Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 6:00 min. • April 30th, 2023
- HCR-FISH, ou reação em cadeia de hibridização-hibridização in situ fluorescência, detecta sequências de ácidos nucleicos virais dentro do genoma de células infectadas por vírus. Para começar, fixe uma cultura aderente de células infectadas por vírus e permeie sua membrana celular. Incube as células com um tampão de hibridização para reduzir qualquer sinal de fundo. Trate as células com sondas iniciadoras carregando uma sequência iniciadora de HCR e uma sequência complementar direcionada ao DNA viral. Aqueça a amostra para desnaturar o DNA de fita dupla do hospedeiro para DNA de fita simples. Incube a amostra para permitir que a sonda se ligue à sua sequência de DNA viral alvo complementar.
Em seguida, trate com um tampão de amplificação contendo dois conjuntos de sondas de grampo de oligonucleotídeos marcados com fluorescência, H1 e H2. Incubar para facilitar a reação em cadeia de hibridização. A sequência iniciadora não emparelhada se liga à sua cauda H1 complementar, linearizando a estrutura do gancho de cabelo. A sequência H1 exposta se liga de forma semelhante à sua cauda H2 complementar. O H2 à direita continua a se ligar a uma cauda H1. Dessa forma, as sondas marcadas com fluorescência se amplificam ao redor do local alvo, emitindo um sinal forte. Trate a amostra com DAPI para corar os núcleos das células.
Use um microscópio de fluorescência para detectar a fluorescência brilhante dos focos de replicação dentro dos núcleos das células infectadas. No protocolo a seguir, mostraremos in situ HCR-DNA FISH para detectar o genoma do poliomavírus de células de Merkel em células primárias infectadas da pele humana.
- Primeiro, fixe as células em lamínulas com 4% de PFA em PBS por 10 minutos. Em seguida, lave as lamínulas duas vezes com PBS e trate-as com etanol a 70% a 4 graus Celsius durante a noite para permeabilizar as células. No dia seguinte, substitua o etanol por tampão de hidratação da sonda e incube em temperatura ambiente por 60 minutos para pré-hibridizar as amostras. 30 minutos antes do final da incubação de pré-hibridização, diluir as sondas em solução de hibridização de sonda a uma diluição de 1:500 e incubar a 45 graus Celsius.
Quando as incubações estiverem concluídas, pipetar aproximadamente 10 microlitros da mistura de sonda diluída em uma lâmina de microscópio para cada lamínula. Coloque cada lamínula, com o lado da célula voltado para baixo, em sua respectiva gota de mistura de hibridização. Usando uma quantidade generosa de cimento de borracha, sele as bordas e a parte de trás de cada lamínula em sua corrediça. Coloque as lâminas no lado plano de um bloco de calor e aqueça-as a 94 graus Celsius por 3 minutos. Depois disso, transfira as lâminas para uma câmara umidificada e incube-as a 45 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, use uma pinça para retirar cuidadosamente o cimento de borracha. Coloque as lamínulas, com a célula voltada para cima, nos poços de uma placa de 24 poços e lave-as com tampão de lavagem da sonda três vezes em temperatura ambiente. Adicione 200 microlitros de tampão de amplificação a cada poço contendo uma lamínula e incube em temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Enquanto isso, recoza cada um dos dois grampos de cabelo de oligonucleotídeos marcados, reconhecendo as sondas em tubos de PCR separados, aquecendo-os a 95 graus Celsius por 90 segundos e depois resfriando-os à temperatura ambiente por 30 minutos. Misture os grampos de cabelo em tampão de amplificação em uma diluição de 1:50.
Em seguida, estique o filme de parafina sobre a face aberta de uma tampa de placa de 12 poços para criar uma superfície para a reação de amplificação. Pipete gotículas de 50 a 100 microlitros da mistura de grampos de cabelo no filme de parafina para cada lamínula. Usando uma pinça, remova cuidadosamente cada lamínula da solução de pré-amplificação e toque a borda em um lenço poroso e descartável para secar. Coloque cada lamínula seca, com a célula voltada para baixo, em uma gota de amplificação. Transfira a tampa da placa para uma câmara umidificada e incube durante a noite em temperatura ambiente e no escuro.
No dia seguinte, devolva as lamínulas aos poços da placa de 24 poços. Adicione 5x DAPI contendo SSCT a uma concentração de 0,5 microgramas por mililitro a cada poço e incube em temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, lave as amostras duas vezes com 5x SSCT em temperatura ambiente. Monte as lamínulas lavadas nas lâminas do microscópio e use um microscópio de fluorescência invertida para analisar as células e obter imagens das amostras.