Modelos experimentais para estudo da fisiologia epitélio pigmentar da retina e Fisiopatologia

O objetivo geral deste procedimento é gerar culturas de pigmento retiniano fetal humano, epitélio ou RPE, que possam ser usadas como modelo. Em investigações de doenças oculares humanas, os tecidos são recebidos de doadores na forma de globos oculares intactos. O primeiro passo do procedimento é remover o músculo e o tecido conjuntivo excedentes e, em seguida, abrir o olho removendo a córnea e o cristalino.

O olho é tratado com dispa e achatado, e então a monocamada de EPR é destacada da coroide. O EPR dissecado é semeado em frascos e cultivado por várias semanas até atingir monocamadas confluente e desenvolver pigmento. As culturas celulares são utilizadas em experimentos funcionais in vitro.

Experimentos bem-sucedidos in vitro são repetidos em modelos animais de ensaios pré-clínicos, onde as respostas do epitélio pigmentado da retina (RPE) podem ser melhor avaliadas em ambientes de sinalização mais complexos. O modelo demonstrado aqui contribuirá para uma melhor compreensão da fisiologia do RPE e para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas no tratamento de doenças oculares. Olá, meu nome é Sheldon Miller.

Meu laboratório está localizado no Instituto Nacional de Olhos, que faz parte dos Institutos Nacionais de Saúde no campus de Bethesda, Maryland. Olá, eu sou Arki do Laboratório Miller. Hoje vamos mostrar um procedimento para o preparo de culturas primárias de células epiteliais pigmentares da retina fetal humana.

Essas células serão preparadas como monocamadas confluentes que podem ser montadas em câmaras de Ussing modificadas. Também utilizaremos essas células de RPE humanas isoladas para estudos em bioquímica e genética. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estabelecer culturas primárias de células epiteliais, com o objetivo de estudar a função e regulação de processos fisiológicos e patofisiológicos, além de desenvolver modelos animais clínicos de doenças.

Concentramos-nos no epitélio pigmentado da retina ou RPE, que se localiza na parte posterior do olho, separando a retina neural e o suprimento sanguíneo coroidal. Este diagrama esquemático do olho mostra a localização da lâmina de RPE na parte posterior do olho, logo adjacente aos fotorreceptores. O inseto mostra as células da retina com os fotorreceptores à direita e as células ganglionares à esquerda.

Esse epitélio é metabolicamente extremamente ativo. Ele realiza fagocitose dos fotorreceptores continuamente em uma base diurna e armazena, modifica e transporta o pigmento visual vitamina A até os fotorreceptores. No ciclo visual, atua de maneira homeostática para manter a composição química e o volume dos espaços extracelulares circundantes.

Uma propriedade crítica dos epitélios é sua polaridade. A entrega contínua e assimétrica de proteínas às membranas apicais e basolaterais é um processo regulado que permite ao epitélio realizar o tráfego vetorial de metabólitos, íons e fluidos de um espaço extracelular para outro. Essa atividade ajuda o epitélio a manter a saúde e a integridade da retina neural.

O preparo in vitro que descrevemos aqui permite a análise de proteínas de transporte, receptores e vias de sinalização que determinam a polaridade e a função epiteliais antes do início da dissecação. Prepare uma placa de 12 poços em uma cabine de fluxo laminar com soluções à temperatura ambiente. Cada olho requer um poço de solução antibiótica antimicótica 10x, dois poços de XPBS e um poço de duas unidades por mililitro de espaço discal diluído em meio RPE 5% com soro. Encha um recipiente de dissecação forrado com silicone com X-H-B-S-S, drene o líquido e transfira cada olho para um poço de solução antibiótica antimicótica.

Incube por três a cinco minutos à temperatura ambiente. Evite aplicar qualquer pressão excessiva sobre o globo ocular. Lave o olho em dois poços sucessivos de um XPBS para remover o antibiótico em excesso.

Em seguida, utilize pinças para transferi-lo para a placa de dissecação contendo um X-H-B-S-S sob um microscópio estereoscópio de dissecação. Use tesoura de íris para remover o músculo e o tecido conjuntivo em excesso ao redor do olho. Alinhe o olho de modo que a córnea fique voltada para cima.

Use duas agulhas estéreis de 27 graus para fixar o olho pelo tecido conjuntivo sem danificar a esclera ao suporte de silicone. Nessa orientação, utilize uma lâmina de incisão lateral para fazer um corte através da esclera. O corte deve estar a um terço da distância entre o equador do olho e a superfície anterior.

Use tesoura de íris para continuar o corte circularmente ao redor do olho, evitando danos ao epitélio pigmentado da retina, abreviado como RPE, devido à atração da retina pelo vítreo. Use a mesma tesoura para cortar através do corpo vítreo, separando a aba anterior do olho da cúpula ocular.

Levante a porção anterior do IOA e descarte-a. Use uma pinça para transferir o olho aberto para o poço do dissecador. Certifique-se de que não haja bolhas de ar no copo do olho.

Incube por 40 a 60 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Transfira o olho do recipiente de dissecação de volta para a placa de dissecação, que foi preenchida com solução X-H-B-S-S fresca na temperatura ambiente. Posicione o olho com a cúpula voltada para cima e fixe-o com duas agulhas de calibre 27.

Sob o microscópio estereoscópico, use pinças finas para levantar suavemente a retina parcialmente separada com tesoura de retina. Corte a retina do nervo óptico. Descarte a retina com a tesoura de íris.

Realize uma incisão da periferia do olho até o nervo óptico. Fixe o olho com 5 agulhas de calibre 27. Para esticar a camada de epitélio pigmentado da retina (RPE), use tesoura retiniana para fazer um corte circular ao redor do nervo óptico.

Separar a camada de EPR alternando para uma ampliação de 250x ou mais. Localize a borda da lâmina de EPR ao longo do corte feito pelas tesouras de íris e próxima ao nervo óptico. Utilize dois pares de pinças para separar a EPR e a membrana de Bruch da camada de tecido coroidal.

Teste várias áreas ao longo da borda cortada para identificar onde a ligação entre o epitélio pigmentado da retina (RPE) e a coroide é mais fraca. Remova cuidadosamente a membrana puxando-a para trás, garantindo sua remoção completa. Coloque as lâminas de RPE em um tubo cônico de 15 mililitros contendo trips à temperatura ambiente em EDTA.

Quando todas as lâminas forem coletadas, tampe o tubo, incube os tubos em banho-maria por 10 minutos a 37 graus Celsius. Agite o tubo vigorosamente para separar o epitélio pigmentado da retina (RPE) em pequenos aglomerados. A ausência de agregados celulares escuros indica que a separação está completa.

Retorne o tubo ao banho-maria por mais cinco minutos. Use uma pipeta Pasteur, uma pipeta e sucção suave para remover quaisquer resíduos de tecido não digeridos. Centrifugue as células em uma centrífuga a 280 ×g por quatro minutos.

Remova o sobrenadante. Ajuste o volume final para nove mililitros com meio RPE 15% utilizando uma pipeta para ressuspender. Transfira três mililitros da suspensão celular para um frasco de 25 centímetros quadrados utilizando uma pipeta.

Adicione dois mililitros de meio de cultura RPE 15% fresco à temperatura ambiente. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Conforme os cultivos amadurecem, sua pigmentação aumentará após três a quatro semanas.

Culturas bem-sucedidas serão confluentes e uniformemente pigmentadas, com intensa coloração. Acabamos de mostrar como preparar culturas primárias de RP fetal humano. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.