HCR-DNA FISH: Uma técnica de hibridização in situ de fluorescência para detectar DNA viral em células infectadas

- HCR-FISH, ou reação em cadeia de hibridização-hibridização in situ fluorescência, detecta sequências de ácidos nucleicos virais dentro do genoma de células infectadas por vírus. Para começar, fixe uma cultura aderente de células infectadas por vírus e permeie sua membrana celular. Incube as células com um tampão de hibridização para reduzir qualquer sinal de fundo. Trate as células com sondas iniciadoras carregando uma sequência iniciadora de HCR e uma sequência complementar direcionada ao DNA viral. Aqueça a amostra para desnaturar o DNA de fita dupla do hospedeiro para DNA de fita simples. Incube a amostra para permitir que a sonda se ligue à sua sequência de DNA viral alvo complementar.

Em seguida, trate com um tampão de amplificação contendo dois conjuntos de sondas de grampo de oligonucleotídeos marcados com fluorescência, H1 e H2. Incubar para facilitar a reação em cadeia de hibridização. A sequência iniciadora não emparelhada se liga à sua cauda H1 complementar, linearizando a estrutura do gancho de cabelo. A sequência H1 exposta se liga de forma semelhante à sua cauda H2 complementar. O H2 à direita continua a se ligar a uma cauda H1. Dessa forma, as sondas marcadas com f