Resposta quimiotática de microorganismos marinhos para Micro-Escala de Camadas de nutrientes

Olá, meu nome é Marcos. Estou trabalhando com o Professor Roman Stalker no Departamento de Engenharia Civil e Ambiental do MIT e vou mostrar a vocês como fabricar um microcanal utilizando a técnica de auto-fotografia. E para começar, precisamos projetar uma máscara.

Então, esta é a máscara, que é basicamente o design final do microcanal que pretendemos criar. Este é o projeto de um injetor, com o qual podemos produzir uma camada fina de nutriente onde colocamos microrganismos nadando ao redor, e observamos como ocorre o quimiotaxismo. Este é um canal com uma cavidade lateral para gerar um microvórtice dentro da cavidade. Haverá um vídeo demonstrando isso posteriormente. Após obter a máscara, levamos as pastilhas até a sala limpa e as colocamos na placa de Petri. E agora vamos para a sala limpa.

Ok, então, após termos a nossa máscara impressa e pronta, agora estamos na sala limpa para realizar as microfabricações propriamente ditas. E o que vou fazer agora é pegar um pedaço da pastilha limpa que acabei de adquirir e quero apenas garantir que ela esteja extra limpa utilizando os seguintes três solventes. O primeiro passo é limpar com acetona e, em seguida, imediatamente com metanol.

E então o passo final é o isopropanol. E estamos trabalhando no lado brilhante da pastilha, que está preparado para o revestimento. E agora vou secá-la usando nitrogênio.

Após secar a pastilha, agora colocamos a pastilha dentro de um forno a cerca de 130 Celsius e a aquecemos por cinco a dez minutos. Enquanto isso, enquanto aguardamos o aquecimento da pastilha, podemos preparar as duas placas aquecedoras, uma a 175 Celsius e a outra a 195 Celsius. Após o aquecimento por cinco minutos, retiramos a pastilha do forno e a deixamos repousar à temperatura ambiente por cerca de cinco minutos.

Em seguida, estamos prontos para a deposição por centrifugação. Antes de despejar o fotoresiste, precisamos garantir que não haja partículas de poeira sobre ele; usamos nitrogênio para borrifar sobre a superfície da pastilha. O movimento de pulverização é feito do centro para fora.

Agora vou despejar o fotoresiste sobre esta pastilha. Despejamos uma quantidade de cerca de três mililitros. Tente manter o frasco o mais baixo possível para que não se formem bolhas ao despejar o fotoresiste sobre a pastilha.

Agora, deixe o fotoresiste repousar sobre a pastilha por cerca de um minuto antes de iniciarmos a centrifugação. E, como mencionei, vou fazer um revestimento com espessura de cem mícrons. Portanto, configuramos o tempo total de centrifugação para 55 segundos e podemos começar a girar.

Primeiramente, tentamos aumentar a velocidade de rotação de zero a 500 RPM em cinco segundos e mantemos a rotação por cerca de 10 segundos, de modo que você possa observar que o fotoresiste está cobrindo toda a pastilha; em seguida, aumentamos para 3000 RPM por cerca de sete segundos e mantemos a rotação por 30 segundos. Após revestir a pastilha com o fotoresiste, agora coloco a pastilha sobre a placa aquecedora e realizo uma pré-secagem a 65 graus Celsius por cinco minutos e a 95 graus Celsius por 20 minutos. Após a conclusão da pré-secagem a 95 graus Celsius, resfriamos até a temperatura ambiente, mas antes disso, resfriamos novamente a 65 graus Celsius por cerca de dois a três minutos, para que não ocorra uma diminuição rápida da temperatura.

Em seguida, deixamos em temperatura ambiente para esfriar por cerca de cinco minutos. Agora, vou expor o material à luz UV, de modo que a parte exposta seja endurecida e a parte não exposta seja removida posteriormente. Esta é a etapa em que utilizamos a máscara, e como é possível observar, a máscara possui duas partes: uma parte transparente e outra parte completamente opaca ou preta nesta configuração.

Então, vou colocar essa máscara sobre a pastilha revestida. A máscara que você recebe da empresa de impressão tem dois lados. Um é o lado onde eles imprimem com a tinta.

E este é um local que você deseja colocar em contato com a pastilha. Agora vou expor a pastilha através da máscara com luz UV. E por motivos de segurança, vou usar estes óculos de proteção.

A quantidade do tempo de exposição depende da SUA que você está utilizando e também da espessura que está tentando obter. Agora, após a exposição, coloco a pastilha em uma placa quente a 65 graus e a aqueço novamente por cinco minutos, seguido por 95 graus Celsius por 20 minutos. E apenas para lembrar, esse tempo de aquecimento varia conforme a espessura desejada e também de acordo com o tipo de processo que você está utilizando.

A partir deste ponto, vamos desenvolver a pastilha. Desenvolver significa remover a parte indesejada da resina fotossensível, de modo que apenas a região exposta permaneça na pastilha. Para desenvolver a pastilha e remover a parte indesejada da resina fotossensível, utilizamos o revelador.

Neste caso, estou utilizando acetato de pomonal como revelador e vou despejar este solvente neste béquer, colocar a pastilha e imergi-la no béquer por cerca de 10 minutos. Novamente, o tempo varia conforme a espessura e o solvente que você estiver usando. Agora, após 10 minutos, é possível observar que o que restou nesta pastilha é o desenho do canal desejado, e toda a parte indesejada foi removida, bastando apenas enxaguá-la.

Utilizamos o mesmo solvente, um novo, o mesmo acetato de polivinila e apenas aplicamos na superfície da pastilha para enxaguá-la. E, por fim, para remover o solvente, utilizamos isopropanol e enxaguamos novamente. Agora, secamos com jato de nitrogênio.

E agora você tem uma pastilha limpa com o padrão desejado nela. E chamamos isso de molde mestre. Agora estamos voltando ao nosso laboratório para despejar PDMS sobre ele e continuar o restante do procedimento.

Agora voltamos da sala limpa e temos o molde mestre, que é basicamente o modelo para o molde que utilizaremos. O próximo passo é despejar PDMS, que é um polímero, e deixá-lo curar. Como é possível observar, ao despejar um polímero sobre este molde, o polímero apresentará ranhuras e, eventualmente, ao ser ligado a um vidro, o próprio polímero formará o canal.

Agora vamos preparar o PDMS. Este é o PDMS, que é o polímero, o poli(dimetilsiloxano) PDMS. E este é o agente de cura.

O que vou fazer é despejar este agente de cura neste copo e despejar este PDMS neste copo e misturá-los numa proporção de um para 10. Assim, geralmente queremos usar um palito para misturar de forma homogênea. Ao misturar, geramos muitas bolhas, e as bolhas são uma espécie de indicador para nos dizer se já misturamos ou não.

Agora, após misturar o PDMS com o agente de cura, estamos prontos para despejar essa mistura sobre o molde-mestre, que é uma pastilha. E apenas para garantir que a pastilha não se mova durante o despejo, fixamos a pastilha com uma fita adesiva. Antes de despejar a mistura de PDMS sobre a pastilha, devemos tentar deixar a superfície da pastilha o mais limpa possível da poeira que possa ter se depositado sobre ela.

Então ligamos o compressor para remover a poeira da pastilha. Ok, você pode ver que o PDMS tem muitas bolhas. Vamos remover as bolhas colocando isso dentro de uma câmara de vácuo.

Portanto, a sucção demora aproximadamente 30 minutos para remover todas as bolhas. E, uma vez concluída a remoção das bolhas, retiramos isso e colocamos no forno a 65 graus Celsius, deixando assar por pelo menos 12 horas. E, após essas 12 horas, teremos a pastilha pronta para o corte.

Vou usar esta faca para cortar o PDMS e remover o PDMS da pastilha e, em seguida, usarei este furador para abrir o orifício das entradas e saídas da tubulação. Ao cortar, você deve colocar sua faca até que ela atinja a pastilha, mas não aplique muita pressão para não quebrar a pastilha; corte ao redor do seu canal. Agora, retire-o.

Você tem, então agora você pode ver que este é o canal, que é o padrão proveniente da wafer. Assim, você pode ver que são iguais. E agora este padrão foi gravado neste polímero, este PDMS.

E uma vez que eles ligam isso a um vidro, isso será o canal para o nosso experimento. O próximo passo, que é importante, é lembrar de furar orifícios para que possamos inserir entradas e saídas nos microcanais após fazer os furos nos microcanais na PDMS. Por isso, usamos fita adesiva para cobrir o lado do canal, ou seja, onde está o sulco, e fixá-lo.

E a razão pela qual estamos colando esta camada com fita adesiva é remover todas as partículas de poeira. Portanto, o próximo passo é a ligação por plasma. E antes da ligação por plasma, que faremos em outro laboratório, vamos remover a fita e expor a superfície que desejamos ligar, ou seja, esta superfície e a lâmina de vidro juntas, e então expô-las ao plasma de oxigênio; posteriormente, unimos as partes e elas se ligarão.

Olá, meu nome é Justin Seymour e sou pesquisador pós-doutorando no laboratório de Roman Stocker no MIT. Minha pesquisa concentra-se na ecologia microbiana, mais especificamente em como os microrganismos marinhos conseguem encontrar manchas de alimento no oceano. E estamos utilizando técnicas de microfluídica para analisar esses tipos de padrões.

Portanto, vamos utilizar o canal cuja produção foi demonstrada anteriormente por Marcus e após a ligação por plasma. Em seguida, estamos livres para utilizá-lo em um experimento de microfluídica. Antes deste experimento, precisamos preparar os substratos que serão utilizados no experimento.

E no experimento de hoje, vamos analisar como o fitoplâncton marinho *Donella tur electro* é capaz de localizar manchas de alimento em escala microscópica. Neste caso, o alimento é o amônio, e vamos fornecer a ele uma concentração de cem micromolares de amônio. Assim, nesses experimentos, somos capazes de visualizar as manchas de alimento adicionando um corante fluorescente aos nutrientes que fornecemos a eles.

Então, usamos o corante fluoresceína. Aqui, estou pipetando fluoresceína numa concentração final de 100 micromolar no amônio, que utilizamos como nutriente. Em seguida, podemos visualizar esse nutriente por microscopia de fluorescência, o que nos permite observar como uma mancha de nutrientes se difunde e analisar a resposta de organismos a essa mancha de nutrientes.

Assim, nos experimentos de microfluídica, utilizamos seringas de vidro. Portanto, a primeira coisa que queremos fazer é adicionar nossos substratos e organismos às seringas que vamos usar. O próximo passo é inserir a tubulação na configuração microfluídica.

E fazemos isso sobre a platina do microscópio. Assim, colocamos nosso canal de microfluídica sobre a platina do microscópio e, em seguida, inserimos tubos nos inlets e outlets. Depois, inserimos um reservatório de resíduos e garantimos que o reservatório esteja preenchido até a metade com fluido, de modo que os tubos no reservatório de resíduos fiquem completamente submersos.

Isso nos permite manter uma pressão constante dentro do canal. Em seguida, conectamos seringas à tubulação que alimenta o canal de microfluídica contendo os organismos, que neste caso são donella, lector, e o substrato nutricional, que neste caso é o amônio. Em seguida, preparamos o microscópio e observamos o canal de microfluídica na posição apropriada antes de iniciarmos os experimentos.

Uma vez que o canal está posicionado, alternamos para visualizar o canal com a câmera e podemos observá-lo no computador. Agora podemos realizar ajustes mais finos com o foco e podemos visualizar o injetor pelo qual injetamos nutrientes. Este injetor consiste em uma ponta de agulha com fio de 100 micrômetros integrada ao canal de microfluídica.

E podemos produzir um gradiente de nutrientes injetando-os. A partir deste ponto, antes de iniciar os experimentos, precisamos remover quaisquer bolhas que possam ter entrado no sistema de microfluídica. Fazemos isso utilizando uma seringa cheia de água do mar artificial neste caso, que podemos conectar ao canal de microfluídica por meio de uma válvula.

Em seguida, empurramos esta seringa para remover bolhas do canal. Podemos remover as bolhas de duas maneiras: forçando sua saída pela pressão gerada pela seringa, através da saída, ou também forçando-as através das paredes do material PDMS, que é permeável a gases. Uma vez removidas as bolhas e estando prontos para iniciar o experimento, ajustamos as vazões apropriadas para a injeção e os materiais no canal utilizando uma bomba de seringa.

Neste caso, utilizamos uma taxa de fluxo de dois microlitros por minuto, o que equivale a uma velocidade de fluxo no canal de 266 micrômetros por segundo. Após ajustar a taxa de fluxo apropriada, podemos iniciar o experimento começando, iniciando o fluxo, o que cria uma faixa fina de nutrientes. Assim, podemos visualizar os nutrientes à medida que são injetados no canal a partir do ponto de injeção, adicionando corante fluoresceína aos nutrientes e visualizando-os por microscopia de fluorescência APF; em seguida, podemos analisar a dinâmica dos fragmentos interrompendo o fluxo no canal de microfluídica e observando a difusão lateral da faixa de nutrientes a partir de sua posição original.

Em seguida, mudamos para microscopia de contraste de fase para visualizar os organismos nadando dentro do canal e observar suas posições em relação ao gradiente de nutrientes. Isso é possível ao capturar uma sequência de quadros com uma taxa de quadros de 10 por segundo, o que gera um vídeo no qual podemos visualizar esses organismos. Podemos então visualizar os organismos em movimento ao calcular as diferenças temporais entre dois quadros individuais, nos quais um quadro é subtraído do anterior, de modo que apenas os objetos em movimento sejam visualizados.

Assim, podemos remover o ruído de fundo das imagens. Em seguida, gravamos filmes em intervalos regulares durante 10 a 20 minutos após a liberação inicial do gradiente de nutrientes. E, utilizando um software de análise de imagem para sobrepor as posições dos organismos de um quadro para outro na sequência, podemos analisar as alterações na posição desses organismos para obter informações sobre suas trajetórias de natação, a partir das quais podemos extrair dados mais detalhados sobre suas estatísticas de natação, incluindo velocidades e mudanças de direção.

Esses experimentos permitiram-nos, pela primeira vez, examinar diretamente como os micróbios marinhos são capazes de localizar e aproveitar manchas microscópicas de nutrientes. Isso pode ter implicações importantes para a dinâmica trófica e o ciclo de nutrientes no oceano. Assim, complementando o que Justin mencionou, a forma como os micro-organismos, especialmente as bactérias, interagem com seu alimento no oceano pode ter diversos efeitos sobre os ciclos bioquímicos.

No entanto, o oceano é muito dinâmico, e essas condições não são abordadas, existindo muitos fluxos, como a turbulência gerada pelo vento ou na superfície. Na escala de microrganismos, o que eles sentem, o que experimentam, não é exatamente a grande turbulência, mas sim o cisalhamento, e os menores resquícios de turbulência são conhecidos como vórtices de Kolmogorov. O que estamos tentando fazer aqui é entender como, o que queremos estudar, quais são os efeitos desses vórtices no comportamento de agregação de microrganismos.

E para fazer isso, estamos criando outro canal usando essa massa que mostrei a você anteriormente. E há uma cavidade no centro. Deixe-me apenas desenhá-la para ampliar o diagrama.

Então é assim que o canal se parece: temos aqui a vista que vemos de cima, e injetamos o fluxo da esquerda para a direita; devido ao cisalhamento, forma-se uma região de recirculação dentro dessa cavidade. E essa cavidade representa uma grafia de Addis. Podemos usar exatamente a mesma configuração que Justin já explicou anteriormente: quando a bomba de seringa está desligada e eu não ligo nenhum fluxo, é possível observar que as bactérias nadam de maneira bastante aleatória e ativa dentro dessa cavidade.

E não há uma orientação preferencial. E o filme que você está vendo é um filme de diferença temporal, que é exatamente a mesma técnica que Justin está usando. Assim, quando o fluxo é muito rápido, como você pode ver, as bactérias estão sendo deslocadas pelo vórtice.

E a trajetória das próprias bactérias segue a linha de corrente do vórtice. E o que é na verdade mais interessante é o seguinte, quando ligamos a bomba de seringa. Mas a velocidade não é tão alta.

Não é tão rápido que as bactérias não consigam combatê-lo. Mas, de certa forma, ainda é possível ver claramente uma semelhança com um vórtice neste vídeo. Assim, com este experimento, aprendemos que, na presença de um fluxo muito forte e turbulento, as bactérias estão à mercê do fluxo e não conseguem combatê-lo.

No entanto, em uma região de turbulência leve, eles ainda são capazes de nadar por conta própria.