Ensaio de formação de esferas: um método in vitro para identificar células-tronco de câncer de pâncreas e terapias de triagem

- O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) contém um subconjunto de células-tronco cancerígenas (CSC) exclusivamente tumorigênicas. As CSCs são auto-renováveis, pluripotentes e capazes de formar tumores. Eles expressam proteínas antiapoptóticas e também contêm genes multirresistentes, tornando-os resistentes à quimioterapia. Para identificar células-tronco cancerígenas e estudar o efeito de drogas sobre elas, realizamos um ensaio de formação de esferas.

Primeiro, suspenda as células-tronco cancerígenas extraídas no meio de cultura de células desejado. Em seguida, semeie a suspensão celular em uma placa de vários poços e incube pela duração desejada. Adicione uma quantidade necessária de medicamento de interesse em alguns poços e placebo em outros poços como controle negativo. Incube as células pela duração desejada. As células-tronco cancerígenas formam colônias em forma de esfera sob um ambiente de cultura não aderente.

Após a incubação, pipete uma pequena quantidade de suspensão celular em um hemocitômetro e coloque-a em um contador de células automatizado. Agora, conte o número de esferas formadas. As células tratadas com drogas geralmente mostram uma redução substancial no tamanho e no número de esferas. No protocolo a seguir, realizaremos um ensaio de formação de esferas para identificar células-tronco de câncer de pâncreas e avaliar o efeito da metformina.

- Para facilitar a formação da esfera tumoral para o enriquecimento das células-tronco cancerígenas, dilua as células no volume apropriado do meio de células-tronco cancerígenas até uma concentração final de 2 vezes 10 elevado a 3 células por mililitro e resfrie-as no gelo por alguns minutos. Em seguida, depois de adicionar 500 microlitros de PBS à primeira e à última fileiras de uma placa de células de fixação ultrabaixa de 24, ressuspenda as células por pipeta e semeie 1 mililitro de células por poço nos poços vazios da placa.

Trate quatro poços de células com a droga de interesse e pelo menos quatro poços de controle negativo com veículo. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma semana. A cada dois dias, adicione um novo tratamento ou veículo a cada um dos poços.

No dia 5 ou 7, avalie o número de esferas tumorais formadas com um contador de células automatizado que permita a identificação de estruturas maiores. Para a passagem em série das esferas tumorais, no dia 7, use um filtro de células de 40 micrômetros para colher as esferas. Em seguida, gire as esferas e incube-as em 1 mililitro de tripsina por 20 minutos a 37 graus Celsius para dissociar o pellet em uma suspensão unicelular. Em seguida, expanda as células por mais sete dias, como acabamos de demonstrar.