Método de gota suspensa: uma técnica para gerar esferoides de melanoma 3D

- Os esferoides são modelos tridimensionais de cultura de células in vitro que imitam a arquitetura tumoral in vivo e ajudam a estudar as interações intratumorais. Para configurar a cultura, primeiro prepare uma suspensão unicelular de células de melanoma em seu meio apropriado. Em seguida, coloque pequenos volumes dessa suspensão celular, suficientemente separados na superfície interna da tampa de uma placa de cultura estéril e não adesiva. Inverta cuidadosamente a tampa e coloque-a na base da placa de cultura contendo PBS para criar uma câmara de hidratação. Incubar a placa em condições adequadas.

A umidade do PBS evita a evaporação da mídia das gotas suspensas. Refresque as gotas substituindo alguns microlitros de mídia. Devido à tensão superficial, as gotículas mantêm sua forma esférica e permanecem suspensas na superfície interna da placa. As forças gravitacionais facilitam que as células permaneçam em suspensão sem se espalhar, mas se agregam para formar esferóides tridimensionais dentro das gotículas. Por fim, enxágue as gotículas com PBS para colher os esferoides. Colete-os em uma placa de cultura não adesiva.

No protocolo a seguir, demonstraremos a geração de esferoides tridimensionais de células de melanoma 451-LU por meio do método de gota suspensa.

- Para começar, cultive células de melanoma 451-LU usando meio RPMI contendo 10% de FCS, de acordo com os protocolos gerais de cultura de células. Para gerar esferóides de melanoma, lave as células de melanoma cultivadas em PBS. Em seguida, adicione 5 mililitros de 1x Tripsina-EDTA em PBS. Incube por 3 a 5 minutos em temperatura ambiente. Adicione 5 mililitros de RPMI contendo 10% de FCS para neutralizar a tripsina. Em seguida, transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga. Centrifugue a 200 x g por 5 minutos para colher as células. Ressuspenda o pellet celular em RPMI contendo 10% FCS.

Em seguida, conte as células e dilua a suspensão celular até uma concentração final de 10.000 células por mililitro. Use uma multipipeta eletrônica para fazer pontos de 40 x 25 microlitros de suspensão de células na superfície interna da tampa de uma placa de cultura de células estéril e não adesiva de 10 centímetros.

Em seguida, vire a tampa com um movimento rápido e suave e coloque-a na placa de cultura de células contendo 5 mililitros de PBS. Cultive os pratos suspensos a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 10 a 14 dias.

Cinco dias após a detecção inicial da gota, use um dispensador eletrônico para adicionar 10 microlitros de RPMI contendo 10% de FCS a cada gota. Após 10 a 15 dias, colha os esferóides enxaguando-os suavemente da tampa com PBS. Recolher os esferoides numa placa de cultura de células fresca e não adesiva.