Name: Resposta quimiotática de microorganismos marinhos para Micro-Escala de Camadas de nutrientes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 38 s
Description: Aprenda a fabricar canais microfluídicos para estudar a quimiotaxia de microrganismos marinhos e o comportamento de natação bacteriana em fluxo de cisalhamento. Esta técnica permite visualizar dinâmicas microbianas em gradientes de nutrientes.

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Gostaríamos de agradecer Microsystems Technology Laboratories no MIT por nos permitir filme parte deste vídeo na instalação de sala limpa.

Preparação 1. Crie uma Máscara <blockquote> Usando um software CAD, design do canal de alta resolução de impressão em uma transparência. Esta será a &quot;máscara&quot;. </blockquote> Na sala limpa: 2. Limpe e coza a bolacha Primeiro, o wafer esguicho com acetona, em seguida, rapidamente, com metanol, em seguida, com Isopropanol. Por fim, seque o wafer usando nitrogênio. Asse o wafer no forno (130 ° C) por 5 min. 3. Revestimento do wafer Coloque a bolacha no centro da máquina de spin-coating. Despeje fotorresiste (SU-8) da garrafa para o wafer. Permitir o fluxo de SU-8 e relaxar por ~ 10 s. Ligue o spin-coater e rampa a sua velocidade até 0-500 rpm por 5 s; manter a 500 rpm por 10 s; rampa até a velocidade final de mais de 10 s e manter a velocidade final de 30 s. A velocidade final depende da espessura do revestimento alvo e os SU-8 usada. Os detalhes podem ser encontrados em <a href="http://www.microchem.com/">http://www.microchem.com/</a> 4. Soft-bake Após o revestimento do wafer, cozê-lo primeiro em 65 ° C e depois a 95 ° C. O tempo de cozimento varia de acordo com a espessura alvo e tipo de fotorresiste utilizado. Então, deixe o wafer sentar-se à temperatura ambiente por pelo menos 5 min. 5. Exposição Colocar a máscara em cima do wafer e expor a hóstia à luz UV durante o tempo recomendado no manual do SU-8. 6. Pós-exposição bake Asse o wafer de 65 ° C e 95 ° C, em seguida, após o SU-8 manual de instruções. 7. Desenvolvimento do wafer para obter o &quot;master&quot; (molde) Prepare um copo cheio do desenvolvedor (PMMA). Mergulhar a bolacha no copo, enquanto muito gentilmente oscilando o copo até que a parte não exposta do fotorresiste é lavado. Em nosso laboratório: 8. Prepare PDMS e derramá-lo sobre o wafer Misture o PDMS com seu agente de cura em razão de 10:1 em um copo. Mexa e misture de forma homogênea: isso vai gerar muitas bolhas e fazer a mistura olhar opaco. Despeje a mistura sobre o &quot;mestre&quot;. 9. De-bolha no vácuo da câmara Para remover as bolhas, colocou a mistura mestre e PDMS que está cobrindo-o em uma câmara de vácuo até que todas as bolhas se foram. 10. Assando no forno Leve ao forno por, pelo menos, 12 horas em estufa a 65 ° C para endurecer o PDMS. 11. Furos Retire a PDMS do mestre e furos para entradas e saídas dos canais. Em salas limpas (não mostrado) 12. Plasma de ligação Canais são ligados a uma lâmina de vidro após o tratamento tanto a camada de PDMS e lâmina de vidro com plasma de oxigênio por 1 min. Experimentos: Exp # 1: Investigar a resposta quimiotática de micróbios marinhos para micro-escala camadas de nutrientes 1) Configurando o experimento <ol><li> Adicionar organismos e substratos para seringas de vidro </li><li> Lugar canal microfluídicos para o palco microscópio e anexar tubulação para entradas e saídas apropriadas </li><li> Conecte a tubulação de resíduos do reservatório. Certifique-se de tubulação é totalmente submersos no fluido no reservatório de resíduos para evitar oscilações de pressão </li><li> Seringas lugar em bomba de seringa e conecte-se válvulas e tubulação </li><li> Configurar microscópio: condições de iluminação, ampliação, etc </li><li> Concentre-se em posição apropriada no canal </li><li> De-bolha canal usando seringa maior cheia com água do mar artificial </li><li> Defina a taxa de fluxo apropriado em bomba de seringa. Neste caso, 2 ml / min, que corresponde a uma velocidade de fluxo médio de 220 ​​mm s -1 no canal </li></ol> 2) A execução do experimento <ol><li> Iniciar bomba de seringa para estabelecer um gradiente de nutrientes no canal </li><li> Quando o fluxo se estabilizou, e uma banda de nutrientes tem desenvolvido, interromper o fluxo da bomba de seringa e começar a gravar o tempo a partir deste ponto </li><li> Banda de nutrientes começa a se difundir lateralmente </li><li> Em intervalos regulares de tempo, use o software de análise de imagem para gravar sequências de frames para criar &quot;filmes&quot; </li><li> Discriminar os organismos de natação, tendo tempo de diferença entre duas imagens quadros subseqüentes, de modo que somente objetos em movimento agora são visualizadas, permitindo-nos diferenciar células móveis de não-movimento de partículas e de ruído de fundo </li><li> Fazer filmes para determinar posições de células do canal com referência ao pOSIÇÃO do patch de nutrientes </li><li> Gravar filmes em intervalos regulares por 10-20 min para analisar as posições e padrões de natação de organismos </li><li> Usando o software de análise de imagem para sobrepor as posições de organismos em diferentes quadros (atribuindo a cada pixel a intensidade de luz máxima registrada naquele pixel ao longo da duração do filme), podemos obter informações trajetória para as células de natação </li></ol> Exp # 2: Investigar os efeitos de cisalhamento em bactérias marinhas nadando em um vortexZ <ol><li> Usando a geometria canal diferente, podemos observar o comportamento das bactérias nadando em um vórtice em diferentes taxas de cisalhamento </li></ol>

<ol><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+structuring+of+marine+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).</li>
<li>Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+explicit+simulations+of+a+microbial+food+web.+%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Spatially explicit simulations of a microbial food web. </a> Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).</li>
<li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nutrient+patches+in+plankton+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282, 2254-2256 (1998).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).</li>
<li>Marcos,, Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+in+vortices%3A+a+microfluidic+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Microorganisms in vortices: a microfluidic setup.</a> Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).</li>
<li>Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+topology+on+bacterial+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of topology on bacterial social interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
</ol>

Uma compreensão de como micróbios marinhos interagem com seus química local e ambiente físico é imprescindível para uma percepção mais completa e precisa do papel de microorganismos planctônicos na nutrientes e carbono oceanos ciclos (Azam e Malfatti 2007). No entanto, devido à pequena escala (mm &lt;) sobre o qual muitas interações microbiana importante ter lugar, as limitações técnicas impediram exames detalhados do comportamento microbiano na paisagem bio-físico-químicas heterogêneas previsto para ser experimentado por micróbios nadar no...

<table><tbody><tr><td>PDMS, Sylgard 184</td><td>Kit de Elastômero de Silicone</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>http://www.ellsworth.com/sylgard.html</td></tr><tr><td>SU8-2100</td><td>Fotolito</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>www.microchem.com</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E microscópio invertido</td><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PEEK (0,762 mm de diâmetro interno, 1,59 mm de diâmetro externo)</td><td>Ferramenta</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>www.upchurch.com</td></tr><tr><td>Seringas (ponta Luer-Lok)</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conector Parte P-704-01</td><td>Ferramenta</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>Para conectar tubos a seringas com ponta Luer-Lok</td></tr><tr><td>Bomba de Seringa (PHD 2000 Programável)</td><td>Equipamento</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD (PCO 1600)</td><td>Equipamento</td><td>Cook</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

resposta quimiotática de microorganismos marinhos para micro-escala de camadas de nutrientes

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

O grau em que os micróbios podem explorar planktonic manchas de recursos microescala terá implicações consideráveis ​​para trophodynamics oceânicas e de fluxo biogeoquímicos. No entanto, para tirar proveito de patches de nutrientes no oceano, os micróbios natação deve superar as influências de forças físicas incluindo a difusão molecular e turbulenta de cisalhamento, o que limitará a disponibilidade de patches e a capacidade das bactérias para localizá-los. Até recentemente, as limitações metodológicas têm impedido exames direta do comportamento microbiano dentro de habitats irregular e condições realistas de pequena escala de fluxo. Assim, muito do nosso conhecimento atual em relação ao comportamento microbiano no oceano foi obtida a partir de previsões teóricas. Para obter novas informações sobre o comportamento de forrageamento microbiana no oceano temos aplicado suave técnicas de fabricação litográfica para desenvolver dois dispositivos microfluídicos, que temos usado para criar (i) micro nutrientes manchas com dimensões e características difusivos relevantes para processos oceânicos e (ii) microescala vórtices, com taxas de cisalhamento correspondente aos esperados no oceano. Estes dispositivos microfluídicos têm permitido um primeiro exame direto de natação microbiana e comportamento quimiotáticos dentro de um seascape heterogêneo e dinâmico. O uso combinado de epifluorescência e microscopia de contraste de fase permitem exames diretos das dimensões físicas e as características difusivo de patches de nutrientes, enquanto observa a resposta agregativa em nível de população, além do comportamento de natação de micróbios individuais. Esses experimentos revelaram que algumas espécies de fitoplâncton, bactérias heterotróficas e protistas phagotrophic são peritos em localizar e explorar difusão manchas de recursos microescala em prazos muito curtos. Também mostramos que até moderada taxas de cisalhamento, bactérias marinhas são capazes de lutar contra o fluxo e nadar através de seu ambiente de sua própria vontade. No entanto, além de um nível de cisalhamento alto limiar, bactérias estão alinhados no fluxo de cisalhamento e são menos capazes de nadar sem perturbação do fluxo. Microfluídica representa uma nova abordagem e barato para estudar a ecologia microbiana aquática, e devido a sua aptidão para a criação de campos de fluxo com precisão realista e gradientes de substrato em microescala, é idealmente aplicável aos exames de comportamento microbiana nas menores escalas de interação. Assim, sugerimos que a microfluídica representa uma valiosa ferramenta para a obtenção de uma melhor compreensão da ecologia de microrganismos no oceano.

A fabricação de canais microfluídicos ea sua aplicação em experimentos para estudar o comportamento de forrageamento quimiotática de micróbios marinhos de uma seascape irregular de nutrientes eo comportamento de natação de bactérias dentro do fluxo de cisalhamento são descritos.

Resposta quimiotática de microorganismos marinhos para Micro-Escala de Camadas de nutrientes

A medida em que os micróbios planctônicos conseguem explorar manchas de recursos em microescala terá implicações consideráveis para a trofodinâmica oceânica e ...

Olá, meu nome é Marcos. Estou trabalhando com o Professor Roman Stalker no Departamento de Engenharia Civil e Ambiental do MIT e vou mostrar a vocês como fabricar um microcanal utilizando a técnica de auto-fotografia. E para começar, precisamos projetar uma máscara.Então, esta é a máscara, que é basicamente o design final do microcanal que pretendemos criar. Este é o projeto de um injetor, com o qual podemos produzir uma camada fina de nutriente onde colocamos microrganismos nadando ao redor, e observamos como ocorre o quimiotaxismo. Este é um canal com uma cavidade lateral para gerar um microvórtice dentro da cavidade. Haverá um vídeo demonstrando isso posteriormente. Após obter a máscara, levamos as pastilhas até a sala limpa e as colocamos na placa de Petri. E agora vamos para a sala limpa.Ok, então, após termos a nossa máscara impressa e pronta, agora estamos na sala limpa para realizar as microfabricações propriamente ditas. E o que vou fazer agora é pegar um pedaço da pastilha limpa que acabei de adquirir e quero apenas garantir que ela esteja extra limpa utilizando os seguintes três solventes. O primeiro passo é limpar com acetona e, em seguida, imediatamente com metanol.E então o passo final é o isopropanol. E estamos trabalhando no lado brilhante da pastilha, que está preparado para o revestimento. E agora vou secá-la usando nitrogênio.Após secar a pastilha, agora colocamos a pastilha dentro de um forno a cerca de 130 Celsius e a aquecemos por cinco a dez minutos. Enquanto isso, enquanto aguardamos o aquecimento da pastilha, podemos preparar as duas placas aquecedoras, uma a 175 Celsius e a outra a 195 Celsius. Após o aquecimento por cinco minutos, retiramos a pastilha do forno e a deixamos repousar à temperatura ambiente por cerca de cinco minutos.Em seguida, estamos prontos para a deposição por centrifugação. Antes de despejar o fotoresiste, precisamos garantir que não haja partículas de poeira sobre ele; usamos nitrogênio para borrifar sobre a superfície da pastilha. O movimento de pulverização é feito do centro para fora.Agora vou despejar o fotoresiste sobre esta pastilha. Despejamos uma quantidade de cerca de três mililitros. Tente manter o frasco o mais baixo possível para que não se formem bolhas ao despejar o fotoresiste sobre a pastilha.Agora, deixe o fotoresiste repousar sobre a pastilha por cerca de um minuto antes de iniciarmos a centrifugação. E, como mencionei, vou fazer um revestimento com espessura de cem mícrons. Portanto, configuramos o tempo total de centrifugação para 55 segundos e podemos começar a girar.Primeiramente, tentamos aumentar a velocidade de rotação de zero a 500 RPM em cinco segundos e mantemos a rotação por cerca de 10 segundos, de modo que você possa observar que o fotoresiste está cobrindo toda a pastilha; em seguida, aumentamos para 3000 RPM por cerca de sete segundos e mantemos a rotação por 30 segundos. Após revestir a pastilha com o fotoresiste, agora coloco a pastilha sobre a placa aquecedora e realizo uma pré-secagem a 65 graus Celsius por cinco minutos e a 95 graus Celsius por 20 minutos. Após a conclusão da pré-secagem a 95 graus Celsius, resfriamos até a temperatura ambiente, mas antes disso, resfriamos novamente a 65 graus Celsius por cerca de dois a três minutos, para que não ocorra uma diminuição rápida da temperatura.Em seguida, deixamos em temperatura ambiente para esfriar por cerca de cinco minutos. Agora, vou expor o material à luz UV, de modo que a parte exposta seja endurecida e a parte não exposta seja removida posteriormente. Esta é a etapa em que utilizamos a máscara, e como é possível observar, a máscara possui duas partes: uma parte transparente e outra parte completamente opaca ou preta nesta configuração.Então, vou colocar essa máscara sobre a pastilha revestida. A máscara que você recebe da empresa de impressão tem dois lados. Um é o lado onde eles imprimem com a tinta.E este é um local que você deseja colocar em contato com a pastilha. Agora vou expor a pastilha através da máscara com luz UV. E por motivos de segurança, vou usar estes óculos de proteção.A quantidade do tempo de exposição depende da SUA que você está utilizando e também da espessura que está tentando obter. Agora, após a exposição, coloco a pastilha em uma placa quente a 65 graus e a aqueço novamente por cinco minutos, seguido por 95 graus Celsius por 20 minutos. E apenas para lembrar, esse tempo de aquecimento varia conforme a espessura desejada e também de acordo com o tipo de processo que você está utilizando.A partir deste ponto, vamos desenvolver a pastilha. Desenvolver significa remover a parte indesejada da resina fotossensível, de modo que apenas a região exposta permaneça na pastilha. Para desenvolver a pastilha e remover a parte indesejada da resina fotossensível, utilizamos o revelador.Neste caso, estou utilizando acetato de pomonal como revelador e vou despejar este solvente neste béquer, colocar a pastilha e imergi-la no béquer por cerca de 10 minutos. Novamente, o tempo varia conforme a espessura e o solvente que você estiver usando. Agora, após 10 minutos, é possível observar que o que restou nesta pastilha é o desenho do canal desejado, e toda a parte indesejada foi removida, bastando apenas enxaguá-la.Utilizamos o mesmo solvente, um novo, o mesmo acetato de polivinila e apenas aplicamos na superfície da pastilha para enxaguá-la. E, por fim, para remover o solvente, utilizamos isopropanol e enxaguamos novamente. Agora, secamos com jato de nitrogênio.E agora você tem uma pastilha limpa com o padrão desejado nela. E chamamos isso de molde mestre. Agora estamos voltando ao nosso laboratório para despejar PDMS sobre ele e continuar o restante do procedimento.Agora voltamos da sala limpa e temos o molde mestre, que é basicamente o modelo para o molde que utilizaremos. O próximo passo é despejar PDMS, que é um polímero, e deixá-lo curar. Como é possível observar, ao despejar um polímero sobre este molde, o polímero apresentará ranhuras e, eventualmente, ao ser ligado a um vidro, o próprio polímero formará o canal.Agora vamos preparar o PDMS. Este é o PDMS, que é o polímero, o poli(dimetilsiloxano) PDMS. E este é o agente de cura.O que vou fazer é despejar este agente de cura neste copo e despejar este PDMS neste copo e misturá-los numa proporção de um para 10. Assim, geralmente queremos usar um palito para misturar de forma homogênea. Ao misturar, geramos muitas bolhas, e as bolhas são uma espécie de indicador para nos dizer se já misturamos ou não.Agora, após misturar o PDMS com o agente de cura, estamos prontos para despejar essa mistura sobre o molde-mestre, que é uma pastilha. E apenas para garantir que a pastilha não se mova durante o despejo, fixamos a pastilha com uma fita adesiva. Antes de despejar a mistura de PDMS sobre a pastilha, devemos tentar deixar a superfície da pastilha o mais limpa possível da poeira que possa ter se depositado sobre ela.Então ligamos o compressor para remover a poeira da pastilha. Ok, você pode ver que o PDMS tem muitas bolhas. Vamos remover as bolhas colocando isso dentro de uma câmara de vácuo.Portanto, a sucção demora aproximadamente 30 minutos para remover todas as bolhas. E, uma vez concluída a remoção das bolhas, retiramos isso e colocamos no forno a 65 graus Celsius, deixando assar por pelo menos 12 horas. E, após essas 12 horas, teremos a pastilha pronta para o corte.Vou usar esta faca para cortar o PDMS e remover o PDMS da pastilha e, em seguida, usarei este furador para abrir o orifício das entradas e saídas da tubulação. Ao cortar, você deve colocar sua faca até que ela atinja a pastilha, mas não aplique muita pressão para não quebrar a pastilha; corte ao redor do seu canal. Agora, retire-o.Você tem, então agora você pode ver que este é o canal, que é o padrão proveniente da wafer. Assim, você pode ver que são iguais. E agora este padrão foi gravado neste polímero, este PDMS.E uma vez que eles ligam isso a um vidro, isso será o canal para o nosso experimento. O próximo passo, que é importante, é lembrar de furar orifícios para que possamos inserir entradas e saídas nos microcanais após fazer os furos nos microcanais na PDMS. Por isso, usamos fita adesiva para cobrir o lado do canal, ou seja, onde está o sulco, e fixá-lo.E a razão pela qual estamos colando esta camada com fita adesiva é remover todas as partículas de poeira. Portanto, o próximo passo é a ligação por plasma. E antes da ligação por plasma, que faremos em outro laboratório, vamos remover a fita e expor a superfície que desejamos ligar, ou seja, esta superfície e a lâmina de vidro juntas, e então expô-las ao plasma de oxigênio; posteriormente, unimos as partes e elas se ligarão.Olá, meu nome é Justin Seymour e sou pesquisador pós-doutorando no laboratório de Roman Stocker no MIT. Minha pesquisa concentra-se na ecologia microbiana, mais especificamente em como os microrganismos marinhos conseguem encontrar manchas de alimento no oceano. E estamos utilizando técnicas de microfluídica para analisar esses tipos de padrões.Portanto, vamos utilizar o canal cuja produção foi demonstrada anteriormente por Marcus e após a ligação por plasma. Em seguida, estamos livres para utilizá-lo em um experimento de microfluídica. Antes deste experimento, precisamos preparar os substratos que serão utilizados no experimento.E no experimento de hoje, vamos analisar como o fitoplâncton marinho *Donella tur electro* é capaz de localizar manchas de alimento em escala microscópica. Neste caso, o alimento é o amônio, e vamos fornecer a ele uma concentração de cem micromolares de amônio. Assim, nesses experimentos, somos capazes de visualizar as manchas de alimento adicionando um corante fluorescente aos nutrientes que fornecemos a eles.Então, usamos o corante fluoresceína. Aqui, estou pipetando fluoresceína numa concentração final de 100 micromolar no amônio, que utilizamos como nutriente. Em seguida, podemos visualizar esse nutriente por microscopia de fluorescência, o que nos permite observar como uma mancha de nutrientes se difunde e analisar a resposta de organismos a essa mancha de nutrientes.Assim, nos experimentos de microfluídica, utilizamos seringas de vidro. Portanto, a primeira coisa que queremos fazer é adicionar nossos substratos e organismos às seringas que vamos usar. O próximo passo é inserir a tubulação na configuração microfluídica.E fazemos isso sobre a platina do microscópio. Assim, colocamos nosso canal de microfluídica sobre a platina do microscópio e, em seguida, inserimos tubos nos inlets e outlets. Depois, inserimos um reservatório de resíduos e garantimos que o reservatório esteja preenchido até a metade com fluido, de modo que os tubos no reservatório de resíduos fiquem completamente submersos.Isso nos permite manter uma pressão constante dentro do canal. Em seguida, conectamos seringas à tubulação que alimenta o canal de microfluídica contendo os organismos, que neste caso são donella, lector, e o substrato nutricional, que neste caso é o amônio. Em seguida, preparamos o microscópio e observamos o canal de microfluídica na posição apropriada antes de iniciarmos os experimentos.Uma vez que o canal está posicionado, alternamos para visualizar o canal com a câmera e podemos observá-lo no computador. Agora podemos realizar ajustes mais finos com o foco e podemos visualizar o injetor pelo qual injetamos nutrientes. Este injetor consiste em uma ponta de agulha com fio de 100 micrômetros integrada ao canal de microfluídica.E podemos produzir um gradiente de nutrientes injetando-os. A partir deste ponto, antes de iniciar os experimentos, precisamos remover quaisquer bolhas que possam ter entrado no sistema de microfluídica. Fazemos isso utilizando uma seringa cheia de água do mar artificial neste caso, que podemos conectar ao canal de microfluídica por meio de uma válvula.Em seguida, empurramos esta seringa para remover bolhas do canal. Podemos remover as bolhas de duas maneiras: forçando sua saída pela pressão gerada pela seringa, através da saída, ou também forçando-as através das paredes do material PDMS, que é permeável a gases. Uma vez removidas as bolhas e estando prontos para iniciar o experimento, ajustamos as vazões apropriadas para a injeção e os materiais no canal utilizando uma bomba de seringa.Neste caso, utilizamos uma taxa de fluxo de dois microlitros por minuto, o que equivale a uma velocidade de fluxo no canal de 266 micrômetros por segundo. Após ajustar a taxa de fluxo apropriada, podemos iniciar o experimento começando, iniciando o fluxo, o que cria uma faixa fina de nutrientes. Assim, podemos visualizar os nutrientes à medida que são injetados no canal a partir do ponto de injeção, adicionando corante fluoresceína aos nutrientes e visualizando-os por microscopia de fluorescência APF; em seguida, podemos analisar a dinâmica dos fragmentos interrompendo o fluxo no canal de microfluídica e observando a difusão lateral da faixa de nutrientes a partir de sua posição original.Em seguida, mudamos para microscopia de contraste de fase para visualizar os organismos nadando dentro do canal e observar suas posições em relação ao gradiente de nutrientes. Isso é possível ao capturar uma sequência de quadros com uma taxa de quadros de 10 por segundo, o que gera um vídeo no qual podemos visualizar esses organismos. Podemos então visualizar os organismos em movimento ao calcular as diferenças temporais entre dois quadros individuais, nos quais um quadro é subtraído do anterior, de modo que apenas os objetos em movimento sejam visualizados.Assim, podemos remover o ruído de fundo das imagens. Em seguida, gravamos filmes em intervalos regulares durante 10 a 20 minutos após a liberação inicial do gradiente de nutrientes. E, utilizando um software de análise de imagem para sobrepor as posições dos organismos de um quadro para outro na sequência, podemos analisar as alterações na posição desses organismos para obter informações sobre suas trajetórias de natação, a partir das quais podemos extrair dados mais detalhados sobre suas estatísticas de natação, incluindo velocidades e mudanças de direção.Esses experimentos permitiram-nos, pela primeira vez, examinar diretamente como os micróbios marinhos são capazes de localizar e aproveitar manchas microscópicas de nutrientes. Isso pode ter implicações importantes para a dinâmica trófica e o ciclo de nutrientes no oceano. Assim, complementando o que Justin mencionou, a forma como os micro-organismos, especialmente as bactérias, interagem com seu alimento no oceano pode ter diversos efeitos sobre os ciclos bioquímicos.No entanto, o oceano é muito dinâmico, e essas condições não são abordadas, existindo muitos fluxos, como a turbulência gerada pelo vento ou na superfície. Na escala de microrganismos, o que eles sentem, o que experimentam, não é exatamente a grande turbulência, mas sim o cisalhamento, e os menores resquícios de turbulência são conhecidos como vórtices de Kolmogorov. O que estamos tentando fazer aqui é entender como, o que queremos estudar, quais são os efeitos desses vórtices no comportamento de agregação de microrganismos.E para fazer isso, estamos criando outro canal usando essa massa que mostrei a você anteriormente. E há uma cavidade no centro. Deixe-me apenas desenhá-la para ampliar o diagrama.Então é assim que o canal se parece: temos aqui a vista que vemos de cima, e injetamos o fluxo da esquerda para a direita; devido ao cisalhamento, forma-se uma região de recirculação dentro dessa cavidade. E essa cavidade representa uma grafia de Addis. Podemos usar exatamente a mesma configuração que Justin já explicou anteriormente: quando a bomba de seringa está desligada e eu não ligo nenhum fluxo, é possível observar que as bactérias nadam de maneira bastante aleatória e ativa dentro dessa cavidade.E não há uma orientação preferencial. E o filme que você está vendo é um filme de diferença temporal, que é exatamente a mesma técnica que Justin está usando. Assim, quando o fluxo é muito rápido, como você pode ver, as bactérias estão sendo deslocadas pelo vórtice.E a trajetória das próprias bactérias segue a linha de corrente do vórtice. E o que é na verdade mais interessante é o seguinte, quando ligamos a bomba de seringa. Mas a velocidade não é tão alta.Não é tão rápido que as bactérias não consigam combatê-lo. Mas, de certa forma, ainda é possível ver claramente uma semelhança com um vórtice neste vídeo. Assim, com este experimento, aprendemos que, na presença de um fluxo muito forte e turbulento, as bactérias estão à mercê do fluxo e não conseguem combatê-lo.No entanto, em uma região de turbulência leve, eles ainda são capazes de nadar por conta própria.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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É apresentado um protocolo para a geração de paisagens químicas dinâmicas por fotolise dentro de configurações microfluidas e milfluidas. Essa metodologia é adequada para estudar diversos processos biológicos, incluindo o comportamento motil, a absorção de nutrientes ou adaptação a produtos químicos de microrganismos, tanto no nível celular quanto populacional.

Gerando paisagens químicas controladas e dinâmicas para estudar comportamento microbiano

Apresentado aqui está o protocolo para um ensaio in situ chemotaxis, um dispositivo microfluido recentemente desenvolvido que permite estudos de comportamento microbiano diretamente no ambiente.

In Situ Chemotaxis Assay para examinar o comportamento microbiano em ecossistemas aquáticos

Apresentamos um protocolo para o dispositivo de cultura contínua milifluida (MCCD), que permite o cultivo de populações bacterianas sob condições constantes de baixo teor de nutrientes (até centenas de concentrações nanomolares) ou flutuações temporais de nutrientes em uma escala de tempo minuciosa.

Um dispositivo milifluido contínuo para cultura para o estudo de Escherichia coli sob condições nutritivas baixas e flutuantes

Jared Leadbetter nos leva para um passeio pela natureza através da diversidade de vida residentes no intestino grosso de cupim - um microambiente contendo 250 espécies diferentes encontradas em nenhum outro lugar na Terra. Jared revela que a simbiose exibida por este sistema é multi-camadas e envolve não apenas uma relação entre os cupins e seus habitantes intestino, mas também envolve uma complexa rede de simbiose entre os micróbios do intestino si.

Camadas de Simbiose - Visualizando a térmita comunidade microbiana do intestino posterior

Micro-escala de Engenharia de Biologia Celular

Nós apresentamos um método para gerar cDNA de mRNA ambiental. Em geral, o total de RNA é a primeira coletados do ambiente, rRNA é seletivamente removido, mRNA é seletivamente amplificado, e cDNA sintetizado a partir do pool de mRNA enriquecido é seqüenciado. Seqüências recuperadas podem ser anotados usando técnicas padrão de bioinformática para identificar os genes expressos.

Analisando Expressão Gênica de comunidades microbianas Marinha usando transcriptômica Ambiental

Aprenda a fabricar canais microfluídicos para estudar a quimiotaxia de microrganismos marinhos e o comportamento de natação bacteriana em fluxo de cisalhamento. Esta técnica permite visualizar dinâmicas microbianas em gradientes de nutrientes.

Resposta quimiotática de microorganismos marinhos para Micro-Escala de Camadas de nutrientes

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