Incube o fio em tampão de diluição de anticorpos.

Prepare 150 microlitros de mistura de anticorpos com uma diluição de anticorpo primário monoclonal conjugado com fluorocromo e tampão de diluição de anticorpos, conforme especificado na folha de dados. Em seguida, use uma ponta P200 para extrair o fio da rolha de arame e insira suavemente o fio através do orifício maior da ponta. Insira a extremidade não funcionalizada primeiro e puxe lentamente o fio pelo orifício menor até que a parte dourada esteja logo além do orifício maior. Adicione suavemente 150 microlitros da mistura de anticorpos na ponta.

Para evitar o risco de formação de bolhas, gire suavemente o fio até que a extremidade funcionalizada esteja completamente mergulhada. Sele o orifício da ponta e enrole o filme de laboratório ao redor do orifício. Incube o fio verticalmente durante a noite no escuro a 4 graus Celsius. No segundo dia, bloqueie a incubação de anticorpos lavando o fio duas vezes em uma dobra PBS. Reinsira o fio em sua rolha de fio.

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Última atualização: 22 agosto 2026